0 引言

肝癌是世界上第六大常见恶性肿瘤，其中一半以上病例在我国^[1]，每年约有38.3万人死于肝癌，约占全球肝癌死亡病例数的51%^[2]。随着分子生物学技术的快速发展，基因治疗被认为是未来肿瘤治疗的希望。腺病毒因具有宿主范围广、无致癌性、病毒颗粒稳定、易于纯化、载体容量大等优势，而成为临床治疗中的首选。白细胞介素24最初发现于黑色素瘤细胞内，能够抑制肿瘤细胞增殖并促进其向终末细胞分化^[3]，研究已经证明IL24能抑制黑色素瘤^[4-5]、前列腺癌^[6]、肝癌^[7]、卵巢癌^[8]、乳腺癌^[9]、肺癌^[10-11]、白血病^[12-13]等多种肿瘤细胞的生长，并诱导肿瘤细胞凋亡。以腺病毒为载体的Ad-IL24已进入临床Ⅱ期试验，也显示了良好的临床疗效^[14]。5-Fu及其衍生物是临床上一类广谱、高效的代谢抗肿瘤药物，适用于胃肠、头、颈、胸和卵巢等多部位恶性肿瘤的治疗。5-Fu与腺病毒联合应用，在食管癌^[15]、胰腺癌^[16]、膀胱癌及结肠癌^[17-18]等多种类型的肿瘤治疗中表现出协同作用。因此，本研究采用Ad-IL24联合低剂量化疗药5-Fu对肝癌细胞HepG2的抑制作用进行检测，并探讨其作用机制。

1 材料与方法 1.1 细胞培养

人肝细胞癌细胞系HepG2、人胚肾细胞系293A由中国医学科学院实验血液学国家重点实验室保存。使用含10% FBS及2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培养液，于37℃、5%CO₂条件下培养。

1.2 腺病毒穿梭质粒的构建及病毒包装

包装腺病毒所使用的穿梭质粒为pAd-IL24，IL24基因由经过LPS刺激的人外周血单个核细胞的cDNA中扩增获得。将穿梭质粒与pAdEasy-1骨架质粒正确重组后，根据ADeasy腺病毒包装手册说明于293A细胞中包装腺病毒。转染10~14天后待出现细胞病变效应，反复冻融三次收集为第一代病毒。继续传两代收集第三代病毒，冻于-80℃保存。

1.3 Ad-IL24与低剂量5-Fu联用对HepG2的生长抑制作用

取对数生长期HepG2，调整细胞密度为5×10⁴/ml，接种于96孔板。待细胞沉于孔板底部后，按100感染复数（multiplicity of infection, MOI）分别加入腺病毒Ad-IL24或对照病毒Ad-Track及等体积PBS空白对照，再分别加入终浓度为0、1、2 μg/ml 5-Fu，每组三个复孔。37℃、5%CO₂培养72 h，每孔加入10 μl CCK8溶液，继续培养1 h。用synergy H4微板检测仪于450 nm测定各孔A值。抑制率=实验组的A₄₅₀/空白对照的A₄₅₀×100%。联合用药治疗指数（CI）按以下公式计算：CI=AB合用时的细胞生存率/细胞生存率A×细胞生存率B，其中A和B分别为两种不同的处理方法，A代表Ad-IL24，B代表 5-Fu。当CI>1时，两药为拮抗作用；CI=1时，两药为相加作用；CI<1时，两药为协同作用。

1.4 Western blot法检测

取对数生长期的HepG2细胞，调整细胞密度为1.5×10⁵/ml，接种于6孔板，待细胞沉于孔板底部后，按100的感染复数分别加入腺病毒Ad-IL24或对照病毒Ad-Track，再分别加入不同浓度5-Fu（终浓度为0、1、2 μg/ml），48 h后采用Western blot法检测IL24的表达变化。

1.5 检测HepG2细胞感染腺病毒后GFP阳性率

取对数生长期的HepG2细胞，计数后调整细胞密度为1×10⁵/ml，接种于6孔板，待细胞沉于板底部，分别按10、25、50、100的感染复数加入Ad-Track，每种感染复数下再加入不同浓度的5-Fu（终浓度0、1、2 μg/ml）作用48 h后，流式细胞仪检测各组GFP阳性细胞的比例。

1.6 检测HepG2细胞表面CAR的阳性率

取对数生长期的HepG2细胞，调整细胞密度为1×10⁵/ml，接种于6孔板，待细胞沉于板底部，分别加入不同浓度的5-Fu（终浓度0、1、2 μg/ml），于24、48、72 h三个时间点收集各组细胞，先后孵育抗CAR兔源一抗及DyLight 649染料偶联的驴抗兔二抗，流式细胞仪检测各组细胞表面CAR表达水平变化。

1.7 统计学方法

应用SPSS11.0软件进行分析，数据结果以均数±标准差表示，采用ANOVN LSD或Dunnett post hoc进行检验。当P<0.05为差异有统计学意义；P<0.01时为差异有高度统计学意义。

2 结果 2.1 Ad-IL24与低剂量5-Fu联用对HepG2的生长抑制作用

CCK8细胞增殖实验结果表明5-Fu可浓度依赖的抑制HepG2细胞的生长，1 μg/ml和2 μg/ml的5-Fu对HepG2细胞的生长抑制率分别为（11.30±1.27）% 和（21.25±1.34）%，选用这两个低剂量与Ad-IL24联用，见图 1A。与单独Ad-IL24组相比，联用组对HepG2细胞生长的抑制作用明显增强（P=0.00770, P=0.00678）；同时与单独5-Fu组相比，联用组对HepG2细胞生长的抑制作用也明显增强（P=0.009781, P=0.000589），见图 1B。对照组与5-Fu联用后抑制作用也明显增强（P=0.029, P=0.024），提示5-Fu与腺病毒本身联用就存在协同作用。治疗指数显示Ad-IL24或Ad-Track与5-Fu联用可不同程度的协同抑制HepG2细胞的生长，见表 1。

2.2 Western blot法检测经5-Fu处理后IL24的表达

结果显示，与对照病毒Ad-Track相比，感染Ad-IL24后HepG2细胞IL24表达水平明显升高。并且，无论是Ad-Track组还是Ad-IL24组，低剂量的5-Fu加入后使IL24的表达升高，见图 1C。

2.3 低剂量5-Fu对腺病毒感染HepG2细胞感染效率的影响

本实验发现，相同感染复数的腺病毒感染HepG2细胞，5-Fu联用组的细胞荧光强度总是强于单独腺病毒感染组CAR，见图 2A。考虑5-Fu可能会提高腺病毒对HepG2的感染效率。结果显示，在较低感染复数（MOI为10或25）时，5-Fu可以显著提高HepG2的感染效率（P=0.00494, P=0.00356）；在较高感染复数（MOI为50或100）时，腺病毒本身的感染效率较高，5-Fu仍可以进一步提高其感染效率（P=0.01613, P=0.01805），见图 2B。当细胞摄取过多腺病毒时会产生细胞毒作用，从而解释了对照病毒与5-Fu联用也能产生协同抑制作用的原因。

2.4 低剂量5-Fu对HepG2细胞表面CAR表达的影响

腺病毒对HepG2细胞感染效率的增加，是与细胞摄取病毒的能力升高相关。流式细胞术结果显示：HepG2细胞经低剂量5-Fu处理后，其表面与腺病毒摄取相关的CAR表达水平随5-Fu处理时间的延长而升高，与未处理组相比差异有统计学意义（P=0.04643, 0.023249, 0.0094, 0.005962, 0.00454, 0.003006），见图 2C~D。至此，证明了低剂量5-Fu可以通过提高肿瘤细胞表面CAR的表达增强细胞摄取腺病毒的能力，从而达到协同抗肿瘤作用。

3 讨论

本研究选取了IL24抑癌基因，选用腺病毒为运载体，并通过与常规化疗药物5-Fu联用来协同提高对HepG2细胞系的生长抑制效果。与单独使用Ad-IL24相比，联合应用时，低剂量5-Fu通过提高肿瘤细胞表面CAR的表达，增加肿瘤细胞对病毒的摄取，使其抑瘤作用更显著。

运载系统的安全可靠始终是基因治疗的关键问题，腺病毒较其他运载方式虽然有着诸多优势，但也并非完美。单就本实验采用的复制缺陷型腺病毒载体而言，是在Ad-5基因组基础上删除了E1和E3基因区域改造而成^[19]。E1基因是病毒复制早期基因，进一步分为E1A和E1B，其中E1A基因是腺病毒复制所必需的，它的移除严重影响其他病毒基因的转录，进而使病毒DNA的复制进程停止。临床上使用复制缺陷性腺病毒虽然保证了其安全性，但由于它缺乏放大效应及病毒扩散的能力，治疗基因在肿瘤细胞中表达水平不高，势必会影响疗效。并且，因其不能持续稳定的表达治疗性蛋白，因而不适合用来治疗遗传障碍疾病。

基于上述原因，在本研究中寻求与低剂量的化疗药物联用来解决这一问题。5-Fu是临床广泛应用的一种治疗肿瘤的化疗药物，其主要机制是通过模拟正常代谢产物的化学结构，如叶酸、嘌呤碱和嘧啶碱，在DNA合成期干扰代谢物质的合成抑制肿瘤细胞的分裂和增殖^[20-21]。目前，越来越多的研究将化疗药物与腺病毒相结合用于治疗多种类型的肿瘤并收到了显著疗效。有研究发现Ad-del E1B55与5-Fu联合使用后，其体内外的抑瘤效果优于二者单独使用的疗效，提示两者联用有协同作用；而Ad-del E1B55与顺铂联用，在多个食管癌肿瘤细胞中均没有协同作用^[15]。更有报道表明5型腺病毒的突变株dl922-947与5-Fu联合应用治疗胰腺癌，可以使既耐受5-Fu又对腺病毒感染不敏感的肿瘤细胞Hs766T的疗效显著提高^[16]。

本实验选用了5-Fu与腺病毒联用以增加疗效，体外结果显示：低剂量的5-Fu与Ad-IL24以及对照腺病毒Ad-Track联用，其抑瘤作用都得到明显增强，提示5-Fu不仅能增强IL24的抗肿瘤作用，而且与腺病毒本身（Ad-Track）也有协同作用。产生协同作用的原因考虑与细胞摄取腺病毒的能力提升相关，腺病毒感染细胞的过程首先是腺病毒纤毛的头节区黏附到目的细胞表面的特异性CAR，接下来病毒纤毛基底部五邻体表面的三肽RGD与细胞表面的αvβ3和αvβ5整合素结合，通过内吞作用将腺病毒内化到细胞中，从而实现基因传递的功能。因此检测了5-Fu作用前后HepG2细胞表面CAR的表达情况，发现结果与预期一致，低剂量的5-Fu使肿瘤细胞表面CAR表达上调，从而促使肿瘤细胞摄取过量腺病毒而导致细胞毒性。此外，有报道表明IL24的过表达可能会增强肿瘤细胞对5-Fu的敏感度^[22]。