0 引言

研究表明34%~44%的癌症患者有明显心理应激反应或心理障碍，其中18%的患者符合重症抑郁发作的诊断^[1]。不良的生活事件与乳腺癌之间存在明显的关系，受到精神打击的妇女乳腺癌发生的相对危险度升高3倍左右。另外，乳腺癌患者普遍存在创伤后应激障碍，且不良应激反应加重不良反应，影响治疗效果，并促使肿瘤的复发、转移及恶化^[2] 。

应激反应（stress）是指机体受到有害刺激如创伤、手术、抑郁等时，产生的一系列非特异性的心理与生理反应。机体处于应激状态时，下丘脑-垂体-肾上腺轴活动增强，从而引起机体内多种应激反应相关激素（例如儿茶酚胺和糖皮质激素等）的水平发生变化。近几年来越来越多的研究表明，肾上腺素能系统在应激导致肿瘤的发生、发展过程中起着重要的关联作用。在胰腺癌、口腔鳞状细胞癌、结肠癌及卵巢癌等肿瘤细胞中有肾上腺素受体的表达，研究显示儿茶酚胺类激素通过肾上腺素受体影响肿瘤的进展，但可能通过不同的受体亚型在不同的细胞系中发挥完全相反的作用^[3-6]。而糖皮质激素在恶性淋巴瘤和直肠癌等肿瘤中也发挥重要的作用，但大部分研究均局限在细胞水平。因此本研究拟在动物水平和细胞水平系统研究肾上腺激素对乳腺癌转移的影响并探讨其相关机制，为应激影响乳腺癌提供新的理论依据，从心理生理角度为乳腺癌的防治提供新的思路和靶点。

1 材料和方法 1.1 试剂

肾上腺素（epinephrine, E）购自美国Millipore公司。用0.9%氯化钠溶液稀释，地塞米松（dexamethasone, DEX）购自美国Sigma-aldrich公司，用DMSO溶解稀释。RPMI 1640培养液购自美国Invitrogen公司，Hyclone胎牛血清采自南美，购于天津海铭威商贸有限公司，胰蛋白酶购自美国Amresco公司，孔径8 μm的Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肾上腺切除和移植模型建立

BALB/c小鼠，6~8周龄，雌性，体质量18~20 g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，所有实验操作程序均经过南开大学实验动物伦理委员会批准。小鼠随机分为三组：分别为假手术组、肾上腺切除组和肾上腺移植组。在假手术组中，在左侧腹部依次分离解剖结构进入腹腔，显露肾上腺，然后逐层缝合。在移植组中，预先计算好BALB/c孕鼠的分娩时间，提前3天开始观察孕鼠，每天7:00，13:00，19:00，22:00各观察一次孕鼠状态，若观察到孕鼠已经分娩出仔鼠，则取观察时间所在时间段的中点开始计算，于出生后48~60 h内摘取新生鼠的两侧肾上腺（供体）置于4℃ 0.9%氯化钠溶液中备用；用注射器将一枚肾上腺吸入针头头端，置于已经假手术的BALB/c小鼠（受体）肾被膜下，逐层缝合^[7]。

1.2.2 小鼠乳腺原位肿瘤模型的建立和活体荧光观察

取0.1 ml含10⁶个已转染荧光素酶基因的乳腺癌细胞4T1-luc悬液（南开大学医学院向荣教授惠赠）分别接种于上述三组小鼠左侧乳腺脂肪垫内，制作小鼠乳腺癌模型^[8]。观察肿瘤的生长及转移情况。观察前每只小鼠腹腔注射荧光素底物（1.5 mg/10 g），水合氯醛（3.5 mg/10 g）麻醉后放入活体荧光影像系统摄像，Slide Book 4.0软件进行分析。

1.2.3 印度墨水染色观察肺转移情况

肿瘤生长至45 d，将小鼠安乐死后，分离出气管，提前准备好2 ml印度墨汁（用0.9%NaCl溶液将墨汁稀释至浓度为15%），通过气管向小鼠肺内注射墨汁，到小鼠的肺不再膨胀时停止注射，结扎气管防止墨汁倒流。然后用Fekete’s洗脱液洗脱肺（70 ml酒精，10 ml甲醛，5 ml冰醋酸，15 ml水）。脱色后，计算肺部肿瘤结节。

1.2.4 细胞划痕实验

取对数生长期的4T1细胞，用无血清培养液孵育12 h后，按每孔5×10⁵个细胞添加到6孔板中，用10 μl的移液器枪头在6孔培养板每孔的中央在纵轴方面划出一条创伤区域。用PBS洗细胞2遍，去除漂浮细胞，无血清培养液继续培养。实验分四组：0.9%氯化钠溶液组、DMSO组、肾上腺素组（E组）（10 μmol/L）和地塞米松组（DEX组）（1 μmol/L）。在0和18 h分别于倒置相差显微镜下观察并拍照。

1.2.5 细胞迁移实验

取对数生长期的4T1细胞，用无血清培养液孵育12 h后，消化、离心（1 000 r/min）后用含0.2%BSA无血清RPMI 1640培养液重悬。调整细胞密度至5×10⁷个每毫升。取200 μl含溶剂或含药物处理的细胞悬液加入到24孔Transwell小室的上室，24孔板下室加入600 μl含10%FCS的RPMI 1640细胞培养液。每组3个复孔，培养24 h取出Transwell用PBS洗2遍，用棉球擦去上室表面细胞，甲醇固定15 min，4℃；用PBS洗2遍，0.1%结晶紫室温下染色30 min，PBS洗2遍，显微镜下观察，取10个视野计数细胞个数、拍照。并将结晶紫洗脱后测OD值。

1.2.6 荧光定量PCR

荧光定量 PCR反应体系中加入上下游引物各0.5 μl，SYBR green染料25 μl，cDNA模板2 μl，加去离子水调至50 μl，设置3个复孔。95℃，预变性20 s；95℃ 3 s，58℃ 30 s，45个循环。引物序列如下：E-cadherin：正义：5’-CAGTTCCGAGGTCTACACCTT-3’，反义：5’-TGAATCGGGAGTCTTCCGAAAA-3’；vimentin：正义：5’-CGTCCACACGCACCTACAG-3’，反义： 5’-GGGGGATGAGGAATAGAGGCT-3’；ZEB1：正义：5’-ACCGCCGTCATTTATCCTGAG-3’，反义：5’-CATCTGGTGTTCCGTTTTCATCA-3’； β-actin：正义：5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，反义：5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。

1.2.7 Western blot实验

按照说明书裂解细胞，BCA法测定蛋白质量浓度，沸水变性5 min，冷却上样，每孔上样量为50 μg，SDS-PAGE电泳；将蛋白半干转至PVDF膜上，室温封闭1 h，vimentin一抗稀释比例为1:500，E-cadherin和ZEB1抗体稀释比例为1:1 000孵育过夜；TBST清洗3次；室温二抗（辣根过氧化物酶标记，稀释比例为1:2 000）孵育1 h，TBST清洗5 min。ECL化学曝光。

1.3 统计学方法

采用Sigma stat 10.0软件进行处理，数据用One way-ANOVA分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 小鼠乳腺原位癌的生长观察

解剖三组小鼠发现肾上腺移植组肿瘤体积最大，假手术组次之，而肾上腺切除组肿瘤体积最小。与假手术组相比，肾上腺移植组小鼠肿瘤重量增加了（63±3）%（P=0.006），而肾上腺切除组肿瘤肿瘤减少了（37±4）%（P=0.003），见图 1。

2.2 小鼠肺转移情况

小鼠肺部用印度墨水染色并用Fekete’s洗脱液脱色，肺部肿瘤结节清晰可见，肾上腺移植组肺部转移最明显；假手术组次之；肾上腺切除组肺部转移最不明显。假手术组、肾上腺移植组和肾上腺切除组小鼠肺部结节数分别为（11±0.9）、（23±3.0）和（5±0.9）（P=0.03），见图 2A~2B。小动物活体成像实验显示，肾上腺移植组腹部转移最显著，转移灶最大，假手术组次之，肾上腺切除后转移灶最小，见图 2C。

2.3 肾上腺激素对4T1细胞迁移能力的影响

2.3.1 细胞划痕实验

用10 µmol/L肾上腺素和1 µmol/L地塞米松分别处理细胞18 h后，测量伤口愈合的距离。发现肾上腺素对4T1细胞的伤口愈合能力没有影响。而地塞米松处理后则明显促进细胞的迁移，见图 3A。

2.3.2 细胞迁移实验

用10 µmol/L肾上腺素和1 µmol/L地塞米松分别处理细胞18 h后，计数穿到小室下面的细胞。实验发现肾上腺素对4T1细胞迁移能力没有明显的影响。而加入地塞米松后，穿透小室的细胞数明显多于DMSO组。结晶紫洗脱后发现地塞米松组OD值比DMSO组增加了（43±3）%，两组比较差异有统计学意义（P=0.002），见图 3B。

2.4 地塞米松对4T1细胞E-cadherin、vimentin和ZEB1表达的影响

2.4.1 细胞迁移相关基因的mRNA检测

RT-PCR和荧光定量PCR检测E-cadherin、vimentin和ZEB1基因的mRNA水平变化，发现经过地塞米松处理4T1细胞24 h后E-cadherin的表达下降（54±2）%，而vimentin表达上升了（6.9±0.5）倍、ZEB1表达升高了（3.0±0.2）倍（P=0.002），见图 4A~4B。

2.4.2 细胞迁移相关蛋白的表达情况

Western blot检测结果显示：4T1细胞经地塞米松处理后上皮细胞标志性E-cadherin蛋白表达量显著降低，而vimentin和ZEB1两种蛋白的表达量升高，见图 4C。

3 讨论

小鼠乳腺癌4T1细胞是高转移细胞株，且雌激素受体表达阴性。在BALB/c小鼠中的生长特点与人类恶性侵袭性乳腺癌的行为很相似，是一种比较接近人类肿瘤转移病理过程的模型，有重要应用价值。有研究表明，乳腺癌细胞内肾上腺素受体信号转导的结果可能不依赖于细胞肾上腺素受体表达，肾上腺素受体信号转导可能通过调节肿瘤免疫反应以及肿瘤微环境而影响乳腺癌进展^[9-10]。

本研究通过切除BALB/c小鼠肾上腺和移植肾上腺并接种稳定表达了荧光素酶luciferase基因的4T1细胞，建立不同肾上腺功能水平的小鼠乳腺癌肿瘤模型，结合小动物活体成像技术，连续动态观察肿瘤生长及转移情况，建立了便于早期观察的小鼠乳腺癌肿瘤转移模型，比较了不同肾上腺功能水平的BALB/c小鼠体内肿瘤发生和转移的情况。实验结果表明假手术、肾上腺移植和肾上腺切除三组小鼠乳腺癌均发生转移，但肿瘤转移程度各不相同，其中肾上腺移植组肿瘤转移程度最严重，且肿瘤肺部转移最明显；假手术组次之；肾上腺切除组转移程度最轻，且肺部转移最不明显。说明肾上腺功能水平可影响BALB/C小鼠4T1乳腺癌的转移，且肾上腺功能水平越高，乳腺癌转移越严重。

肿瘤转移包括诸多环节，大量的研究证实癌细胞的转移一般要经历肿瘤细胞外基质降解，肿瘤细胞运动性增强，穿越基底膜进入循环系统，然后通过免疫逃避机制在新的位置形成新的肿瘤组织。特别是近年研究表明，上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）在肿瘤的转移中扮演了重要角色^[11]。在EMT过程中，肿瘤细胞失去连接，表现为间充质细胞的特性和表型，并获得了侵袭和转移能力。有研究表明在MvlLu肺上皮细胞中，地塞米松可抑制EMT并促进MET进展^[12]，而也有最新的研究发现在雌激素受体阴性的乳腺癌细胞中，糖皮质激素抑制多西紫杉醇诱发的凋亡从而促进肿瘤进展^[13]，并且会导致雌激素受体阴性乳腺癌患者预后不良^[14]。本研究结果显示雌激素受体阴性的4T1细胞经地塞米松刺激后，细胞内vimentin、ZEB1 mRNA和蛋白水平均明显上升，而E-cadherin mRNA和蛋白水平均有所下降。E-cadherin是癌细胞转移相关的关键细胞因子之一^[15]，是上皮细胞的重要标志因子，其下降标志着EMT的发生。肿瘤细胞内vimentin和ZEB1水平的上升更加表明了细胞向间充质细胞的转变。这些结果证实经地塞米松处理后，影响了4T1细胞的部分特性，使其迁移性增强。同时细胞划痕实验和Transwell迁移实验也进一步证实了这个结果。

综上，研究结果证实肾上腺功能增强可促进肿瘤的生长和转移，而肾上腺切除可抑制肿瘤的生长和远处转移；地塞米松确实在4T1移植乳腺癌的进展中发挥着重要的作用，且可能是通过EMT来介导乳腺癌的转移。本研究为生理心理应激影响肿瘤的生长和转移提供了新的理论依据，但研究并没有显示地塞米松对雌激素受体阳性的乳腺癌细胞特性的影响，有一定的局限性。