2016, Vol. 43文章信息
- PTTG1促进结肠癌SW480细胞侵袭和迁移的作用机制
- Effect of PTTG1 Expression on Invasion and Migration of Colon Cancer Cell SW480 and Its Possible Mechanism
- 肿瘤防治研究, 2016, 43(11): 948-953
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2016, 43(11): 948-953
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2016.11.006
- 收稿日期: 2015-12-18
- 修回日期: 2016-05-19
引用本文 |
2. 443002 宜昌，宜昌市中心人民医院肛肠科
2. Anorectal Section,Yichang Central People's Hospital,Yichang 443002,China
结肠癌是全球第三大恶性肿瘤，每年将近1000 000新确诊患者，超过500 000死于结肠癌[1]。垂体肿瘤转化基因1（pituitary tumor transforming gene 1,PTTG1）是一种新的癌基因；被报道在多发性骨髓瘤[2]、宫颈癌[3]等肿瘤中高表达，与肿瘤的不良预后密切相关，高表达PTTG1具有促进细胞侵袭和转移功能。前期研究显示PTTG1在结肠癌患者中高表达与肿瘤的侵袭能力密切相关[4]；但未有报道提示PTTG1对结肠癌癌细胞侵袭和转移的影响。本研究通过建立PTTG1过表达的结肠癌SW480细胞，检测PTTG1对SW480细胞侵袭和迁移的影响，并分析其可能的分子机制，期望为结肠癌的治疗提供新的分子靶点。
1 材料与方法 1.1 材料人结肠癌细胞SW480为实验室传代培养，pcDNA3.1(+)-PTTG1及空载pcDNA3.1(+)为三峡大学第一临床医学院中心实验室保存；胎牛血清、RPMI 1640培养液、青霉素、链霉素及G418均购自美国Gibco公司；转染试剂Lipofectamine TM 2000购自美国Invitrogen 公司；兔抗人PTTG1、MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin、Snail的多克隆抗体，β-actin单克隆抗体，HRP标记的羊抗兔抗体均购自美国Santa Cruz公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，PrimeScript反转录试剂盒及SYBR premix EXTaqⅡ荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；Transwell小室购自美国Thermo Fisher公司；G418、LY29400购自美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 方法 1.2.1 SW480细胞培养及稳定过表达PTTG1基因的细胞株建立人结肠癌细胞株SW480常规培养于含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液，37℃、5%CO2相对湿度95%的恒温培养箱，2~3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。转染前24 h将细胞消化传代平铺到10 cm直径的培养皿中，使用脂质体转染法转染pcDNA3.1(+)-PTTG1及空载pcDNA3.1(+)，转染后24 h，在培养液中加入800 μg/ml的G418。每2~3天更换筛选培养液，显微镜下观察，挑取单克隆用含400 μg/ml的G418常规培养液培养14天后，建立稳定转染的细胞系。
1.2.2 Western blot法检测PTTG1等蛋白表达收集对数生长期细胞，提取蛋白质，测定蛋白浓度，取20 μg蛋白制成总体为20 μl的上样缓冲液，经10%凝胶电泳（电压80 V，恒压电泳2.5 h），转印（70 V转印1.5 h）后将载有目的蛋白的PVDF膜浸入5%（M/V）脱脂奶粉溶液中，室温摇床缓慢摇动封闭1 h，用PTTG1、MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin、Snail兔抗人一抗（5%脱脂奶粉1:500稀释抗体）4℃过夜、HRP标记羊抗兔二抗（5%脱脂奶粉1:5 000稀释抗体）37℃孵育30 min，ECL显影。显影后的PVDF膜经抗体剥离后，重新封闭，用HRP标记β-actin抗体（5%脱脂奶粉1:5 000稀释抗体）37℃孵育1 h，ECL显影。
1.2.3 Real-time PCR检测PTTG1的表达TRIzol法提取细胞总RNA，依照PrimeScript反转录试剂盒标注方法反转录制备cDNA，实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测PTTG1的表达。引物：PTTG1正义链：5′-TGA CGA GGA GAG AGA GCTTGA AA-3′；PTTG1反义链：5′-CAA CAT CCA GGGTCG ACA GAA T-3′；β-actin正义链：5′-CCC AGC ACAATG AAG ATC AAG ATC A-3′； β-actin 反义链：5′-ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′。反应条件：以95℃ 30 s预变性，95℃ 5 s，退火温度30 s，40个循环，加设溶解曲线程序：75℃ 2 s以0.2℃/s升至95℃ 2 s，PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。各设3个复孔，取其平均Ct值，以β-actin为内参。采用2-△△Ct法分析基因的相对表达量。
1.2.4 Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力未铺基质胶和铺好基质胶Transwell小室放入24孔板中，下室加入含10%FBS的培养液750 μl；收集对数生长期细胞，计数后以5×104个每孔细胞平铺到上室，置37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养12 h后，取出Transwell小室，PBS轻轻冲洗，上下各冲洗1次；用棉签擦去微孔膜上层细胞；多聚甲醛室温下固定20 min，苏木精染液染色3 min，蒸馏水冲洗。在倒置显微镜下（×200）对迁移至微孔膜下层的细胞计数。每个样本选取5个视野计数细胞个数，取均数。
1.3 统计学方法采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学处理，计量资料采用平均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 PTTG1过表达增强SW480细胞侵袭和迁移能力传代培养实验室前期建立稳定转染PTTG1真核表达质粒细胞株PTTG1-SW480及其对照细胞系Vector-SW480，与常规培养SW480细胞相比，PTTG1-SW480细胞PTTG1蛋白表达水平上升，其表达量是SW480细胞的3.58倍、Vector-SW480细胞的3.42倍，差异均有统计学意义（P＜0.01）。PTTG1 mRNA表达水平亦显著升高，是SW480细胞2.01倍、Vector-SW480的2.07倍，差异均有统计学意义（P=0.002,P=0.001）。Vector-SW480和SW480细胞间差异无统计学意义，见图 1。
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| A: The expression of PTTG1 protein detected by Western blot; B: The expression of PTTG1 mRNA detected by Real-time PCR. 1: SW480; 2: Vector-SW480; 3: PTTG1-SW480. 1) : P=0.002,compared with SW480 cells; 2) : P=0.001,compared with Vector-SW480 cells; 3) : P=0.026,compared with SW480 cells; 4) : P=0.020,compared with Vector-SW480 cells 图 1 PTTG1稳定表达SW480细胞的建立 Figure 1 PTTG1 over-expression in SW480 cells |
与Vector-SW480细胞（103 vs. 60）和SW480细胞（103 vs. 59）比较，PTTG1-SW480细胞侵袭能力显著增强，差异有统计学意义；Vector-SW480细胞和SW480细胞间差异无统计学意义。PTTG1-SW480细胞迁移能力亦显著增强，与Vector-SW480细胞（165 vs. 97）和SW480细胞（165 vs. 98）相比，差异有统计学意义；Vector-SW480细胞和SW480细胞间差异无统计学意义，见图 2。同时检测MMP2和MMP9的表达，与Vector-SW480和SW480细胞相比，PTTG1-SW480细胞MMP2和MMP9表达量均显著升高，差异均有统计学意义；Vector-SW480和SW480细胞间差异无统计学意义，见图 3。
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| A: The ability of cell invasion detected by Transwell chamber; B: The ability of cell migration detected by Transwell chamber. 1: Sw480; 2: Vector-SW480; 3: PTTG1-SW480 1) : P=0.036,compared with SW480 cells; 2) : P=0.014,compared with Vector-SW480 cells; 3) : P=0.003,compared with SW480 cells; 4) : P=0.017,compared with Vector-SW480 cells 图 2 PTTG1促进细胞侵袭与迁移 Figure 2 PTTG1 promoted SW480 cells invasion and migration |
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| A: the expression of MMP2 and MMP9 protein detected by Western blot; B: quantitative analysis of the relative expression levels of MMP2 and MMP9 protein with β-actin; 1) : P=0.015,compared with SW480 cells; 2) : P=0.017,compared with Vector-SW480 cells; 3) : P=0.009,compared with SW480 cells; 4) : P=0.026,compared with Vector-SW480 cells 图 3 PTTG1促进SW480细胞中MMP2和MMP9的表达 Figure 3 PTTG1 up-regulated MMP2 and MMP9 expression in SW480 cells |
上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）在调控肿瘤细胞侵袭及转移中发挥了关键作用。检测细胞表面黏附分子E-cadherin、间质细胞标记分波形蛋白（Vimentin）及调控EMT转化的关键调控因子Snail的表达，结果显示：与Vector-SW480和SW480细胞相比，PTTG1-SW480细胞中E-cadherin表达降低，Vimentin、Snail表达均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Vector-SW480和SW480细胞间差异无统计学意义，见图 4。
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| A: the expression of E-cadherin,Vimentin and Snail protein detected by Western blot; B: quantitative analysis of the relative expression levels of E-cadherin,Vimentin and Snail protein with β-actin; 1) : P=0.013,compared with SW480 cells; 2) : P=0.009,compared with Vector-SW480 cells; 3) : P=0.010,compared with SW480 cells; 4) : P=0.006,compared with Vector-SW480 cells; 5) : P=0.009,compared with SW480 cells; 6) : P=0.018,compared with Vector-SW480 cells 图 4 PTTG1促进SW480细胞上皮间质转化 Figure 4 PTTG1 promoted epithelial-mesenchymal transition(EMT) of SW480 cells |
PI3K/AKT信号活化能够有效促进肿瘤细胞EMT、侵袭和迁移。结果显示：PTTG1过表达细胞PTTG1-SW480中活化形式p-AKT表达较Vector-SW480和SW480细胞显著升高，见图 5。使用PI3K/AKT信号抑制剂LY29400（10 μmol/L）干预后，能有效抑制PTTG1-SW480细胞侵袭（103 vs. 59）和迁移（165 vs. 95），差异有统计学意义，P值分别为0.032和0.060，对Vector-SW480细胞侵袭（60 vs. 57）和迁移（97 vs. 98）无显著影响，P值分别为0.700和0.825，见图 6；LY29400干预能有效下调PTTG1-SW480中Vimentin和Snail的表达，上调E-cadherin表达，对Vector-SW480细胞没有显著性影响，见图 7。表明PTTG1通过活化PI3K/Akt信号促进SW480细胞EMT、侵袭和迁移。
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| A: The expression of AKT and p-AKT protein detected by Western blot; B: Quantitative analysis of the relative expression levels of AKT and p-AKT protein with β-actin; 1) : P=0.017,compared with SW480 cells; 2) : P=0.040,compared with Vector-SW480 cells 图 5 PTTG1促进SW480细胞PI3K/AKT信号活化 Figure 5 PTTG1 enhanced activation of signal pathway of PI3K/AKT in SW480 cells |
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| A: The ability of cell invasion detected by Transwell chamber; B: The ability of cell migration detected by Transwell chamber. 1: Vector-SW480; 2: Vector-SW480+LY29400; 3: PTTG1-SW480; 4: PTTG1-SW480+LY29400. 1) : P=0.700,compared with Vector-SW480 cells; 2) : P=0.032,compared with PTTG1-SW480 cells; 3) : P=0.825,compared with Vector-SW480 cells; 4) : P=0.006,compared with PTTG1-SW480 cells 图 6 PTTG1通过活化PI3K/AKT信号促进SW480细胞侵袭与迁移 Figure 6 PTTG1 promoted SW480 cells invasion and migration through activating signal pathway of PI3K/AKT |
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| A: The expression of E-cadherin,Vimentin and Snail protein detected by Western blot; B: Quantitative analysis of the relative expression levels of E-cadherin,Vimentin and Snail protein with β-actin. 1: Vector-SW480; 2: Vector-SW480+LY29400; 3: PTTG1-SW480; 4: PTTG1-SW480+LY29400. 1) : P=0.013,compared with Vector-SW480 cells; 2) : P=0.006,compared with PTTG1-SW480 cells; 3) : P=0.025,compared with Vector-SW480 cells; 4) : P=0.026,compared with PTTG1-SW480 cells; 5) : P=0.000,compared with Vector-SW480 cells; 6) : P=0.018,compared with PTTG1-SW480 cells 图 7 PTTG1通过活化PI3K/AKT信号促进SW480细胞EMT Figure 7 PTTG1 promoted EMT of SW480 cells through activating signal pathway of PI3K/AKT |
PTTG1是一个癌基因，有研究报道中高表达的PTTG1具有促进肿瘤侵袭和转移的能力[7]。上皮间质转化（EMT），是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。在胚胎发育、慢性炎性反应、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥了重要作用，其主要特征有细胞黏附分子（E-cadherin）表达的减少、间充质细胞神经-钙黏素（N-cadherin）表达上调，细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白（Vimentin）为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等。通过EMT，上皮性肿瘤细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型；转录因子Snail、Slug、Twist和ZEB1能有效调控具有抑制E-cadherin的表达，促进肿瘤细胞EMT、侵袭和迁移[8-10]。研究显示癌基因PTTG1通过调控肿瘤细胞EMT和肿瘤干细胞的扩增促进肿瘤的恶性表型[11]； PTTG1在口腔鳞癌细胞中过表达能够有效促进肿瘤细胞侵袭和迁移，促进细胞EMT，下调E-cadherin的表达，上调Snail和Vimentin蛋白的表达[12]。本研究中，结肠癌SW480细胞过表达PTTG1后，细胞侵袭和迁移能力增强，E-cadherin表达下调，Snail和Vimentin蛋白表达上调。结肠癌相关研究提示Snail1的表达与肿瘤的进展和转移相关，77%表达Snail的结肠癌细胞在经历EMT[13]。表明上调Snail的表达可能是PTTG1调控结肠癌细胞EMT，参与结肠癌侵袭和转移的主要机制之一。
磷酯酰肌醇3激酶（phosphoinositide-3-kinase,PI3K）家族，是生长因子超家族信号转导过程中的重要分子，可被多种细胞因子和理化因素激活，癌基因诱导常介导PI3K活化参与肿瘤的进程；丝氨酸激酶（serine threonine kinase,AKT）通路主要负责由PI3K始动的生物信息的转导，AKT处于这一通路的中心环节，它在细胞增殖、侵袭和迁移、凋亡等多种生物学过程中发挥着重要作用[14]。PTTG1被报道能够有效活化PI3K/AKT信号促进细胞侵袭和迁移[7, 11]。本研究发现PTTG1过表达可以有效促进PI3K/AKT信号活化，LY294002干预后能有效抑制结肠癌细胞的侵袭与转移。而此前的研究显示PI3K/Akt信号参与调控肿瘤细胞EMT，促进肿瘤的侵袭与迁移；Chen等发现骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2, BMP2）通过活化PI3K/Akt信号促进胰腺癌细胞EMT、侵袭和转移，使用 LY294002干预后将有效抑制胰腺癌细胞EMT，抑制细胞侵袭和迁移[15]；Wang等研究显示HPIP通过活化PI3K/Akt 信号促进甲状腺癌细胞的EMT，下调E-cadherin蛋白表达，上调N-cadherin的表达[14]。另有研究证实五溴联苯醚能通过活化PI3K/Akt信号上调EMT关键转录因子Snail的表达，但不上调Slug、Twist和ZEB1的表达，增加N-cadherin的表达，促进结肠癌的EMT，增强细胞侵袭和转移能力[16]；Cho等报道CD44/EGFR/PI3K-Akt信号的活化促进结肠癌细胞EMT，下调E-cadherin的表达，抑制E-cadherin-β-catenin复合物的形成、抑制细胞的侵袭和转移[17]。本研究中，LY294002干预后能有效抑制PTTG1-SW480细胞EMT，细胞中的E-cadherin蛋白表达下调，Snail、N-cadherin的表达上调，但对Vector-SW480没有影响；充分表明PTTG1通过活化PI3K/AKT信号调控SW480细胞EMT，促进肿瘤侵袭与迁移。
综上所述，本研究体外建立PTTG1过表达的SW480细胞，得到PTTG1能有效促进细胞的侵袭和迁移，SW480细胞发生EMT转化；使用LY29400抑制PI3K/AKT信号活化能有效拮抗PTTG1对SW480细胞侵袭和迁移、EMT的调控作用。表明PTTG1通过诱导PI3K/AKT信号活化调节SW480细胞EMT、侵袭和迁移。提示PTTG1可以作为结肠癌治疗靶点应用于临床的诊断与治疗。
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