0 引言

甜菜红素是一类抗氧化剂色素^[1]，具有抗疲劳^[2]、抗辐射^[3-4]、治疗胃炎^[5]、增强免疫力^[6]和补血^[7]的作用。同时，该物质也可抑制小鼠皮肤内肿瘤^[8]，以及拮抗大鼠食管癌的发生^[9]，通过诱导实验性肺癌小鼠肿瘤细胞凋亡和抑制血管发生，从而抑制肿瘤的生长^[10]，导致骨髓白血病细胞株K562凋亡^[11]。雒秋江等^[12]在甜菜红素抑制HeLa细胞增殖的研究中，证实甜菜红素具有抑制肿瘤生长的作用，且抗肿瘤的效率与甜菜红素浓度呈正相关。

线粒体是真核细胞内一种重要的细胞器，其结构和功能异常与肿瘤发生发展密切相关。国外学者Otto warbugr最早提出线粒体呼吸链的缺陷可导致细胞去分化，并因此发生致瘤性转化^[13]。线粒体比表面是指其表面积与体积之比。假设线粒体表面积不变，体积增大则比表面减小可说明线粒体发生肿胀。线粒体的周长、截表面积增大，表明线粒体体积增大。面数密度增大，表明线粒体数量增多^[14]。为了研究甜菜红素对肿瘤细胞超微结构的影响，探讨甜菜红素抑制肿瘤的机制，本试验通过将低浓度62.5 ppm和高浓度500 ppm两种剂量的甜菜红素，作用于人宫颈癌HeLa细胞系、人肝癌HepG2细胞系和人肺腺癌A549细胞系。在透射电子显微镜下观察HeLa细胞、HepG2细胞和A549细胞的线粒体数量、形态、截表面积、以及所产生的特有细胞病变结构特征，以了解甜菜红素对肿瘤细胞的作用机制。

1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

甜菜红素由实验室自行制备^[15]。HeLa、HepG-2和A549细胞分别购自中国武汉典型培养物保藏中心（CCTCC）。胎牛血清、DMEM培养液购自美国Hyclone公司。戊二醛、锇酸、812树脂包埋剂购自上海达昱公司。无水乙醇、丙酮、柠檬酸铅、醋酸铀、细胞培养板购自北京鼎国生物公司。

仪器：Shellab型医用二氧化碳培养箱（美国希尔顿公司）、SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台（中国苏州净化设备有限公司）、AE-31数码倒置显微镜（中国厦门麦克奥迪公司）、超薄切片机（德国徕卡公司）、H-600型透射电子显微镜（日本日立公司）等。

1.2 实验设计与细胞培养

参照雒秋江等药物细胞感作方法^[15]，在6孔培养板中用含10%胎牛血清DMEM培养液分别培养HeLa、HepG2和A549细胞，培养液体积10 ml，培养细胞初始密度为7.4×10⁴个每毫升。培养2 h细胞贴壁后分别加入终浓度为0 ppm、低浓度62.5 ppm和高浓度500 ppm的甜菜红素，培养36 h后收获细胞。

收获的细胞经离心固定后，用8 000~30 000倍电子显微镜定性或定量观察细胞核、线粒体等变化。

1.3 培养细胞样品的处理与透射电镜观察

细胞培养36 h后弃培养液，PBS洗涤2遍，刮取收集细胞于1.5 ml离心管中，1 000 r/min离心10 min，弃上清液。加入1 ml 2.5%的戊二醛固定液固定24 h。细胞固定后，弃固定液加入1 ml 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2），每次15 min冲洗浸泡1次，连续冲洗5次。1%锇酸固定细胞1.5 h，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗5次。依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%浓度乙醇逐级脱水，无水乙醇/丙酮（1:1）、无水乙醇/丙酮（1:4）、纯丙酮进行置换，EPon812包埋剂/丙酮（1:1）、EPon812包埋剂/丙酮（4:1）、纯EPon812包埋剂对细胞进行渗透，EPon812包埋剂对细胞进行包埋，分别在37℃、42℃、60℃温度下聚合72 h，100 nm厚度切片，并用铜网捞取切片，进行醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，电镜观察。

透射电子显微镜下对各样品进行观察。HeLa、HepG2和A549细胞线粒体放大30 000倍，细胞核、凋亡小体、自噬体放大8 000倍观察。观察线粒体时选取3张独立的切片，统一在8 000倍下对每张切片随机取20个视野。计数每个视野中的线粒体数，Image-proplus6.0照片图像数据分析软件计算视野中线粒体的截表面积^[16-17]。

1.4 统计学方法

数据均用平均数±标准差表示。用SPSS17.0版统计软件进行统计分析，数据采用独立样本多重比较t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 甜菜红素对肿瘤细胞线粒体数量和截表面积的影响

与0 ppm浓度组比较，加入62.5、500 ppm甜菜红素，HeLa细胞的线粒体计数分别增加10.9%（P < 0.05）和15.2%（P < 0.01）；HepG2细胞分别增加25.0%（P < 0.05）和79.7%（P < 0.01）；A549细胞线粒体计数分别增加12.6%（P < 0.05）和40.0%（P < 0.01），表明甜菜红素增加肿瘤细胞的线粒体数量与甜菜红素的浓度相关，并且在高浓度时增加更显著，见表 1。

加入62.5、500 ppm甜菜红素，与0 ppm浓度组比较，HepG2细胞的线粒体截表面积分别减小38.9%（P < 0.05）和67.8%（P < 0.01）；HepG2细胞的线粒体截表面积分别减小70.1%（P < 0.05）和77.6%（P < 0.01）；A549细胞分别减少65.3%（P < 0.05）和81.9%（P < 0.01），表明加入甜菜红素可减小肿瘤细胞线粒体的体积，且与甜菜红素的浓度相关，浓度越高减小越多，见表 1。

2.2 甜菜红素对肿瘤细胞线粒体结构的影响

不同浓度甜菜红素作用于细胞后，肿瘤细胞线粒体均体积增大、肿胀，多呈空泡化，线粒体脊膜结构被破坏、断裂、脊膜消失等，HeLa肿瘤细胞核周围线粒体数量较多，线粒体呈椭圆形，多数呈空泡变化，肿胀显著，线粒体脊膜断裂、结构消失，见图 1A。加入62.5 ppm甜菜红素时，细胞的线粒体体积变小，内膜趋于完整、形态结构开始变得规则，但仍有部分线粒体略呈肿胀状态，见图 1B。加入500 ppm甜菜红素浓度时，HeLa细胞线粒体无肿胀现象，无空泡形成，内膜结构较为完整，并且体积进一步变小，见图 1C。表明甜菜红素可促进HeLa细胞线粒体结构的完整性，并随甜菜红素的浓度增加而增加，在高浓度时线粒体结构更加完整。

HepG2肿瘤细胞线粒体数量显著增多，聚集排列，线粒体肿胀，多数呈空泡状，无内膜结构，见图 1D。加入62.5 ppm甜菜红素时，线粒体形态恢复，内部脊膜结构已明显可见，但仍有部分线粒体略显肿胀, 见图 1E。在加入500 ppm甜菜红素时，细胞线粒体的截表面积变小，数量增多，内膜结构完整，无空泡，见图 1F。表明甜菜红素也可促进HepG2细胞线粒体结构的完整性，并随甜菜红素的浓度作用增加，高浓度时更加完整。

A549肿瘤细胞线粒体肿胀，内基膜断裂呈空泡状，边缘可以见残存的线粒体基膜，见图 1G。加入62.5 ppm甜菜红素时，线粒体体积变小，部分线粒体内部脊膜结构已明显可见，线粒体数量相对增多，见图 1H。在加入500 ppm甜菜红素时，细胞线粒体的截表面积变小，数量增多，无空泡现象，内膜结构完整；内质网排列整齐，由核膜围绕线粒体延伸至细胞膜，见图 1I。表明甜菜红素对A549细胞的线粒体有修复功能，并随甜菜红素的浓度增加而增加，高浓度时修复作用更强。

2.3 甜菜红素对肿瘤细胞核结构的影响

HeLa肿瘤细胞核体积较大，占满整个细胞，核仁偏移，具有肿瘤细胞核的典型特征，即多核、巨核^{[16, 18]}，见图 2A。加入62.5 ppm甜菜红素后，细胞核出现明显的裂解、破碎，形态不规则呈分叶状，且已分裂的细胞核内无核仁，见图 2B。在加入500 ppm甜菜红素时，细胞核出现固缩、核分裂和溶解等核坏死相，见图 2C。表明甜菜红素可促使HeLa细胞核破裂、坏死，并随甜菜红素浓度增加作用增大，高浓度时作用更强。

HepG2肿瘤细胞核体积较大，核染色质着色较深，呈巨核相特征，见图 2D。加入62.5 ppm甜菜红素后，细胞核的体积变小，形态不规则，核仁产生固缩，且呈多核相，见图 2E。加入500 ppm甜菜红素后，细胞核萎缩，体积变小更加明显，形态不规则，核内染色质着色较浅，见图 2F。表明甜菜红素同样影响HepG2细胞核的形态，出现核固缩、溶解的核坏死特征。

A549肿瘤细胞核为多核性，核仁位于膜两侧，核仁染色质较为丰富、着色较深，见图 2G。加入62.5 ppm甜菜红素后，细胞核开始出现不对称性分裂，核仁偏于核膜一侧，细胞核形态不规则，细胞内出现空泡变化，见图 2H。加入500 ppm甜菜红素后，细胞核固缩，形态极不规则，核仁分解、消失，核内染色质着色较浅，细胞内空泡数量增多，见图 2I。表明甜菜红素对A549细胞核的周期分裂产生影响，干扰细胞核的正常分裂，使细胞核的形态发生改变，出现核固缩、溶解的坏死特征，导致细胞的周期分化出现异常。

2.4 甜菜红素对HeLa和A549细胞凋亡小体形成的影响

加入500 ppm甜菜红素时，HeLa和A549细胞均出现以细胞核为中心的细胞固缩成团，并出现解体现象，细胞膜围绕包裹细胞分解的内部成分，形成多个不规则相互聚集的凋亡小体，使细胞的整体结构消失，凋亡小体呈放射状分散。表明较高浓度甜菜红素可促使HeLa细胞进入程序性死亡，见图 3。

2.5 甜菜红素对HepG2和A549细胞自噬体形成的影响

加入62.5 ppm甜菜红素时，HepG2和A549细胞的胞质内均可见空泡状结构小体，并且空泡内有膜状小泡向内突起，形成多个空泡聚集的自噬小体结构，见图 4A、4B；在加入500 ppm甜菜红素时，HepG2细胞和A549细胞内所产生自噬体的数量明显增多，体积较大，占满整个细胞，见图 4C、4D。表明甜菜红素使HepG2细胞和A549细胞产生自噬体，且随甜菜红素浓度的增加而增加，并且在甜菜红素浓度较高时，自噬体变化加剧。

3 讨论 3.1 甜菜红素对HeLa、HepG2和A549细胞线粒体数量和截表面积的作用

线粒体是真核细胞内的一种特殊的细胞器，通过呼吸复合体的电子传递过程，为细胞活动提供能量。与正常细胞相比，肿瘤细胞代谢方式是以有氧糖酵解为主，可能是由于肿瘤细胞线粒体功能不可逆转的损伤，或肿瘤细胞中线粒体数量的减少所致^[16]。然而，也有研究认为并不是所有的肿瘤细胞都靠无氧糖酵解来获得能量^[19]，有的肿瘤细胞靠氧化磷酸化提供能量，甚至可产生细胞所需能量的80%^[20]。由于肿瘤细胞的过度生长，肿瘤细胞中糖酵解的增强，以致肿瘤细胞线粒体出现功能缺陷、低氧以及某些代谢酶的异常表达，使肿瘤细胞中线粒体数量比正常细胞减少^[21-22]。在生物组织中，不少生物结构往往分布在各种膜性或膜样结构上并占据一定的面积，线粒体的截表面积是描述线粒体结构体积的重要参数，也是形态定量的基本指标^[23]。

本研究中HeLa、HepG2和A549细胞的线粒体都呈现出体积增大、肿胀，截表面积增大。线粒体多呈空泡化，脊膜结构被破坏、断裂、脊膜消失等，表明肿瘤细胞线粒体形态结构是异常的，从而推测其功能也可能是异常的，而这种异常对于肿瘤细胞的代谢与存活可能又是必需的，这与一般肿瘤细胞的线粒体功能是有损伤的看法一致。甜菜红素对肿瘤细胞线粒体形态结构作用的报道较少，当本实验分别加入62.5 ppm、500 ppm浓度甜菜红素时，HeLa、HepG2和A549细胞线粒体内膜结构趋于完整，表明甜菜红素具有修复肿瘤细胞线粒体结构的作用，使肿瘤细胞线粒体的代谢功能趋于正常，从而可能影响肿瘤细胞赖以生存的代谢途径。

3.2 甜菜红素对肿瘤细胞核特征的影响

恶性肿瘤细胞多为不成熟细胞，常见细胞核大而胞质少，核形态各异，呈巨核、双核和多核，并且形态多畸形，细胞核透明度增强，核仁体积增大、数目增多^[24-26]。本实验观察肿瘤细胞核的特征与上述报道一致。然而，加入甜菜红素后HeLa、HepG2和A549细胞核均出现明显的核浓缩和核分裂相，表明甜菜红素导致了肿瘤细胞核的破裂和坏死。

3.3 甜菜红素对肿瘤细胞凋亡小体和自噬体形成的作用

细胞凋亡是生物体细胞的主动消亡过程, 是多细胞有机体调控机体发育、控制细胞衰老、维持内环境稳定的重要机制^[27]。自噬是细胞对营养缺乏、氧化应激、感染等外源性刺激产生的有效反应，可以作为一种防御机制清除胞质内受损的细胞器和大分子物质，保护受损的细胞，同时它作为一种细胞死亡程序诱导细胞主动性死亡（Ⅱ型程序性死亡）^[18]。

在本研究中，加入500 ppm甜菜红素时，在HeLa细胞和A549细胞都有凋亡小体形成，表明甜菜红素影响了HeLa细胞和A549细胞的基因控制，使细胞分解加剧而进入程序性死亡^[28]。而在HepG2细胞和A549细胞，在胞质内形成了大量的“自噬体”空泡，表明甜菜红素对细胞已造成了损伤，会影响到细胞的存活^[29-30]。凋亡小体和自噬体都是细胞的退行性病理变化，都会导致细胞进入死亡程序，本实验肿瘤细胞凋亡小体和自噬体的出现，表明了甜菜红素对肿瘤细胞的伤害。

综上所述，加入0、62.5和500 ppm甜菜红素培养HeLa、HepG2和A549细胞，通过透射电子显微镜观察，甜菜红素可使HeLa、HepG2和A549细胞线粒体数量明显增加，截表面积和体积显著变小；线粒体趋于内膜完整、形态结构恢复；细胞核破裂、固缩和坏死；肿瘤细胞出现凋亡小体或自噬体，可促进肿瘤细胞核的坏死和细胞死亡。