2016, Vol. 43文章信息
- 阿帕替尼联合紫杉醇不同时序给药治疗肺癌的实验
- Experiment of Different Administration Sequences of Apatinib and Paclitaxel on Lung Cancer
- 肿瘤防治研究, 2016, 43(7): 560-565
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2016, 43(7): 560-565
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2016.07.004
- 收稿日期: 2015-10-13
- 修回日期: 2016-01-01
引用本文 |
肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其五年生存率仅为20%[1]。随着对肿瘤治疗研究的不断深入，人们发现抗血管生成治疗能增强化疗药物的疗效[2]，单药治疗远不如联合用药的疗效显著，不同时序给药也会获得不同的治疗效果[3]；因此，两者联合使用的治疗模式已经广泛运用于多种恶性肿瘤的一线治疗[4]。小分子酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸阿帕替尼，经研究证实，可抑制多种肿瘤细胞的生长[5]同样其单用远不如联合化疗的疗效显著，但如何联合化疗尚无定论。本研究观察阿帕替尼联合细胞周期特异性药物紫杉醇不同时序给药对肺癌的抗肿瘤效应，探索最佳的联合用药方式。
1 材料与方法 1.1 实验动物及细胞株BALB/c-nu小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司，4~5周龄，雌性，体质量16~18 g，饲养于SPF级动物室。人肺癌A549细胞株传代培养于RPMI 1640培养液中（37℃、5%CO2）。
1.2 药物和主要试剂甲磺酸阿帕替尼片（商品名：艾坦，apatinib），每片0.425 g，国药准字：H20140105，由江苏恒瑞医药股份有限公司提供。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自美国罗氏公司。鼠抗人CD31单克隆抗体：购自美国RayBiotech公司。VEGFR-2 ELISA试剂盒购自美国Bender生物公司。
1.2.1 肺腺癌A549动物模型建立及实验分组调整细胞浓度为1×107个每毫升，于小鼠右腿皮下接种每只0.1 ml。待肿瘤长至100~300 mm3，将小鼠随机分为6组，每组15只，行0.9%氯化钠溶液或紫杉醇腹腔注射及阿帕替尼口服给药，见图 1。A：0.9%氯化钠溶液组：0.9%NS, d1~8。B：单用阿帕替尼组：阿帕替尼，200 mg/(kg·d), d1~7。C：单用紫杉醇组：紫杉醇10 mg/(kg·d), d1。D：联合用药组1（C1组）：紫杉醇10 mg/(kg·d) d1，阿帕替尼200 mg/(kg·d), d2~8。E：联合用药组2（即同时用药组，C2组）：紫杉醇10 mg/(kg·d)，d1，阿帕替尼200 mg/(kg·d), d1~7。F：联合用药组3（C3组）：阿帕替尼200 mg/(kg·d), d1~7；紫杉醇10 mg/(kg·d), d8。开始治疗第一天为d1。隔日观察记录肿瘤的最长径和最短径，称量裸鼠体质量。治疗结束次日随机处死6只，眼球取血（行ELISA法检验），完整剖离瘤块（行免疫组织化学法检验）。每组随机取3只行小动物PET-CT，剩余小鼠继续观察至19天。
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| Combined group 1(C1 group): PTX, d1+APa, d2-8; Combined group 2(C2 group): PTX, d1+APa, d1-7; Combined group 3(C3 group): APa, d1-7+ PTX, d8 图 1 阿帕替尼与紫杉醇不同时序给药联合方式 Figure 1 Apatinib(APa) combined with paclitaxel(PTX) at different sequential dosing |
观察各组裸鼠的进食及一般状况，如饮食、活动、精神状态等。每两天测量肿瘤的最长径（a）、最短径（b）。肿瘤体积V=ab2/2。观察19天，绘制肿瘤生长曲线。体积抑瘤率=（平均体积对照组瘤体-平均体积实验组瘤体）/平均体积对照组瘤体×100%。
1.2.3 免疫组织化学染色剥离的肿瘤组织用甲醛固定、石蜡包埋，常规行HE染色，切片，采用Envision法行免疫组织化学染色，检测肿瘤组织中CD31的表达情况。按试剂盒说明操作，各组标本同一批染色，以PBS代替一抗作阴性对照，进行常规组织病理学检测。血管计数参照Weinder等报道的方法[6]。
1.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡按照TUNEL试剂盒说明书操作，用PBS代替TUNEL反应液作阴性对照。镜下观察染色切片，400倍视野下随机选取5个癌细胞区，以细胞核染成棕黄色者为凋亡细胞，计数并比较凋亡细胞数。
1.2.5 ELISA法实验采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定小鼠血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR-2)的水平。操作严格按试剂盒说明进行。用酶标仪测定结果，检测波长为450 nm。颜色的深浅与样品中VEGFR-2的浓度呈正相关。
1.2.6 PET-CT扫描治疗结束次日，每组随机取三只，前一晚禁食，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉满意后，自尾静脉注射造影剂（18F-FDG 150μCi），40 min后行小动物PET/CT（Siemens，Inveon）扫描，采集图像后，用2D FBP重建。获得衰减校正后荷瘤裸鼠体内18F-FDG分布融合图像，在肿瘤部位勾画感兴趣区域，测定SUV值。
1.3 统计学方法采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以x±s表示，多组间均数比较采用F检验，均数间的两两比较采用LSD（方差齐时）或Dunnett’S T3法（方差不齐时），以P < 0.05为差异有统计学意义。多个时间点组间对比采用双因素方差分析，同一时间点组间对比采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 荷瘤裸小鼠的一般情况观察结果用药组小鼠肿瘤的生长均不同程度受到抑制。0.9%氯化钠溶液组、单用阿帕替尼组一般情况尚可，饮食、饮水、大便正常，未出现消瘦、皮下脂肪减少。单用紫衫醇组、所有联合用药组均一过性出现消瘦，精神差，大便含较多黏液，特别是紫杉醇与阿帕替尼同一天用药后2~3天更明显。但整个实验过程中，小鼠均能耐受，未发生裸鼠死亡事件。
2.2 肿瘤生长情况通过荷瘤鼠肿瘤生长曲线可以看出：0.9%氯化钠溶液组肿瘤生长明显比其余各组更快（均P < 0.001）；联合用药组2较单用紫杉醇组肿瘤体积增长更慢，差异具有统计学意义（P=0.011）；联合用药组1、3与单独紫杉醇组相比（PC1-PTX=0.14, PC3-PTX=0.11）；单独阿帕替尼与三个联合用药组相比（PC1-Apa=0.66, PC2-Apa=0.17, PC3-Apa=0.56）、单独阿帕替尼与单独紫杉醇组相比（P=0.29）、三个联合用药组之间相比（PC1-2=0.25, PC2-3=0.31, PC1-3=0.88），差异均无统计学意义（P > 0.05）。但仍可以从瘤生长曲线上看出联合用药组2比其余各组更强的抑制肿瘤作用，见图 2。0.9%氯化钠溶液组的肿瘤体积及抑瘤率与其余各组比较，差异均有统计学意义（P < 0.001），三个联合用药组的抑瘤率均比单用紫杉醇组更高（PC1-PTX=0.02, PC2-PTX < 0.01, PC3-PTX=0.02）。三个联合用药组之间的肿瘤体积及抑瘤率比较，差异无统计学意义（PC1-2=0.14, PC2-3=0.14, PC1-3=0.99），但仍可从数值上看出，联合用药组2肿瘤抑制率均较其余四个用药组更高，见表 1。
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| 图 2 各组荷瘤裸小鼠肿瘤生长曲线 Figure 2 Tumor growth curves of each BALB/c-nu mice group |
CD31阳性细胞被染成棕色或棕黄色，散布于肿瘤细胞中，见图 3A。联合用药组2微血管计数结果最少，除与联合用药组3比较，差异无统计学意义（P=0.408），与其余各组比较，差异均有统计学意义（PC2-0.9%氯化钠溶液 < 0.001, PC2-APa=0.013, PC2-PTX=0.001, PC2-C1=0.048），单用阿帕替尼组、单用紫杉醇组、联合用药组1三组间比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05），见图 3B。
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| A: immunohistochemical analysis of CD31 expression (×400); B: the statistical figure of the microvessel counts; *: P < 0.05, compared with combined group 2(C2 group); C1, C2, C3: combination group 1, 2, 3 图 3 免疫组织化学法检测各组微血管计数 Figure 3 Microvessel counts detected by immunohistochemical method |
细胞凋亡阳性细胞光镜下表现为胞膜或胞质呈淡黄色或黄褐色颗粒状染色。0.9%氯化钠溶液组凋亡细胞数最少，与其余各组比较，差异具有统计学意义（均P < 0.01）；联合用药组2凋亡细胞数最多，较其余各组，差异具有统计学意义（均P < 0.01）；单用紫杉醇组与单用阿帕替尼组两者相比，差异无统计学意义（P=0.55），但两者分别与三个联合用药组比较，凋亡细胞数较少，差异均具有统计学意义（均P < 0.01）；联合用药组1、3之间相比，差异无统计学意义（P=0.92），见图 4。
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| A: TUNEL assay of cell apoptosis (×400); B: the statistical figure of cell apoptosis; *: P < 0.01, compared with control group; **: P < 0.01, compared with control group, APa group, PTX group, C1 group and C3 group 图 4 Tunel法检测肿瘤组织细胞凋亡及其统计图 Figure 4 Tumor cells apoptosis detected by TUNEL assay and its statistical figure |
0.9%氯化钠溶液组VEGFR-2水平明显高于其余5组，其次是单用紫杉醇组，联合用药组2 VEGFR-2水平最低，除联合用药组1与联合用药组3之间比较差异无统计学意义外（P=0.15），其余各组间比较，差异均有统计学意义（均P < 0.01），见表 2。
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小鼠行PET-CT扫描测定其SUV值，其中0.9%氯化钠溶液组SUV值最高，联合用药组2最低（PC2-0.9%氯化钠溶液 < 0.01, PC2-APa < 0.01, PC2-PTX=0.015, PC2-C1=0.021, PC2-C3=0.028），单用紫杉醇组分别与联合用药组1（P=0.856）和联合用药组3（P=0.730）比较，差异无统计学意义；联合用药组1与联合用药组3比较，差异无统计学意义（P=0.87），其余各组之间差异均有统计学意义，见图 5。
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| A: the micro PET/CT image of tumor bearing mice; B: statistical figure of SUV value; *: P < 0.01, compared with control group; **: P < 0.05, compared with control, APa, PTX, C1 and C3 groups 图 5 小动物PET/CT小鼠肿瘤图像及各组SUV值统计图 Figure 5 Micro PET/CT image of tumor bearing mice and statistical figure of SUV value in each group |
抗血管分子靶向药物具有肿瘤靶点明确，不良反应少，耐受性好的优点。但单药治疗的效果仍不理想。近年来，抗血管治疗联合放化疗的疗效在大量基础及临床研究中得到肯定，其与单独靶向治疗或者放化疗相比能提高总有效率、临床受益率并降低治疗风险[7-8]。如内皮抑素联合放化疗，能显著提高抑瘤率，增强放化疗敏感度，逆转化疗耐药性[9-10]，并且还发现了如恩度联合化疗[3, 11-12]、吉非替尼联合化疗[13]存在最佳时序的特点。这对我们实验研究起到重要启发和指导作用。
在抗血管生成的众多靶点中，VEGFR-2对肿瘤的发生、发展至关重要[14]，研究证实，VEGFR-2抑制剂阿帕替尼除对胃癌，还对肺癌、肝癌等多种肿瘤细胞的增殖表现出直接抑制作用[5, 15-16]，其与化疗药物联用表现出协同作用并且不会增加不良反应[17]。但目前尚无学者就阿帕替尼与化疗药物具体如何联用能达到最佳的抗肿瘤效应做出研究。所以，我们带着阿帕替尼对肺癌的疗效到底如何，与细胞周期特异性化疗药物、NSCLC化疗中最为常用的药物之一的紫杉醇[18]联用是否会增加彼此的抗肿瘤疗效及不良反应，哪种联合用药方式疗效最佳的疑问，通过多个角度来分析评价不同给药方式对肺癌的疗效。
本研究结果显示，单用阿帕替尼对肺癌有效，对肿瘤细胞的增殖表现为直接抑制作用，联合用药组均较阿帕替尼单药及紫杉醇单药疗效更佳，这与Tian等[5]研究结果一致。本研究还将两者联合用药方式细化，分为不同时序给药，其中特别是联合用药组2（同时用药组），从细胞凋亡、VEGFR-2浓度来看，均比单药组及其他两种联合用药组更有效；联合用药组2 MVD-CD31表达最低，除与联合用药组3外，与其余各组均有统计学意义。虽然联合用药组间抑瘤率差异无统计学意义，但是单从数值及生长曲线走形上看，仍提示同时用药组疗效有最佳趋势，其肿瘤体积增长较其余五组更为缓慢。此外，我们还采用小动物PET/CT扫描，获得病理生理及形态结构变化的融合图像，得出0.9%氯化钠溶液组SUV值最高，同时组SUV值最低，再次说明了同时用药组效果最佳。但是同时用药组也出现了消瘦，精神差，大便含较多黏液等急性不良反应。但这些不良反应为一过性，且可以预见，小鼠尚能耐受。
有研究认为阿帕替尼对肝癌细胞表现出直接抑制作用，程度与细胞本身VEGFR-2表达水平有关，其机制主要是通过抑制肿瘤血管生成、阻滞细胞周期进程，抑制增殖通路活化发挥作用[19]。本研究中，单用阿帕替尼对肺癌有效，也能使细胞发生凋亡，我们猜想阿帕替尼可能自身有促进细胞凋亡的作用，或者通过下调VEGFR-2，抑制了肿瘤血管的生成，肿瘤缺氧也可能促使肿瘤细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的生长。目前对两者联用增效机制尚不清楚。有研究显示化疗药物如吉西他滨等可以短暂引起VEGF下降后随即又升高，故于化疗药物使用后或同时使用抗血管生成药物可降低化疗所致的VEGF上调所产生的作用，可能出现更好的治疗效果[20]。研究证实：所有肺癌（包括NSCLC和SCLC）都异常表达VEGF[21-22]，顺铂等化疗药物也可诱导VEGF的表达[23]。我们推测，紫杉醇可能也有类似的作用。紫杉醇化疗后使肿瘤负荷降低，肿瘤细胞可能反馈性地使VEGF信号表达增强，同时使用VEGFR-2抑制剂，持续抑制VEGFR-2的浓度上调，使VEGF虽上调却无法发挥作用，降低循环内皮细胞产生，促进肿瘤细胞凋亡，最终减少肿瘤血管生成，从而达到更好的抗肿瘤疗效。因此该治疗时序可能产生更优的抗肿瘤效果。这与内皮抑素等抗血管药物时间窗的理论存在差异，我们猜测可能阿帕替尼系小分子抗血管药物，其作用靶点也与内皮抑素等不同，其与化疗药物联用彼此增效的机制也就不同。而本实验中的结果也支持我们的猜想。
综上所述，阿帕替尼对肺癌治疗有效，联合用药疗效较单药更佳，其中以同时用药组疗效最好。所以，随着对新型分子靶向药物阿帕替尼研究地不断深入，探求阿帕替尼更多的适应证及最佳的联合用药方式及其机制将对肿瘤临床治疗带来更大的希望，这也是我们当前研究的方向。
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