0 引言

喉癌是耳鼻喉科常见的恶性肿瘤，在头颈部恶性肿瘤中发病率较高。淋巴结转移是喉癌死亡率居高不下的主要原因，淋巴结转移有赖于新生淋巴管的生成，VEGF-C在多种肿瘤淋巴管生成及淋巴结转移中起到至关重要的作用，然而对VEGF-C在肿瘤环境中表达的调节机制，及其对肿瘤新生淋巴管的作用尚未完全阐明。最近研究表明，SIX1、TGF-β能够共同作用促进多种肿瘤细胞VEGF-C的表达，进一步促进肿瘤淋巴管的生成及淋巴结转移。但其具体作用机制尚不明确，尤其是在喉鳞癌中的表达及相互作用尚未见报道。本研究通过原代细胞培养，对喉鳞癌细胞中SIX1、TGF-β和VEGF-C蛋白及mRNA的表达进行了检测，旨在探讨三种蛋白在喉鳞癌淋巴转移中的作用关系，为临床诊治提供理论参考。

1 材料与方法 1.1 材料

兔抗人SIX1多克隆抗体（博士德生物工程有限公司），工作浓度为1:70。兔抗人TGF-β多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），工作浓度均为1:50。兔抗人VEGF-C蛋白多克隆抗体（北京奥维亚生物技术有限公司），工作浓度为1:50。SIX1和TGF-β转染试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 原代细胞培养、转染及分组

术中留取新鲜人喉鳞状细胞癌组织标本，置4℃、0.9%氯化钠溶液中保存，标本转移至实验室超净工作台中进行如下无菌处理，去除肿瘤周围非瘤体组织及瘤体中坏死部分，留取正常瘤体组织，置于400~600 u/ml庆大霉素中杀菌处理15 min，0.9%氯化钠溶液冲洗两次，小剪刀尽量将组织块剪碎，400~600 u/ml庆大霉素冲洗两次，0.9%氯化钠溶液冲洗两次，加入Ⅰ型胶原酶常温消化1 h，每10 min吹打一次，0.9%氯化钠溶液冲洗两次，加入DMEM培养液（含20%胎牛血清），吹打并接种于6孔板，培养箱中37℃培养24~48 h后，胰蛋白酶消化去除接种细胞中纤维细胞等其他杂质细胞（依据肿瘤细胞同纤维细胞等杂质细胞被胰蛋白酶消化脱离培养瓶底壁的时间不同）。反复消化处理直至将杂质细胞完全去除。待肿瘤细胞稳定传代后，两名副高以上职称病理科医生对细胞进行鉴定，并确认为肿瘤细胞后，用于实验。

待细胞稳定传代后，利用基因干扰技术，分别沉默人喉鳞癌细胞内SIX1、TGF-β及SIX1+TGF-β基因的表达，制备SIX1、TGF-β及SIX1+TGF-β靶向siRNA转染至喉鳞癌细胞。具体步骤如下：在6孔板中接种喉鳞癌细胞，3×10⁵个细胞每孔，加入2 ml完全培养液，置CO₂培养箱中37℃培养过夜。待细胞长到50%~80%单层时，在无菌离心管中配制溶液A（2 μg待转染的超纯DNA稀释到100 μl无血清培养液中）和溶液B（20μl Lipofectamine稀释到100 μl无血清培养液中），混合溶液A和B，轻轻摇匀，室温放置30 min。用2 ml无血清培养液轻轻洗涤细胞，加入0.8 ml无血清培养液/孔，将脂质体复合物滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，置CO₂培养箱中37℃孵育24 h。用完全培养液替换转染液，继续培养。48 h后用RT-PCR方法对SIX1mRNA、TGF-βmRNA及SIX1+TGF-β的表达进行检测，确定转染成功后，将实验细胞分为5组：未转染组（A组）、转染空载体组（B组）、SIX1-siRNA组（C组）、TGFβ-siRNA组（D组）、SIX1+TGF-β-siRNA组（E组），常规培养、扩增并收集细胞，待用，用人血管内皮细胞HUVEC作对照。

1.2.2 细胞爬片免疫荧光检测SIX1、TGF-β和VEGF-C蛋白的表达

将人喉鳞癌细胞用DMEM培养液配成1×10⁵个细胞每毫升悬液，向6孔培养板内放置已高压灭菌的玻璃片，向每孔内的玻璃片上滴加一滴上述悬液，37℃常氧条件下培养4ｈ，倒置显微镜下观察玻璃片上细胞大部分已贴壁，向每孔内加DMEM培养液约1 ml 。继续培养24ｈ，吸出孔内原培养液，PBS冲洗一次，甲醛固定10 min，PBS洗两次，每次5 min。取出爬片，免疫荧光常规染色。（具体步骤参照试剂盒说明）。结果判断采用双评分半定量法进行综合评分，荧光显微镜高倍视野下根据细胞绿色荧光强度和阳性细胞所占比例综合判定。荧光强度评分标准为：无荧光或极弱的可疑荧光记0分；荧光较弱，但清楚可见记1分；荧光明亮记2分；荧光闪亮记3分。阳性细胞所占比例评定标准：阳性细胞率<25%记0分，25%~50%记1分，>50%~75%记2分，>75%记3分。两种评分相加得出综合得分，0~1分结果为阴性（-），2分结果为弱阳性（+），3~4分结果为阳性（++），5~6分结果为强阳性（+++）。

1.2.3 Western blot检测人喉鳞癌细胞SIX1、TGF-β和VEGF-C蛋白的表达

收取各组细胞，进行Western blot检测，具体步骤如下：提取细胞总蛋白，测定各组蛋白的浓度，点样（12%分离胶和4%浓缩胶），每个样本总蛋白上样量为60 μg进行电泳，加入预染蛋白Marker，将样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将目的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；将膜经5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h，期间轻轻摇动，之后用TBST溶液清洗3次，每次10 min；将转印膜放入杂交袋内，加入TBST稀释一抗，（SIX1 1:70，TGF-β 1:50，VEGF-C 1:50稀释），封口，4℃静置过夜。用TBST洗膜3次，每次5 min，将膜放入杂交袋内，加入HRP-山羊抗兔IgG（TBST 1:1 000稀释），封口，室温反应1 h。取出转印膜，TBST洗膜3次，每次10 min。进行ECL显色反应。

1.2.4 RT-PCR检测各组人喉鳞癌细胞SIX1、TGF-β和VEGF-C mRNA水平

用TRIzol提取总RNA，紫外分光光度计测样品浓度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，反转录合成cDNA，取反转录产物2 μl行PCR反应。SIX1：上游引物：5′-CCAGCTCAGAAGAGGAATT-3′，下游引物：5′-CACGCCAGGAGCTCAAACT-3′，产物大小250 bp，退火温度55.7℃；TGF-β：上游引物：5′-CTGTAATTCTGCTGTAATA-3′，下游引物：5′-GGCTTAGTATTCTGGGAAA-3 ′ ，产物大小296bp ，退火温度57.7℃；VEGF-C：上游引物：5′-CCGCGACAAACACCTTCTTTAA-3′，下游引物：5′-CACATTATAATACAGAGAT-3′，产物大小272 bp，退火温度56.6℃。反应条件：94℃变性1 min，55℃复性1 min，72℃延伸1 min，32个循环，最后72℃延伸10 min。产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶图像分析系统分析，以目的基因与GAPDH mRNA电泳条带的荧光强度作为目的基因的相对表达量。

1.3 统计学方法

统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用两独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组人喉鳞癌细胞中SIX1、TGF-β和VEGF-C蛋白的表达

免疫荧光结果显示，未转染组（A组）、转染空载体组（B组）间SIX1、TGF-β和VEGF-C蛋白的表达量无明显差异；同未转染组（A组）相比，SIX1-siRNA组（C组）细胞在SIX1表达降低的同时出现了VEGF-C表达的降低，TGF-β的表达无明显变化；TGF-β-siRNA组（D组）在TGF-β表达降低的同时也出现了VEGF-C表达的降低，SIX1的表达无明显变化。同SIX1-siRNA组（C组）及TGFβ-siRNA组（D组）相比，SIX1+TGF-β-siRNA组（E组）VEGF-C的表达无明显变化，未出现进一步降低，见图 1。

Western blot同免疫荧光结果相同，A、B组间SIX1、TGF-β和VEGF-C三种蛋白的表达量差异无统计学意义；同A组相比，C组细胞在SIX1表达降低的同时出现了VEGF-C表达的降低（P=0.01），此时TGF-β蛋白的表达无明显变化（P=0.92）；D组在TGF-β表达降低的同时也出现了VEGF-C表达的降低（P<0.01），此时SIX1蛋白的表达无明显变化（P=0.95）。同C、D组相比，E组VEGF-C的表达无明显变化，未出现进一步降低，见表 1。

2.2 各组人喉鳞癌细胞中SIX1、TGF-β和VEGF-CmRNA 的表达情况

RT-PCR结果显示，A、B组比较SIX1、TGF-β和VEGF-C mRNA的表达量无明显差异，差异无统计学意义（P>0.05）；同A、B组相比，C组细胞在SIX1 mRNA表达降低的同时出现了VEGF-CmRNA表达的降低，此时TGF-β mRNA的表达无明显变化；D组在TGF-β mRNA表达降低的同时也出现了VEGF-C mRNA表达的降低，此时SIX1mRNA的表达无明显变化。E组在SIX1 mRNA、TGF-β mRNA表达降低的同时也出现了VEGF-CmRNA表达的降低，同C、D组相比，E组VEGF-C的表达未出现进一步降低，见图 2。

3 讨论

肿瘤的不良预后同其新生淋巴管的生成及淋巴结转移密切相关，新生淋巴管生成有赖于肿瘤微环境中各种生长因子的存在，如IGF（insulin-likegrowth factor），HGF（hepatocyte growth factor）以及PDGF-B（platelet-derived growth factor-B）等，在众多因子之中，VEGF-C是现在研究证明促进肿瘤新生淋巴管生成的最重要因素^[1]，VEGF-C又被称为淋巴管生长因子，是一种分泌性多肽，可由血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞、肿瘤细胞及其间质细胞产生和分泌，通过自分泌或者旁分泌方式发挥生物学作用。VEGFR-3是VEGF-C的特异性受体，主要存在于淋巴管内皮细胞，VEGFR-3能够直接介导VEGF-C的促肿瘤新生淋巴管生成作用^[2]，在肿瘤细胞淋巴结转移中起着极其重要的作用。

转化生长因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）是一种相对分子质量约为25 kDa的细胞因子，目前发现，TGF-β在哺乳动物中存在3种异构体，分别为TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3。TGF-β1是其中含量最丰富、生物学功能最多的亚型，其生物学活性的发挥主要通过以下三种方式进行：Smad通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）通路和Wnt通路。在肿瘤发生、发展的进程中，TGF-β1起到了促进肿瘤血管生成、肿瘤细胞浸润、转移以及免疫抑制等多种作用^[3]。在肺癌、大肠癌、乳腺癌、口腔癌等多种肿瘤组织中均存在TGF-β的高表达，其表达强度与肿瘤的分化、淋巴转移及预后密切相关^[4-8]。

TGF-β可能对淋巴管的生成起着双重作用，在一些类型的肿瘤细胞中TGF-β能够上调VEGF的表达^[9]，进而促进淋巴管的生成。相反，TGF-β能够下调肿瘤组织中淋巴内皮细胞表面VEGFR-3的表达，进而抑制淋巴内皮细胞的功能，抑制淋巴管的生成^[10-11]。综上，TGF-β对不同肿瘤新生淋巴管生成的最终作用尚未明确。

SIX1（sine oculis homeobox homolog 1）基因编码产物属于复合同源异型蛋白家族一员，为一种转录调节蛋白，能够调节其下游编码CyclinD1、Cyclin A1及Ezrin等一系列基因的表达。SIX1在多种恶性肿瘤组织中常表现为过表达，其表达强度同肿瘤的不良预后密切相关，这些肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肝细胞癌等^[12-14]。最近研究证明，SIX1能够通过增强TGF-β的Smad途径促进肿瘤细胞中VEGF-C的表达，进而发挥其促进淋巴结转移功能^[15]。

本研究在沉默喉鳞癌细胞中TGF-β之后，同对照组相比SIX1表达无明显变化，但此时却出现了VEGF-C表达的降低。提示，在人喉鳞癌细胞中SIX1并不能单独作用促进喉癌细胞中VEGF-C的表达。此结果同Wang等在乳腺癌中的研究结果相同^[16]。

同样，沉默喉鳞癌细胞中SIX1之后，同对照组相比TGF-β表达无明显变化，但此时也出现了VEGF-C表达的降低。提示，在人喉鳞癌细胞中TGF-β并不能单独作用促进喉鳞癌细胞中VEGF-C的表达。Gaspar等在胰腺癌细胞系PANC-1中有相似的研究报道，TGF-β有调节VEGF-C表达的作用，但其单独作用并不能明显增加VEGF-C的表达^[17]。

同分别干扰喉鳞癌细胞中SIX1及TGF-β相比，本研究在同时干扰喉鳞癌细胞中SIX1和TGF-β之后，并未出现VEGF-C表达的进一步降低，提示喉鳞癌中VEGF-C的表达有赖于SIX1、TGF-β的共同作用。Liu等^[15]研究发现，在宫颈癌中，SIX1、TGF-β均不能单独作用促进VEGF-C的表达，肿瘤组织中VEGF-C的表达有赖于SIX1、TGF-β的共同作用。在不同的肿瘤细胞中，TGF-β对VEGF-C的表达起到增强作用还是抑制作用，取决于肿瘤细胞SIX1的表达水平，SIX1的高表达是TGF-β对VEGF-C表达起到增强作用的必要条件之一。

本研究未转染组喉鳞癌细胞中SIX1和TGF-β表达增高的同时出现了VEGF-C表达的增强。提示，在人喉鳞癌细胞中SIX1和TGF-β能够共同作用诱导VEGF-C的表达。推测，在人喉鳞癌细胞中高表达的SIX1能通过增强TGF-β的Smad途径促进VEGF-C的表达，高表达的VEGF-C不但能够促进淋巴管的生成，而且抵消了TGF-β对淋巴管生成的负面作用，进而促进喉鳞癌淋巴结的转移。提示，在SIX1表达阴性或弱阳性喉鳞癌患者中，肿瘤细胞内SIX1表达的增强能够预示肿瘤淋巴转移风险的升高和不良预后。同样，阻断SIX1表达阳性喉鳞癌患者中TGF-β信号转导途径，能够降低患者淋巴转移的风险，提高患者的治愈率。