2017, Vol. 44文章信息
- IL-4/IL-4R对肝细胞癌生物学行为的影响及潜在的作用机制
- Effect of IL-4/IL-4R on Biological Behavior of Hepatocellular Carcinoma and Its Underlying Mechanism
- 肿瘤防治研究, 2017, 44(6): 392-397
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2017, 44(6): 392-397
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2017.16.1533
- 收稿日期: 2016-12-09
- 修回日期: 2017-03-12
引用本文 |
2. 330006 南昌，南昌大学医学部研究生院
2. Graduate School of Medicine, Nanchang University, Nanchang 330006, China
据GLOBOCAN 2012统计，肝癌在癌症死亡率中排名第二[1]。虽然目前治疗肝癌的方法很多，如手术、介入、射频消融、化疗、分子靶向治疗等，但是对于晚期肝癌，尤其是肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）仍让很多临床工作者束手无策，因此寻求新的治疗方法迫在眉睫。近年来许多研究显示白细胞介素-4（Interleukin-4, IL-4）可通过影响肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤的进展和转移[2-4]。此外肿瘤细胞表面上调的IL-4R和微环境中高表达的细胞因子还与肿瘤的分期、分级息息相关[5]。这些都提示我们IL-4/IL-4R似乎参与癌症的发生、发展。
本研究前期发现芹菜素可以促进HCC细胞系（Huh7）的凋亡，同时还将细胞阻滞于G2/M期。通过基因芯片和Western blot发现，芹菜素抑制HCC的生物学活性与下调白介素-4受体（Interleukin-4 receptor, IL-4R）有关[6]。且目前就IL-4/IL-4R和HCC的关系鲜有报道，因此本文主要探索IL-4/IL-4R对HCC细胞生物学活性的影响及潜在的分子机制。
1 材料与方法 1.1 细胞培养实验中所用Huh7细胞株购于中国科学院细胞库（上海，中国）。细胞株用含11%胎牛血清（ExCell Bio，南美）的DMEM培养液（Solarbio，上海）培养，除此之外加入30 ng/ml IL-4（PeproTech，美国）于37℃、5%CO2培养箱中。
1.2 细胞转染小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）设计并购买于上海吉玛公司，包括用于阴性对照的空载片段：sense 5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’, antisense 5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’，三条干扰IL-4R基因的目的片段：IL-4R siRNA1, sense 5’-CAG UGC GGA UAA CUA UAC ATT-3’, antisense 5’-UGU AUA GUU AUC CGC ACU GTT-3’；IL-4R siRNA2, sense 5’-CUG ACA AUU ACC UGU AUA ATT-3’, antisense5’-UUA UAC AGG UAA UUG UCA GTT-3’；IL-4R siRNA3, sense5’-CAG UGC UAU AAC ACC ACC UTT-3’, antisense5’-AGG UGG UGU UAU AGC ACU GTT-3’。转染前一天将适量细胞接种至六孔板中，转染时将Lipofectamine® 2000转染试剂（Invitrogen, 美国）、三个目的片段和空载片段分别加至无血清无双抗的DMEM中，然后将混有转染试剂和siRNA的培养液混合，最后加入细胞中。
1.3 实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）用TRIzol（全式金，北京）裂解细胞并抽提RNA，并将反转录试剂盒（TaKaRa，日本）反转录成的cDNA、IL-4R的上游引物：5’-GGG CGC GCA GAT AAT TAA AGA TT-3’，下游引物：5’-AAG CCA CCC CAT TGG GAG AT-3’（Sangon Biotech，上海）与SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa，日本）中的试剂配制成扩增体系，使用Applied Biosystems 7900 Real-Time PCR System（ABI, 美国）进行扩增。
1.4 Western blot法检测Huh7细胞中相关蛋白表达用裂解缓冲液裂解细胞，并加入抗蛋白酶肽、磷酸酶抑制剂和苯甲基磺酰氟。所得到的蛋白均用BCA蛋白试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）测量蛋白浓度。加入相同浓度的各组细胞总蛋白至10% SDS-聚丙烯酰胺胶中电泳，并转入聚偏氟乙烯（polyvinylidene difluoride, PVDF）膜中。接着封闭2 h，将封闭后的PVDF膜放入一抗溶液中，4℃过夜。然后再置入二抗中孵育1 h，最后曝光，并用Image J软件分析结果。实验中的抗体分别是：抗β-actin和抗GAPDH单克隆抗体（Proteintech，武汉），抗IL-4R多克隆抗体（Abcam, 美国），抗Bcl-2、抗Bax和抗Caspase-3多克隆抗体（Proteintech，武汉），抗JAK1、抗p-JAK1、抗STAT6、抗p-STAT6多克隆抗体（Cell Signaling Technology，美国）。含辣根过氧化物酶山羊抗鼠IgG（H+L）、含辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG（H+L）（全式金，北京）。
1.5 CCK8法检测Huh7细胞增殖能力将适量细胞种至96孔板中，并设置5个复孔。第2天转染，并设定转染后为0 h，用10%的CCK8分别测定转染后0、24、48和72 h的吸光度。
1.6 流式细胞学检测细胞凋亡和细胞周期每组收集适量细胞，并用缓冲液重悬成单细胞悬液，再加入Annexin V-FITC及PI，通过流式细胞仪检测各实验组细胞凋亡率。
每组收集适量细胞，提前用70%乙醇固定，测量当天再加入DNA染色液和碘化丙锭溶液，最后通过流式细胞仪检测各实验组细胞周期。
1.7 统计学方法采用SPSS17.0统计软件处理数据。所有数据均为至少进行三次独立实验的平均值和标准差。通过单因素方差分析（ANOVA）和LSD-t检验的多重比较进行统计学分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 siRNA干扰Huh7细胞中IL-4R的表达设计三条siRNA干扰片段（siRNA1、siRNA2、siRNA3）沉默IL-4R，分别用qPCR和Western blot筛选出最佳沉默片段。qPCR结果显示siRNA1（P=0.00022）、siRNA2（P=0.00041）、siRNA3（P=0.00019）均有不同程度的干扰效果。Western blot也得到与qPCR相似的结果（siRNA1: P=0.01、siRNA2: P=0.01、siRNA3: P=0.00042），其中siRNA3的干扰效果最显著，见图 1。
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| A: the relative ratio of IL-4R mRNA to GAPDH in each group; B: the protein expression of IL-4R after transfection in each group; C: the relative ratio of IL-4R protein to β-actin after transfection in each group; **: P < 0.01, compared with Control siRNA group 图 1 转染干扰片段对各组细胞中IL-4R mRNA和蛋白表达水平的影响 Figure 1 Effect of siRNA interference on mRNA and protein level of IL-4R in each group |
用CCK8法检测IL-4/IL-4R对Huh7细胞增殖的影响，发现加入IL-4后细胞增殖增加（P=0.01），而同样加入IL-4，转染siRNA3后的细胞从第48 h后其吸光度较正常组和空载组显著下降（P=0.00033），见图 2。提示沉默IL-4R可以抑制Huh7细胞的增殖。
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| A: the impact of IL-4 on the proliferation of Huh7 cells was measured by CCK8; B: cell proliferation was detected by CCK8 assay from 0h to 72h after transfection; **: P < 0.01, compared with Control siRNA group 图 2 IL-4/IL-4R对Huh7细胞增殖的影响 Figure 2 Impact of IL-4/IL-4R on proliferation of Huh7 cells |
流式细胞学检测结果显示：相对于正常组和阴性对照组，沉默IL-4R后细胞早期凋亡显著升高（P=0.014），而细胞晚期凋亡各组之间差异并无统计学意义（P=0.108），见图 3。Western blot提示沉默IL-4R后凋亡蛋白Bax（P=0.016）、Caspase-3（P=0.029）的表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2（P=0.003）的表达量下降，见图 3。提示沉默Huh7细胞中的IL-4R表达可以调控凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表达，进而促进肿瘤细胞凋亡。此外，实验证实各组细胞周期分布的差异均无统计学意义（G0/G1期：P=0.677、S期：P=0.139、G2/M期：P=0.855），即IL-4/IL-4R不影响Huh7细胞的周期变化，见图 4。
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| A: the apoptosis of Huh7 cells in each group was tested by flow cytometry; B1: the early apoptosis rates in three groups were depicted in histogram; B2: the late apoptosis rates in three groups were calculated in histogram; C: the protein expression of Bcl-2, Bax, Caspase-3 were tested in each group; D: the graph of relative ratio of tested proteins to β-actin in each group; *: P < 0.05, **: P < 0.01, compared with Control siRNA group 图 3 沉默IL-4R对Huh7细胞凋亡和凋亡蛋白的影响 Figure 3 Influence of IL-4R silencing on apoptosis of Huh7 cells and expression of apoptosis-related proteins |
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| A: cell cycle distribution was monitored by flow cytometry; B: there was no difference in cell cycle distribution among these groups; *:P < 0.05, **: P < 0.01, compared with Control siRNA group 图 4 沉默IL-4R对Huh7细胞周期的影响 Figure 4 Effect of IL-4R silencing on cell cycle of Huh7 cells |
Western blot检测可能的分子机制，发现加入IL-4后并不影响JAK1（P=0.737）、STAT6（P=0.206）总蛋白的变化，却显著上调JAK1（P=0.01）、STAT6（P=0.005）磷酸化蛋白的表达。同样，在各组细胞中加入IL-4时，进一步下调其中一组细胞的IL-4R表达，各组细胞中JAK1（P=0.475）、STAT6（P=0.279）总蛋白表达的差异并无统计学意义，而相对于正常组和阴性对照组，转染siRNA3的细胞中JAK1（P=0.016）、STAT6（P=0.019）的磷酸化水平显著下降，见图 5。
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| A: the effect of IL-4 on signal proteins of JAK1/STAT6 signaling pathway was measured by Western blot; B: after transfecting siRNA3, the expression of JAK1, STAT6, p-JAK1 and p-STAT6 were tested by Western blot; C: after adding IL-4, the relative ratio of tested proteins to tublin were calculated in histogram; D: after transfecting siRNA3, the relative ratio of tested proteins were depicted in histogram; *: P < 0.05, **: P < 0.01, compared with Control siRNA group; 1: Normal; 2: Control siRNA; 3: IL-4R siRNA3 图 5 Western blot法检测JAK1、STAT6、p-JAK1、p-STAT6蛋白的表达 Figure 5 Protein levels of JAK1, STAT6, p-JAK1 and p-STAT6 detected by Western blot |
细胞表面的IL-4R有两种类型:Ⅰ型主要由IL-4Rα链和γC链组成，Ⅱ型受体由IL-4Rα链和IL-13Rα1链构成。其中与IL-4特异性结合的Ⅰ型受体主要参与机体的免疫调节，例如参与抗寄生虫反应、引发超敏反应等。IL-4/IL-4RⅡ型复合物常见于肿瘤中。然而在肿瘤的发生、发展中IL-4/IL-4R所扮演的角色尚无统一定论，在不同类型的肿瘤中其作用可能完全相反。
早在1992年Morisaki等就发现了IL-4/IL-4R可以将胃癌细胞阻滞在G0/G1期，进而抑制细胞增殖[7]。然而近年来有研究显示，在乳腺癌和前列腺癌中，IL-4/IL-4R却可以促进肿瘤细胞的增殖[8-10]。不仅如此，IL-4/IL-4R还可以通过上调抗凋亡蛋白从而抑制乳腺癌和结肠癌细胞的凋亡[11]。通过CCK8、流式细胞学及对凋亡相关蛋白的检测，结果提示IL-4/IL-4R除了可以促进HCC的增殖，还可以通过调节凋亡蛋白Bax、Caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而抑制HCC的凋亡。但并不影响HCC细胞周期的改变。
JAK/STAT信号通路是常见的可以将胞外化学信号和核内DNA的转录联系在一起，调控基因表达，从而影响细胞免疫、增殖、分化、凋亡的纽带通路。由于活化的STATs可以促进下游基因的转录，如c-MYC、CCND1和VEGF，因此参与正常细胞的增殖和生存[12-13]。同样异常激活的JAK/STAT信号通路也参与肿瘤细胞过度生长。有研究显示无论是体内还是体外实验，药物抑制STAT蛋白，或负性调控JAK/STAT信号通路可以抑制肝细胞肝癌的生长[14-16]。Hosoyam和Burt分别在横纹肌肉瘤和恶性间皮瘤中证实，IL4/IL-4R/STAT6轴可以促进肿瘤细胞的增殖[14-16]。同样Bankaitis等也发现，IL-4/IL-4R可以通过调节JAK1/STAT6信号通路，促进上皮细胞性癌细胞的生长[17]。
2012年一项关于霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma, HL）的研究显示，阻滞IL-4/IL-4R/STAT6轴，可以上调Bcl-xL的表达，从而协同化疗促进HL细胞凋亡[18]。另一项关于HCC的研究也证实了，在体外抑制JAK/STAT信号通路可以抑制HCC细胞增殖及促进HCC细胞凋亡[19]。同样在结肠癌中，也发现了IL-4/IL-4R/STAT6参与肿瘤的凋亡和周期[20]。本实验中，我们发现IL-4/IL-4R也参与调节Huh7细胞中JAK1/STAT6信号通路的激活，提示IL-4/IL-4R对HCC的生物学行为可能与JAK1/STAT6密切相关。
综上所述，IL-4/IL-4R可以活化HCC中的JAK1/STAT6信号通路，调节细胞内凋亡、抗凋亡蛋白的表达，最终促进HCC细胞增殖和抑制细胞凋亡。提示IL-4/IL-4R有望成为治疗HCC的新靶点，均有进一步探索的价值。在今后的研究中，我们也将进一步揭示IL-4/IL-4R/JAK1/STAT6信号轴参与调控HCC生物学行为的具体分子机制，并探索是否在体内实验中也得到相同的结果。
| [1] | Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer, 2015, 136(5): E359–86. DOI:10.1002/ijc.29210 |
| [2] | Ruiz-Lafuente N, Alcaraz-García MJ, Sebastián-Ruiz S, et al. IL-4 Up-Regulates MiR-21 and the MiRNAs Hosted in the CLCN5 Gene in Chronic Lymphocytic Leukemia[J].PLoS One, 2015, 10(4): e0124936. DOI:10.1371/journal.pone.0124936 |
| [3] | Aguilar-Hernandez MM, Blunt MD, Dobson R, et al. IL-4 enhances expression and function of surface IgM in CLL cells[J].Blood, 2016, 127(24): 3015–25. DOI:10.1182/blood-2015-11-682906 |
| [4] | König A, Vilsmaier T, Rack B, et al. Determination of Interleukin-4, -5, -6, -8 and -13 in Serum of Patients with Breast Cancer Before Treatment and its Correlation to Circulating Tumor Cells[J].Anticancer Res, 2016, 36(6): 3123–30. |
| [5] | Joshi BH, Leland P, Lababidi S, et al. Interleukin-4 receptor alpha overexpression in human bladder cancer correlates with the pathological grade and stage of the disease[J].Cancer Med, 2014, 3(6): 1615–28. DOI:10.1002/cam4.2014.3.issue-6 |
| [6] | Cai J, Zhao XL, Liu AW, et al. Apigenin inhibits hepatoma cell growth through alteration of gene expression patterns[J].Phytomedicine, 2011, 18(5): 366–73. DOI:10.1016/j.phymed.2010.08.006 |
| [7] | Morisaki T, Yuzuki DH, Lin RT, et al. Interleukin 4 receptor expression and growth inhibition of gastric carcinoma cells by interleukin 4[J].Cancer Res, 1992, 52(2): 6059–65. |
| [8] | Venmar KT, Carter KJ, Hwang DG, et al. IL4 receptor ILR4α regulates metastatic colonization by mammary tumors through multiple signaling pathways[J].Cancer Res, 2014, 74(16): 4329–40. DOI:10.1158/0008-5472.CAN-14-0093 |
| [9] | Venmar KT, Kimmel DW, Cliffel DE, et al. IL4 receptor alpha mediates enhanced glucose and glutamine metabolism to support breast cancer growth[J].Biochim Biophys Acta, 2015, 1853(5): 1219–28. DOI:10.1016/j.bbamcr.2015.02.020 |
| [10] | Roca H, Craig MJ, Ying C, et al. IL-4 induces proliferation in prostate cancer PC3 cells under nutrient-depletion stress through the activation of the JNK-pathway and survivin up-regulation[J].J Cell Biochem, 2012, 113(5): 1569–80. |
| [11] | Todaro M, Lombardo Y, Francipane MG, et al. Apoptosis resistance in epithelial tumors is mediated by tumor-cell-derived interleukin-4[J].Cell Death Differ, 2008, 15(4): 762–72. DOI:10.1038/sj.cdd.4402305 |
| [12] | Vainchenker W, Constantinescu SN. JAK/STAT signaling in hematological malignancies[J].Oncogene, 2013, 32(21): 2601–13. DOI:10.1038/onc.2012.347 |
| [13] | Furqan M, Mukhi N, Lee B, et al. Dysregulation of JAK-STAT pathway in hematological malignancies and JAK inhibitors for clinical application[J].Biomark Res, 2013, 1(1): 5. DOI:10.1186/2050-7771-1-5 |
| [14] | Sethi G, Chatterjee S, Rajendran P, et al. Inhibition of STAT3 dimerization and acetylation by garcinol suppresses the growth of human hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo[J].Mol Cancer, 2014, 13: 66. DOI:10.1186/1476-4598-13-66 |
| [15] | Su JC, Chiang HC, Tseng PH, et al. RFX-1-dependent activation of SHP-1 inhibits STAT3 signaling in hepatocellular carcinoma cells[J].Carcinogenesis, 2014, 35(12): 2807–14. DOI:10.1093/carcin/bgu210 |
| [16] | Su JC, Tseng PH, Wu SH, et al. SC-2001 overcomes STAT3-mediated sorafenib resistance through RFX-1/SHP-1 activation in hepatocellular carcinoma[J].Neoplasia, 2014, 16(7): 595–605. DOI:10.1016/j.neo.2014.06.005 |
| [17] | Bankaitis KV, Fingleton B. Targeting IL4/IL4R for the treatment of epithelial cancer metastasis[J].Clin Exp Metastasis, 2015, 32(8): 847–56. DOI:10.1007/s10585-015-9747-9 |
| [18] | Natoli A, Lupertz R, Merz C, et al. Targeting the IL-4/IL-13 signaling pathway sensitizes Hodgkin lymphoma cells to chemotherapeutic drugs[J].Int J Cancer, 2013, 133(8): 1945–54. DOI:10.1002/ijc.v133.8 |
| [19] | Wilson GS, Tian A, Hebbard L, et al. Tumoricidal effects of the JAK inhibitor Ruxolitinib (INC424) on hepatocellular carcinoma in vitro[J].Cancer Lett, 2013, 341(2): 224–30. DOI:10.1016/j.canlet.2013.08.009 |
| [20] | Li BH, Xu SB, Li F, et al. Stat6 activity-related Th2 cytokine profile and tumor growth advantage of human colorectal cancer cells in vitro and in vivo[J].Cell Signal, 2012, 24(3): 718–25. DOI:10.1016/j.cellsig.2011.11.005 |