2. 四川好医生药业集团有限公司, 四川 成都 610000;
3. 江苏省新型外用及透皮制剂工程技术研究中心, 江苏 常州 213000
2. Sichuan Gooddoctor Pharmaceutical Group Co., Ltd., Chengdu 610000, China;
3. Jiangsu Engineering Research Center for New-Type External and Transdermal Preparations, Changzhou 213000, China
糖尿病是一种严重的全球性健康疾病，预计到2030年，患病人数将达到五亿多，占全球总人口的8.9%[1-2]。糖尿病足作为糖尿病常见的难治性慢性并发症之一，发病率高达25%[3]，其中15%以上的患者随时面临截肢甚至死亡的风险[4-5]。糖尿病足发病机制复杂，是由多种因素共同诱导的。研究显示，长期高糖状态下造成的神经及外周血管病变[6-7]是诱发糖尿病足的主要原因，该病变直接导致患者下肢末端血流不足，感觉缺失，从而更易使患者发生溃疡且难以治愈[8]。
与正常的创伤修复相比，慢性溃疡引起的血管网络受损、过度炎症反应、过高蛋白酶活性与活性氧群阻碍了细胞外基质的沉积与肉芽组织的形成，从而延长了创伤愈合周期[9-10]。随着糖尿病溃疡致病机制研究的深入，近年来相应的治疗策略研究也取得了长足进展，如抑制基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase，MMP) 的表达、促进血管新生、抗炎治疗等。但无论是糖尿病溃疡的发病机制研究，还是其治疗方法的疗效评价研究，都必须依赖糖尿病溃疡动物模型的建立。目前，最为常用的动物模型是鼠类模型，根据模型建立方式的不同，可分为模拟病理因素的动物模型和模拟临床病征的动物模型两大类。本文将分别阐述上述两大类糖尿病溃疡动物模型，并概述近年来相应的治疗进展。
1 模拟病理因素的糖尿病溃疡动物模型糖尿病动物自发病变形成溃疡耗时较长，因此研究者大多通过模拟溃疡病理因素的改变来建模，其中主要包括缺血性动物溃疡模型、神经性病变动物溃疡模型以及感染性动物溃疡模型。目前，最为常用的动物是鼠类，仅少数研究选用猪[11-12]、兔[13-14]等较大型动物。研究者大多采用化学药物如链脲佐菌素 (streptozotocin，STZ) 诱导或者同时结合高脂饲料喂养的方法来进行糖尿病的建模，其中后者建立的糖尿病模型更接近于临床上的Ⅱ型糖尿病。也有研究者直接选用经基因敲除的糖尿病小鼠 (db/db)，其病变程度高，更适用于糖尿病溃疡的研究[15]。然而，溃疡模型建立前高糖病理状态的持续时间及模型的评价方法目前尚无统一标准。
1.1 缺血性动物溃疡模型 1.1.1 血管结扎法下肢末端供血不足是引发糖尿病溃疡的主要诱因。基于此病理机制，研究者可以通过血管结扎、切除手术来模拟后肢缺血状态，从而建立糖尿病溃疡模型。与此同时，联合激光多普勒仪测定下肢血流变化，可以更加客观公正地对模型的缺血状态进行评估，以此来确保建模的成功。Kim等[16]用STZ诱导糖尿病后，对小鼠左侧腹股沟股动脉近端进行结扎，并分离切除腘动脉、股隐动脉等所有分支，成功建立了严重的后肢缺血模型，并用以研究药物对血管的作用机制。此外，血管结扎配合皮肤组织破坏也是模拟糖尿病足的常用方法，该法形成的溃疡面积可控，便于疗效的分析与评价[17-18]。Tong等[19]选用成功诱导糖尿病一周后的Wistar大鼠，并结扎其左后肢股动脉，分离、切除分支。一周后，大鼠腿部血流量降低，然后在其大腿处人为地创建伤口，形成难愈性溃疡模型，用以研究药物促进创面愈合的机制。然而，通过股动脉高位结扎、切除而形成的急性严重缺血坏死病理改变与糖尿病足中以中小动脉病变为主的慢性缺血状态有较大差别。因此，Tam等[20]在大鼠的右侧股动脉远端和腘动脉近端进行了单纯性结扎，并保留其他分支的侧支循环，这种不完全缺血状态与糖尿病慢性病变造成的缺血状态更为接近。
1.1.2 皮肤压迫法糖尿病患者的应激保护功能受损，神经感觉缺失，若长时间承受外在的异常压力会导致局部缺血损伤加重，组织坏死，从而形成压力型溃疡[21-22]。Duscher等[23]选用C57BL/6糖尿病小鼠，利用磁片循环压迫的方法诱导缺血—再灌注损伤，使小鼠自发形成溃疡。研究者首先去除小鼠背部毛发，然后牵拉起背部皮肤，将特定大小的磁片放置在皮肤两侧，每天持续施压12 h，松懈12 h，共循环三次，21 d内根据临床分级指标对自发溃疡的形成程度进行分级[24-25]。这种方法建立的溃疡面积基本与磁片区域相同，便于定量分析。Danigo等[26]同样采用磁片循环压迫法诱导压力型溃疡，用以研究溃疡的发病机制。体内实验结果表明，小鼠灌注损伤部位的炎症和活性氧水平均大幅度提高，损害了血管内皮细胞的正常功能，最终导致组织缺血、缺氧而坏死。除此之外，Cui等[27]采用施加压力的特殊装置，对大鼠下肢进行循环施压，并人为地破坏缺血—再灌注损伤组织，建立了严重的压力型溃疡模型，用以研究糖尿病溃疡的发病机制。然而，压迫法缺少同步血流监测情况，且其单一的缺血病理方式与糖尿病慢性血管病变造成的缺血状态存在一定的差异。
1.2 神经性病变动物溃疡模型外周神经病变导致糖尿病患者足部感知功能丧失，关节畸形，相较于健康者而言，其足部更易因承受过高的压力而形成溃疡[28-29]。Jin等[30]选择Wistar大鼠进行实验，在STZ诱导产生糖尿病一个月的基础上，分离其右侧坐骨神经，一周后大鼠的右后肢形成了自发性溃疡。该方法先使大鼠保持长时间的高血糖状态，产生一定的慢性病理改变；随后分离其坐骨神经，加速大鼠的外周神经病变，使其自发形成溃疡，较好地模拟了糖尿病神经病变的过程。但是，这种建模方式的溃疡自发率低，通常需要结合组织破坏的方法来缩短溃疡发生的时间。总的来说，单纯针对神经病变建立溃疡的模型目前还比较少见。
1.3 感染性动物溃疡模型糖尿病患者的免疫功能受损，与正常的创伤患者相比，糖尿病患者更易受到感染而使病情加重。因此，感染性动物溃疡模型也被作为一种重要的糖尿病溃疡模型[31]。由于大多数伤口感染是由金黄色葡萄球菌引起的，因此研究人员通常会在建模时采用此菌作为感染病原菌。Chhibber等[32]成功建立了BALB/c小鼠的后肢感染模型。他们首先通过四氧嘧啶诱导小鼠产生糖尿病后，对小鼠足部皮下注射耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 悬液，并于感染后的1、3、5、7、9、12 d处死小鼠，将其足部组织匀浆稀释液涂布于琼脂板上进行细菌培养来确保建模成功。Lee等[33]先对STZ诱导的大鼠进行全层皮肤切除，然后于伤口处感染MRSA，成功建立了感染性溃疡模型，延缓了糖尿病溃疡的愈合速度。然而，该类建模方式与糖尿病病理机制的直接关系不大，但可作为一种外界诱发因素，有一定的借鉴价值。
2 模拟临床病征的糖尿病溃疡动物模型此类溃疡模型的建立简单易行，耗时短，可以随时直观地对表皮的新生、迁移及肉芽组织的形成实施观察，便于创面的量化分析，从而进一步开展体内疗效评价。但是，该方法建立的皮肤溃疡模型仅仅是模仿了糖尿病足的外在状态，并非自发性溃疡，因此严格说，这种方式形成的溃疡仅仅导致创面愈合延迟，而非真正的慢性难愈创面，不适用于糖尿病溃疡的机制研究。
2.1 皮肤全层切除模型该模型应用最为广泛，但对糖尿病动物病变程度要求较高，因为病程短的糖尿病模型还没有发生慢性病变，在进行皮肤全层切除后，形成的溃疡在愈合速度上与正常创伤相比差别不大。Michaels等[15]在三种不同类型糖尿病模型鼠的背部进行全层皮肤切除以比较伤口的愈合情况。体内实验结果表明，经基因敲除的db/db小鼠皮肤受损最为严重，愈合最慢，而经STZ诱导的糖尿病小鼠溃疡愈合速度最快，可见，db/db小鼠的慢性病变程度最高，更适用于建立慢性溃疡模型。Randeria等[34]使用活检穿孔器在12周龄的db/db小鼠背部进行特定面积的全层皮肤切除建立溃疡模型，并结合Image J软件进行创面愈合分析，以评价疗效。为了更真实地模拟糖尿病溃疡的临床表现，Kato等[35]在成功诱导糖尿病8周后的SD大鼠足部进行了全层皮肤切除，成功建立了溃疡模型。该法建立的溃疡位于缺血严重的下肢，其特征更接近于自发的溃疡形态。
2.2 环形夹板模型单纯采用啮齿类动物 (鼠类) 的全层皮肤切除模型进行慢性溃疡的相关研究仍存在很多的局限性[36-37]。研究表明，人类的伤口愈合主要得益于新生组织的再上皮化[38]，而啮齿类动物皮肤松弛，其伤口的愈合则主要源于皮肤的收缩而非组织上皮化过程，导致可变性大，难以控制。为了更好地模拟人类创面愈合的过程，从而精确评估伤口愈合情况，Chereddy等[39]选用7~8周龄的db/db小鼠，在其背部建立4个全层切除伤口，然后用尼龙线将0.5 mm厚的环形硅胶夹板固定在伤口周围，防止伤口收缩，以便更客观地评价创面愈合情况。Wang等[40]研究发现，无环形夹板的伤口由于前期皮肤收缩的影响，其溃疡愈合速度明显快于固定有环形夹板的伤口，无法客观反映溃疡的愈合情况。因此，环形夹板模型可更真实地还原人类伤口的愈合过程。
2.3 烫伤模型糖尿病神经性病变导致的下肢末端感觉缺失，患者对温度的感知力降低，因此烫伤也成为临床上诱发糖尿病足部溃疡的常见因素。Tian等[41]采用恒温水浴烫伤法成功建立了糖尿病溃疡模型。他首先通过STZ诱导SD大鼠形成糖尿病，并于6周后将大鼠置于烫伤板上，浸入70 ℃的水中8 s，形成体表烫伤模型，从而模拟临床糖尿病足部溃疡渗出、红肿的体征，以研究炎症与溃疡愈合的内在联系。此外，Ranjbar等[42]使用电热烫伤仪制备了SD糖尿病大鼠的深Ⅲ度烫伤模型，并于烫伤处感染金黄色葡萄球菌，显著延缓了溃疡的愈合速度，更真实地模拟了糖尿病足的发病情况。然而，这类模型造成的烫伤面积形状不规则，不便于定量测评分析。
3 不同糖尿病溃疡建模方法的优缺点单独模拟病理因素或临床病征建立糖尿病溃疡模型简单易行，且耗时短。其中，模拟病理因素的糖尿病溃疡建模方法在一定程度上符合糖尿病足临床发病的病理机制，加速了自发溃疡的形成，与单纯进行皮肤组织破坏相比，模拟病理因素的糖尿病溃疡建模方法更适于发病机制的研究 (表 1)。然而，单独模拟病理因素或临床病征的动物模型也存在一定的局限性，它不能同时模拟多种发病机制，从而导致其症状表现缺乏稳定性，与临床常见的糖尿病足相差较远。因此，可以将两种或两种以上的致病因素结合起来进行建模，即多因素复合糖尿病足动物模型，或者在多因素复合模型的基础上再进行组织破坏建立同时满足病理因素和病征表现的动物溃疡模型。这类模型较单独模拟病理因素或临床病征的动物模型而言，在机制和症状表现上更接近临床患者，还具有相对稳定的组织学和分子生物学特征等，在糖尿病溃疡的治疗研究中更具价值。
| 建模方法 | 优点 | 缺点 |
| 缺血性溃疡——血管结扎法 皮肤压迫法 |
诱导缺血自发性溃疡的形成，并结合同步血流监测，可信度高；溃疡面积可控制，成模率较高，便于定量分析；适用于血管相关的机制研究及疗效评价 | 建立的急性缺血溃疡模型与糖尿病慢性缺血形成的溃疡有较大差别 |
| 神经性溃疡——分离坐骨神经 | 诱导神经病变的自发性溃疡形成，适用于神经相关的机制研究及疗效评价 | 成模率低 |
| 感染性溃疡——细菌感染 | 操作简便，可作为一种加重糖尿病溃疡的额外诱发因素，适用于疗效评价 | 与糖尿病溃疡病理机制无直接关系 |
| 皮肤全层切除模型 | 应用最为广泛，操作简单，耗时短，成模率高，可随时直观地对创面实施观察和量化分析，适用于疗效评价 | 属于非自发性溃疡，与临床糖尿病病征相差较远，对动物的糖尿病病变程度要求较高 |
| 环形夹板模型 | 属于全层皮肤切除模型的改良模型，应用广泛，成模率高，能最大程度减少伤口的收缩，更好地模拟人类伤口的愈合过程，且创面大小可控，可随时监测与分析，适用于疗效评价 | 属于非自发性溃疡，且对动物的糖尿病病变程度要求较高 |
| 烫伤模型 | 模拟外界的诱发因素，操作简便，可用于疗效评价 | 属于非自发性溃疡，且创面面积不可控，不利于量化分析，与糖尿病病理机制关系不大 |
近年来，研究者针对糖尿病足的发病机制提出了若干治疗策略，并在相关糖尿病溃疡模型中初步验证了其疗效。这些策略主要是通过抑制MMP的表达[43]、促进血管的新生[44]和抑制炎症、活性氧的产生[45]等来加速溃疡愈合，其中涉及一些敷料[46-49]、细胞因子[50-52]、干细胞的应用[53-55]以及临床上常用的清创[56-57]、负压引流[58-59]、高压氧治疗[60-61]等物理辅助方法。此外，功能性小分子如小干扰RNA、神经降压素 (neurotensin)、去铁胺 (deferoxamine)、中药单体等目前也广泛用于动物模型中来开展研究。
4.1 抑制MMP表达MMP是一类锌依赖的肽链内切酶，它能够降解细胞外基质，在组织重塑阶段起着重要的调节作用[62]。研究发现，糖尿病炎症状态下，MMP过表达，导致细胞外基质沉积减少，伤口难以愈合。而MMP-8和MMP-9是两种主要参与创伤修复的蛋白酶，其中MMP-8能促进角化细胞的迁移和再上皮化，而MMP-9则是通过降解胶原蛋白参与创伤的修复过程[63-64]，它的过度表达不利于伤口的修复，而选择性地下调MMP-9的水平反而能够加速溃疡的愈合。为了进一步研究MMP相关的溃疡发病机制，找到有效的治疗措施，研究者们多采用全层皮肤切除动物模型试验，但该模型对糖尿病病变程度的要求较高，因此实验多以db/db小鼠为主。Gao等[65]使用皮肤全层切除模型，将强选择性的MMP-9抑制剂ND-336局部用于db/db小鼠伤口处，降低MMP-9活性的同时保持MMP-8的活性，促进了再上皮化过程，加快了愈合速度。在此基础上，研究者将重组MMP-8和ND-336联用，减少了炎症因子IL-6的表达，最大程度加速了伤口的愈合。研究发现，小干扰RNA具有高度的选择性，Castleberry等[66]采用层层自组装技术合成携载MMP-9的小干扰RNA新型敷料，实现了小干扰RNA的持续缓慢释放，将其应用于db/db小鼠全层皮肤切除模型后，发现可持续有效地沉默MMP-9基因，从而降低MMP-9的活性，提高组织的胶原蛋白含量，促使肉芽组织形成而加速愈合。MMP-2在糖尿病溃疡中也过高表达，Kim等[67]合成了MMP响应性的静电纳米纺丝纤维，可于MMP高表达的溃疡处缓慢释放小干扰RNA，沉默MMP-2基因，最大限度地下调其表达，使创伤基本修复到正常皮肤的水平。
4.2 促进血管新生血管新生在创伤愈合过程中至关重要，它有助于更好地将氧气、营养物质、细胞、调控介质传递到伤口部位，进而开展创伤修复[68]。然而，糖尿病导致的外周血管病变严重阻碍了血管的新生，使局部缺血缺氧，血管内皮生长因子 (VEGF) 表达量下降，造成伤口久治不愈。有研究报道，缺氧诱导因子-1(HIF-1) 能够促进皮肤祖细胞的增殖和血管的新生[69]。为了更好地模拟临床糖尿病足患者的症状，提高研发药物的临床转化前景，Chen等[70]选用环形夹板模型最大化地模拟人类组织上皮化的创伤愈合过程，有效地防止了由于皮肤收缩导致的伤口快速愈合，提升了研究的准确性。他们将铁螯合剂DFO包载于纳米纤维支架上，实现了其72 h的持续释放，并通过上调HIF-1α和VEGF的表达，促进成纤维细胞和血管内皮细胞的相互作用，从而加速血管的新生，加快溃疡愈合。同样地，提高创伤部位的血流灌注量也能加速糖尿病溃疡的愈合。Liu等[71]发现前列腺素能够舒张血管，刺激VEGF的产生，从而增加外周组织的血流灌注量。然而，糖尿病导致的前列腺素转运蛋白 (PGT) 过表达加快了前列腺素的降解，对伤口愈合产生了不利的影响。因此，作者选用了PGT的抑制剂T26A，并将其用于环形夹板动物模型上，通过上调前列腺素E2(PGE2) 和VEGF的表达，增加局部的血流灌注量来促进血管新生，改善外周组织的缺血情况，从而加速溃疡的愈合。此外，Chen等[72]将内皮祖细胞种植在多孔的生物材料上，并用腺苷激活细胞，为其提供能量，发现腺苷能增加祖细胞的自噬水平，诱导祖细胞向血管内皮细胞分化，产生血管生长因子，促进血管增生，对缺血性动物溃疡模型有不错的疗效。
4.3 抗炎治疗过度的炎症反应延长了创伤修复过程中炎症期的存在时间，在炎症细胞的过度浸润下，TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子以及活性氧的大量释放破坏了肉芽组织及细胞外基质的形成，导致伤口难以愈合[73]。因此，抑制炎症因子的产生能在一定程度上使慢性炎症期恢复到正常的水平，有助于伤口的愈合。Moura等[74-75]将免疫调节剂神经降压素分别携载于壳聚糖和胶原蛋白敷料上使其缓慢释放，并将其用于皮肤全层切除模型中。结果表明，该敷料能在创伤早期 (第3天) 降低炎症因子TNF-α、IL-6等的表达水平，促进成纤维细胞的迁移及胶原蛋白的形成，从而加速糖尿病伤口的愈合。Kant等[76]使用经典的抗炎及抗氧化药物姜黄素，将其赋合于凝胶中并在动物模型上进行实验。结果表明，姜黄素凝胶能在减少炎症因子TNF-α、IL-1β表达的同时提高抗氧化酶和抗炎因子的含量，有利于成纤维细胞的增殖及胶原蛋白的排列分布，在修复糖尿病溃疡上具有较大的应用前景。
综合来看，针对MMP、血管新生、炎症、活性氧等相关机制的治疗策略均在糖尿病足动物模型上取得了一定的进展，而建立适合的动物模型也为治疗研究提供了新的平台。
5 展望糖尿病溃疡的发病是由血管病变、神经病变、感染和其他多种致病因素综合作用的结果。目前的研究仍大多集中在动物模型上，采用的建模方法多以单因素病理或病征的模拟为主，与临床上糖尿病溃疡的病理机制相距较远。将两种或两种以上的致病因素结合起来进行建模，并联用激光多普勒、病原学鉴定等方式来对多种模型进行客观评价，可使其在机制和症状表现上与临床更为相似。另外，也可采用多因素分阶段的建模方法，来同时满足病理和病征的表现，为深入研究糖尿病足的发病机制提供理想的平台，从而开发出有效的治疗措施。目前，针对MMP、血管新生、炎症等相关机制而提出的治疗策略已在糖尿病足动物模型中得到了一系列的疗效验证，但将其应用于临床仍面临较大挑战。
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