2. 浙江省金华市中心医院病理科, 浙江 金华 321099
2. Department of Pathology, Jinhua Municipal Central Hospital, Zhejiang University, Jinhua 321000, China
术前新辅助放化疗 (neoadjuvant chemoradiotherapy) 是T3/T4期特别是伴有淋巴结转移的直肠癌患者的标准治疗方式[1]。然而,仍然有许多患者术后出现复发与转移,尤其是那些对新辅助放化疗不敏感的患者。新辅助放化疗后获得病理学完全缓解的患者5年无病存活率达到86%,而非病理学完全缓解的患者5年无病存活率低于63%[2]。因此寻找有效的能预测新辅助放化疗疗效及生存的指标至关重要。
肿瘤起始细胞 (tumor initiating cells) 具有极高的增殖、分化等潜能,能够耐受化疗及放疗,进而促进肿瘤复发与转移。肿瘤起始细胞主要通过特异性的表面标志物如CD133等[3]来确认。放化疗后组织会处于缺氧的环境中,其通过缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α) 等调节肿瘤相关因子的表达,进而介导肿瘤的生物学行为。有研究指出,HIF-1α与宫颈癌及头颈部肿瘤等放疗抵抗性相关,但其中的具体机制仍未明了[4-5]。Ohnishi等[6]研究发现,在结肠癌细胞中,HIF-1α能促进CD133的表达。但HIF-1α和CD133与直肠癌新辅助放化疗患者病理学缓解及生存之间的关系仍鲜有研究。
本研究主要通过检测新辅助放化疗前后直肠癌组织HIF-1α和CD133基因及蛋白表达,分析两者相关性,并进一步研究两者表达与患者病理学缓解及预后的关系。
1 对象与方法 1.1 对象本研究共纳入2010年1月至2015年12月浙江省金华市中心医院收治的114例Ⅱ~Ⅲ期直肠癌患者资料,所有患者均接受术前新辅助放化疗,肿瘤位于距肛缘12 cm以内,放化疗结束后行全直肠系膜切除术 (total mesorectal excision)。新辅助放化疗前标本由结肠镜活检获取,手术切取标本后保存于液氮中或石蜡包埋。术后所有肿瘤组织病理学类型均为腺癌,依据患者体格检查、结肠镜检查、盆腔MRI检查、胸部及腹部CT检查进行临床T及N分期。其中男性68例、女性46例,中位年龄61岁 (34~84岁)。中位随访时间39个月 (8~68个月),其中失访8例。
本研究经浙江省金华市中心医院伦理审查委员会审查通过。
1.2 试剂抗HIF-1α单克隆抗体来自美国Sigma公司,CD133单克隆抗体来自美国Abcam公司。
1.3 新辅助放化疗和手术治疗所有患者均接受术前总量45 Gy/28期长疗程放疗,每周五次,同步口服希罗达 (825 mg·m-2·d-1) 或行mFOLFOX6化疗。放化疗结束后6~8周行全直肠系膜切除治疗,其中有11例患者因未遵医嘱,8周后行手术治疗。手术方式包括低位直肠前切除术、腹会阴联合切除术或经括约肌间切除术,术中均行预防性横结肠造口或永久造口。术后3~6周行辅助化疗,化疗方案为XELOX或mFOLFOX6。
1.4 RT-PCR检测HIF-1α和CD133 mRNA表达提取标本组织中总RNA 0.5 μg逆转录成cDNA。CD133上游:5′-TTACGGCACTCTTCACCT-3′,下游:5′-TATTCCACAAGCAGCAAA-3′,退火温度55 ℃;HIF-1α上游:5′-CCGCTGGAGACACAATCATA-3′,下游:5′-CTTCCTCAAGTTGCTGGTCA-3′,退火温度55 ℃;GAPDH上游:5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGGCG-3′,下游:5′-CTCCTGGAAG ATGGTGATGG-3′,退火温度55 ℃。按文献[7]行RT-PCR反应,GAPDH作为内参,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5 免疫组织化学分析肿瘤组织中HIF-1α和CD133蛋白表达及组织病理学评估采用SABC法检测。切片厚度4 μm,二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶。组织切片置于柠檬酸盐缓冲溶液中微波炉孵育3 min,血清封闭,与抗HIF-1α单克隆抗体 (1:20 000) 及CD133单克隆抗体 (1:100)4 ℃孵育过夜,PBS冲洗,在37 ℃保温箱中与二抗孵育30 min,滴加试剂SABC,DAB显色,苏木精复染。PBS代替一抗作为阴性对照,已知阳性涂片作为阳性对照。
免疫组织化学染色切片按染色强度评分:0分=无表达,1分=弱表达,2分=中度表达,3分=强表达;按阳性细胞百分率计数评分:0分=0%,1分=1%~25%,2分=26%~50%,3分=51%~75%,4分=76%~100%。两种评分相加,1~2分为低表达,3~6分为高表达。直肠癌患者对新辅助放化疗应答采用肿瘤消退分级方法 (TRG) 评估,新辅助放化疗后TNM分期记为ypTNM,病理学完全缓解定义为TRG4(没有肿瘤细胞残存,只有少许纤维组织)[8]。
1.6 统计学方法采用SPSS 13.0软件进行分析。连续变量资料采用均数±标准差 (x±s) 表示,正态分布资料两组间比较采用独立样本t检验,非正态分布资料及等级变量资料采用Mann-Whitney U检验。计数资料采用率和百分比表示,组间比较采用χ2检验。HIF-1α和CD133基因表达相关关系采用Spearman秩相关分析方法。病理学完全缓解相关独立预测因子采用多因素Logistic回归分析。采用受试者工作特征 (ROC) 曲线分析预测病理学完全缓解最佳阳性界值。患者无病存活率及总存活率采用Kaplan-Meier方法分析,组间存活率比较采用Log-rank检验,多因素生存分析采用Cox回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 患者临床病理特征与HIF-1α mRNA、CD133 mRNA表达的关系HIF-1α mRNA、CD133 mRNA表达与病理学T分期、ypTNM、病理学完全缓解、复发和转移相关 (均P<0.05),与性别、年龄、体质指数等其他临床因素无关 (均P>0.05),见表 1。提示HIF-1α、CD133可能与肿瘤患者对新辅助放化疗敏感性及预后有关。
(x±s) | |||
临床病理因素 | n | HIF-1α | CD133 |
性别 男 | 68 | 0.5310±0.1579 | 0.2663±0.0856 |
女 | 46 | 0.5604±0.1716 | 0.2881±0.1038 |
年龄 (岁) >60 | 61 | 0.5182±0.1626 | 0.2886±0.0926 |
≤60 | 53 | 0.5681±0.1566 | 0.2777±0.0897 |
体质指数 (kg/m2) | |||
>23 | 60 | 0.5403±0.1621 | 0.2693±0.0895 |
≤23 | 54 | 0.5380±0.1620 | 0.2759±0.0936 |
肿瘤距肛缘距离 (cm) | |||
>5 | 86 | 0.5191±0.1554 | 0.2676±0.0779 |
≤5 | 28 | 0.6011±0.1663 | 0.2871±0.1245 |
cT分期 1/2 | 28 | 0.5311±0.1748 | 0.2941±0.1181 |
3/4 | 86 | 0.5419±0.1578 | 0.2653±0.0802 |
cN分期 0 | 74 | 0.5388±0.1598 | 0.2636±0.0902 |
1/2 | 40 | 0.5401±0.1663 | 0.2886±0.0916 |
分化程度 | |||
高分化/中分化 | 59 | 0.5506±0.1838 | 0.2718±0.1015 |
低分化/其他类型 | 30 | 0.5804±0.1418 | 0.2888±0.0800 |
pT分期 1/2 | 51 | 0.5023±0.1464** | 0.2566±0.0892* |
3/4 | 38 | 0.6338±0.1611 | 0.3129±0.0838 |
pN分期 0 | 82 | 0.5646±0.1299 | 0.2738±0.0758 |
1/2 | 32 | 0.5836±0.1570 | 0.3135±0.0839 |
ypTNM pCR或Ⅰ | 70 | 0.5067±0.1504* | 0.2560±0.0855* |
Ⅱ或Ⅲ或Ⅳ | 44 | 0.6225±0.1604 | 0.3145±0.0926 |
复发或转移是 | 24 | 0.6315±0.2024* | 0.3535±0.0995** |
否 | 90 | 0.5172±0.1429 | 0.2530±0.0777 |
ypTNM:新辅助放化疗后TNM分期;cT、cN:根据临床影像学检查的分期;pT、pN:根据病理学检查的分期;HIF-1α:缺氧诱导因子1α;pCR:病理学完全缓解.两组比较,*P<0.05,**P<0.01. |
新辅助放化疗前HIF-1α mRNA与CD133 mRNA表达之间无相关性 (γ=0.130,P=0.334),新辅助放化疗后HIF-1α mRNA与CD133 mRNA呈正相关 (α=0.579,P=0.000),见图 1。提示新辅助放化疗后HIF-1α mRNA与CD133 mRNA表达之间可能存在调控关系。
2.3 新辅助放化疗后HIF-1α蛋白与CD133蛋白表达的关系对术后同一部位组织切片的免疫组织化学检测显示,HIF-1α主要表达于肿瘤细胞核,阳性表达率为73.7%(84/114);CD133主要表达于肿瘤细胞质,阳性表达率为66.7%(76/114)。HIF-1α高表达肿瘤细胞中CD133也呈高表达,见图 2。这进一步提示新辅助放化疗后HIF-1α蛋白与CD133蛋白表达也呈相关关系。
2.4 病理学完全缓解相关预测因素分析单因素分析发现,患者性别、年龄、病理学T分期、病理学N分期、肿瘤分化、化疗方案、放疗结束至手术时间与患者病理学完全缓解无关。HIF-1α mRNA表达、CD133 mRNA表达与病理学完全缓解显著相关 (均P<0.05),见表 2。多因素分析发现,HIF-1α mRNA (HR=0.237, 95%CI:0.051~0.612,P=0.012)、CD133 mRNA (HR=0.576, 95%CI:0.139~0.981,P=0.047) 表达是患者病理学完全缓解的独立预测因素。提示HIF-1α mRNA、CD133 mRNA表达是肿瘤对新辅助放化疗敏感性的独立预测因素。根据ROC曲线确定预测病理学完全缓解的HIF-1α mRNA最佳阳性界值为0.5350,CD133 mRNA最佳阳性界值为0.2340, 见图 3。
临床病理因素 | pCR | 非pCR | P值 |
性别 男 | 17 | 51 | 0.335 |
女 | 8 | 38 | |
年龄 (岁) >60 | 12 | 49 | 0.532 |
≤60 | 13 | 40 | |
肿瘤距肛缘距离 (cm) >5 | 22 | 64 | 0.099 |
≤5 | 3 | 25 | |
cT分期 1 | 1 | 5 | 0.364 |
2 | 8 | 20 | |
3 | 16 | 60 | |
4 | 0 | 4 | |
cN分期 0 | 17 | 54 | 0.405 |
1 | 5 | 16 | |
2 | 3 | 19 | |
化疗方案 XELOX | 24 | 79 | 0.451 |
mFOLFOX6 | 1 | 10 | |
放化疗至手术间隔 (周) >8 | 3 | 8 | 0.652 |
≤8 | 22 | 81 | |
HIF-1α mRNA 高表达 | 6 | 54 | 0.001 |
低表达 | 19 | 35 | |
CD133 mRNA 高表达 | 7 | 48 | 0.022 |
低表达 | 18 | 41 | |
cT、cN:根据临床影像学检查的分期;HIF-1α:缺氧诱导因子1α;pCR:病理学完全缓解. |
2.5 HIF-1α mRNA和CD133 mRNA表达与患者存活的关系
单因素分析结果,肿瘤直径、ypTNM分期、HIF-1α mRNA表达、CD133 mRNA表达与患者无复发存活相关;ypTNM分期、HIF-1α mRNA表达、CD133 mRNA表达与患者总存活相关,见表 3、4。Cox多因素回归分析结果,ypTNM分期 (HR=3.150,95%CI:0.106~0.937,P=0.038)、HIF-1α mRNA表达 (HR=0.296,95%CI:0.078~0.713,P=0.025) 和CD133 mRNA表达 (HR=0.247,95%CI:0.047~0.803,P=0.033) 是患者无复发存活的独立预测因素;而肿瘤直径 (HR=0.885,95%CI:0.220~3.564,P=0.864) 并非患者无复发存活的独立预测因素。ypTNM (HR=3.399,95%CI:0.126~0.931,P=0.036) 和HIF-1α mRNA表达 (HR=0.342,95%CI:0.023~0.963,P=0.046) 是患者总存活的独立预测因子,CD133不是患者总存活的独立预测因子 (HR=0.414,95%CI:0.097~1.772,P=0.234),见图 4。提示HIF-1α mRNA、CD133 mRNA表达能够预测直肠癌患者无复发存活及总存活。
临床病理因素 | HR(95%CI) | P值 |
性别 男与女 | 0.962(0.454~2.038) | 0.920 |
年龄 (岁)>60与≤60 | 1.259(0.608~2.609) | 0.536 |
肿瘤距肛缘距离 (cm) >5与≤5 | 0.810(0.309~2.124) | 0.668 |
肿瘤直径 (cm) ≤5与>5 | 0.435(0.207~0.914) | 0.028 |
放化疗至手术间隔 (周) >8与≤8 | 0.696(0.166~2.929) | 0.622 |
手术类型 LAR与APE or ISR | 1.071(0.360~2.541) | 0.929 |
ypTNM Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ与pCR, Ⅰ | 2.622(1.250~5.500) | 0.011 |
辅助化疗 XELOX与mFOLFOX | 1.239(0.325~2.760) | 0.392 |
HIF-1α mRNA ≤0.535与>0.535 | 0.236(0.067~0.828) | 0.013 |
CD133 mRNA ≤0.234与>0.234 | 0.207(0.047~0.921) | 0.021 |
ypTNM:新辅助放化疗后TNM分期;HIF-1α:缺氧诱导因子1α;pCR:病理学完全缓解;LAR:直肠低位前切除术;APE:直肠癌腹会阴联合切除术;ISR:括约肌间直肠癌切除术. |
临床病理因素 | HR(95%CI) | P值 |
性别男与女 | 1.168(0.624~2.190) | 0.627 |
年龄 (岁) >60与≤60 | 1.105(0.594~2.057) | 0.752 |
肿瘤距肛缘距离 (cm) >5与≤5 | 0.804(0.355~1.819) | 0.600 |
肿瘤直径 (cm) ≤5与>5 | 0.567(0.304~1.057) | 0.074 |
放化疗至手术间隔 (周) >8与≤8 | 0.738(0.227~2.400) | 0.614 |
手术类型 LAR与APE or ISR | 1.098(0.473~2.551) | 0.837 |
ypTNM Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ与pCR, Ⅰ | 2.358(1.134~4.901) | 0.026 |
辅助化疗 XELOX与mFOLFOX | 1.083(0.282~5.378) | 0.472 |
HIF-1α mRNA ≤0.535与>0.535 | 0.407(0.226~0.956) | 0.041 |
CD133 mRNA ≤0.234与>0.234 | 0.335(0.121~0.930) | 0.032 |
ypTNM:新辅助放化疗后TNM分期;HIF-1α:缺氧诱导因子1α;pCR:病理学完全缓解;LAR:直肠低位前切除术;APE:直肠癌腹会阴联合切除术;ISR:括约肌间直肠癌切除术. |
3 讨论
直肠癌是世界范围内常见的恶性肿瘤。新辅助放化疗和全直肠系膜切除可以减少患者肿瘤局部复发,但仍然有不少患者出现复发及转移[9]。此外,由于选择接受新辅助放化疗患者主要依赖于术前MRI等的评估,有可能过度应用放化疗,导致患者生活质量降低及医疗费用增加[10]。因此,寻找预测新辅助放化疗疗效指标,以帮助患者进行治疗选择及提高新辅助放化疗的疗效,具有重要临床价值。本研究资料提示,直肠癌患者新辅助放化疗后HIF-1α与CD133表达呈正相关,并且与直肠癌患者病理学完全缓解及预后具有相关性。CD 133作为肿瘤起始细胞标志物之一,在结直肠肿瘤中有广泛研究。裘建明等[11]在直肠癌sw480细胞的研究中发现,CD133阳性直肠癌细胞群能提高直肠癌对放疗耐受性。本研究结果提示,CD133低表达患者病理学完全缓解率更高,并且是直肠癌患者存活的独立预测因素,说明新辅助放化疗过程中CD133表达改变与肿瘤患者放化疗敏感性有关。HIF-1α是缺氧时肿瘤生物学行为的主要调节因子之一。Kim等[12]发现,HIF-1α能抑制肉瘤组织血管生成并对其他疗法产生抵抗,而敲除HIF-1α后能解除这种抵抗。Zhang等[13]研究发现,HIF-1α通过促进结直肠癌上皮间质转化,从而促进肿瘤的侵袭与转移。
HIF-1α对肿瘤生物学行为影响可以通过调控分化及增加肿瘤起始细胞表达来实现。Sun[14]在肾细胞癌研究中发现,在缺氧的环境中,CD133表达增加,并且与肿瘤分期及转移相关。Inukai[15]研究发现,在胶质母细胞瘤中,HIF-1α可通过PI3K/Akt通路调控CD133的表达。因此,肿瘤的缺氧微环境将促进肿瘤起始细胞的生成,在外界不利因素去除后,处于静止状态的肿瘤起始细胞将再次增殖分化,成为复发转移的根源。本研究结果表明,新辅助放化疗后直肠癌患者HIF-1α与CD133表达呈明显正相关,并且是患者病理学完全缓解和存活的独立预测因子,这进一步说明两者之间存在调控关系并且参与肿瘤的生物学行为。但是关于HIF-1α和CD133调控仍有不同观点,Maeda等[16]在胰腺癌的研究中发现,在缺氧的环境中,CD133通过调控HIF-1α促进肿瘤细胞侵袭和转移。Saigusa等[17]提出,直肠癌患者新辅助放化疗后HIF-1α与CD133表达呈负相关,肿瘤消退多的患者CD133表达低。HIF-1α与CD133的具体调控关系值得进一步探讨。
综上所述,本研究发现,HIF-1α和CD133与接受新辅助放化疗的直肠癌患者病理学完全缓解显著相关,并能够预测患者生存,靶向HIF-1α和CD133或能提高直肠癌患者对放疗的敏感性,改善患者长期存活率。但本研究为回顾性研究,样本量较少,具有一定的局限性,未来仍需更大样本量的研究、更长时间的随访及设计严密的体外实验以证实本研究结论。
[1] | RÖDEL C, HOFHEINZ R, FOKAS E. Rectal cancer:neoadjuvant chemoradiotherapy[J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2016, 30(4): 629–639. doi:10.1016/j.bpg.2016.06.004 |
[2] | LEE-KONG S A, RUBY J A, CHESSIN D B, et al. Hypoxia-related proteins in patients with rectal cancer undergoing neoadjuvant combined modality therapy[J]. Dis Colon Rectum, 2012, 55(9): 990–995. doi:10.1097/DCR.0b013e31825bd80c |
[3] | LEE Y J, WU C C, LI J W, et al. A rational approach for cancer stem-like cell isolation and characterization using CD44 and prominin-1(CD133) as selection markers[J]. Oncotarget, 2016, 7(48): 78499–78515. |
[4] | CUI H, QIN Q, YANG M, et al. Bortezomib enhances the radiosensitivity of hypoxic cervical cancer cells by inhibiting HIF-1 alpha expression[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(8): 9032–9041. |
[5] | WANG M, LI X, QU Y, et al. Hypoxia promotes radioresistance of CD133-positive Hep-2 human laryngeal squamous carcinoma cells in vitro[J]. Int J Oncol, 2013, 43(1): 131–140. |
[6] | OHNISHI S, MAEHARA O, NAKAGAWA K, et al. hypoxia-inducible factors activate CD133 promoter through ETS family transcription factors[J/OL]. PLoS One, 2013, 8(6):e66255. |
[7] | YU J W, ZHANG P, WU J G, et al. Expressions and clinical significances of CD133 protein and CD133 mRNA in primary lesion of gastric adenocacinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2010, 29: 141. doi:10.1186/1756-9966-29-141 |
[8] | SAUER R, BECKER H, HOHENBERGER W, et al. Preoperative versus postoperative chemoradiotherapy for rectal cancer[J]. N Engl J Med, 2004, 351(17): 1731–1740. doi:10.1056/NEJMoa040694 |
[9] | LOOS M, QUENTMEIER P, SCHUSTER T, et al. Effect of preoperative radio (chemo) therapy on long-term functional outcome in rectal cancer patients:a systematic review and meta-analysis[J]. Ann Surg Oncol, 2013, 20(6): 1816–1828. doi:10.1245/s10434-012-2827-z |
[10] | DEJONG E A, TEN BERGE J C, DWARKASING R S, et al. The accuracy of MRI, endorectal ultrasonography, and computed tomography in predicting the response of locally advanced rectal cancer after preoperative therapy:a metaanalysis[J]. Surgery, 2016, 159(3): 688–699. doi:10.1016/j.surg.2015.10.019 |
[11] | 裘建明, 杨关根, 沈忠, 等. CD133+直肠癌细胞对直肠癌放射线敏感性的影响[J]. 中华肿瘤杂志, 2014, 36(2): 103–107. |
[12] | KIM Y J, LEE H J, KIM T M, et al. Overcoming evasive resistance from vascular endothelial growth factor a inhibition in sarcomas by genetic or pharmacologic targeting of hypoxia-inducible factor 1alpha[J]. Int J Cancer, 2013, 132(1): 29–41. doi:10.1002/ijc.v132.1 |
[13] | ZHANG W, SHI X, PENG Y, et al. HIF-1alpha promotes epithelial-Mesenchymal transition and metastasis through direct regulation of ZEB1 in colorectal cancer[J/OL]. PLoS One, 2015, 10(6):e0129603. |
[14] | SUN C, SONG H, ZHANG H, et al. CD133 expression in renal cell carcinoma (RCC) is correlated with nuclear hypoxia-inducing factor 1alpha (HIF-1alpha)[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2012, 138(10): 1619–1624. doi:10.1007/s00432-012-1237-8 |
[15] | INUKAI M, HARA A, YASUI Y, et al. Hypoxia-mediated cancer stem cells in pseudopalisades with activation of hypoxia-inducible factor-1alpha/Akt axis in glioblastoma[J]. Hum Pathol, 2015, 46(10): 1496–1505. doi:10.1016/j.humpath.2015.06.008 |
[16] | MAEDA K, DING Q, YOSHIMITSU M, et al. CD133 modulate HIF-1alphsa expression under hypoxia in EMT phenotype pancreatic cancer stem-like cells[J]. Int J Mol Sci, 2016, 17(7): 1025. doi:10.3390/ijms17071025 |
[17] | SAIGUSA S, TANAKA K, TOIYAMA Y, et al. Clinical significance of CD133 and hypoxia inducible factor-1alpha gene expression in rectal cancer after preoperative chemoradiotherapy[J]. Clin Oncol (R Coll Radiol), 2011, 23(5): 323–332. doi:10.1016/j.clon.2010.09.012 |