癫痫是严重危害人类身心健康的常见发作性中枢神经系统疾病之一。据统计,癫痫的发病率为5‰~7‰,全球约有9000万患者,我国约有650万~910万患者[1]。癫痫的危害不仅来自癫痫发作本身,还来自长期癫痫发作带来的记忆障碍等认知损害[2]。有报道指出,伴癫痫发作的儿童人群并发注意缺陷、行为问题及精神发育迟滞较无癫痫发作的儿童高4~20倍[3-4];而对于成人期起病最常见的癫痫——颞叶癫痫,甚至有人认为记忆问题比发作本身的危害性更大[5]。目前,癫痫导致记忆障碍的发病机制尚未完全阐明。
组胺在脑内是一种神经递质,其胞体位于下丘脑后部的结节乳头核,该神经元在脑内有着广泛而弥散的投射。脑内组胺参与调节睡眠—觉醒活动、自发运动及调节痛觉的阈值等。脑内组胺水平下降能诱使正常的脑功能失去平衡,容易诱发精神分裂症、癫痫、失眠等。已有报道,脑内组胺可促进正常动物的学习记忆能力,也可改善多种痴呆模型的记忆功能[6]。如最近有学者发现,在大鼠的海马CA1区和杏仁核内注射组胺,可增强大鼠的记忆能力,并提示可能与H2受体有关[7]。但是,脑内组胺功能失调是否与戊四唑诱导癫痫大鼠的记忆障碍有关,尚未完全清楚。本文通过神经药理学的方法,拟探讨脑内组胺是否能改善戊四唑诱导癫痫大鼠的空间记忆形成障碍并寻找其可能的机制。
1 材料与方法 1.1 动物、药物和试剂雄性SD大鼠,体质量220~300 g,清洁级Ⅱ级,由浙江中医药大学动物实验研究中心提供。食物和水自由摄取;每天给予12 h的光照 (光照时间为8:00至20:00),行为学实验在12:00至17:00进行。
戊四唑、组氨酸、吡拉明 (pyrilamine) 和卓兰替丁 (zolantidine) 购自美国Sigma公司,均溶于等渗氯化钠溶液后腹腔注射。
1.2 戊四唑诱导大鼠癫痫模型的建立用腹腔注射亚惊厥剂量的戊四唑35 mg/kg,每48 h一次,诱导大鼠癫痫模型。每次注射戊四唑后,将大鼠放在透明的箱子里观察行为变化30 min。参照文献及我们以前的工作分级标准[8-9],癫痫发作严重程度分为六级:0级,无反应;1级,耳朵和面部抽动,包括眨眼、动须、节奏性咀嚼;2级,肌阵挛,但无直立;3级,肌阵挛,两前肢抬起;4级,侧身倒地;5级,背部倒地,全身强直—阵挛发作,或死亡。记录肌阵挛潜伏时间和全身发作潜伏时间。若连续三次注射戊四唑后发作级别达4级或以上,则认为完全诱导。
1.3 Morris水迷宫实验检测大鼠空间记忆形成能力大鼠的空间记忆形成能力采用Morris水迷宫实验,测定指标为上平台的潜伏期,即逃脱潜伏期 (escape latency)。圆形池子 (直径150 cm,高50 cm) 分成四个象限,注入深24 cm的用牛奶混浊的水,水温 (22±2)℃。有机玻璃平台位于水下1 cm,每次测试均保持平台位置不变,水池上方中央2.0 m处用40 W白光照明。实验前将大鼠置于水迷宫让其适应。大鼠连续训练3 d,8次/d,每次实验大鼠在三个不同的象限头朝池壁放入水池,任其游泳,直至找到平台。大鼠找到平台的时间和轨迹由水池上方的摄像机记录。记录60 s内到达平台的时间 (即潜伏期),并允许大鼠在平台上停留10 s以达到强化记忆的效果。如果大鼠在60 s内未到达平台则潜伏期记为60 s,并由实验者将其放上平台停留10 s。每次实验后将大鼠吹干放入笼子,训练间隔为10 min。
1.4 化学荧光法测定大鼠脑组织组胺含量采用化学荧光法测定大鼠脑组织中组胺的含量,具体方法如下。大鼠最后一次水迷宫训练后,立即断头取脑,移至冰上,分离出海马,置于-70 ℃冰箱备用。被测组织中加入适当容积的0.4 mol/L高氯酸溶液匀浆,3500×g离心10 min。提取1 mL上清液至事先放有0.125 mL的5 mol/L氢氧化钠溶液、0.375 g氯化钠和2.5 mL正丁醇的7 mL离心管内,3500×g振荡离心10 min。然后,将上层的正丁醇移至另一7 mL的离心管内,加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液1.25 mL,3500×g振荡离心10 min。2 mL正丁醇移至事先放有0.1 mol/L盐酸0.625 mL和正庚烷3.75 mL的7 mL离心管内,3500×g振荡离心10 min。取水层0.5 mL,加入1 mol/L氢氧化钠0.1 mL和0.2%的O-苯二醛0.025 mL,4 min后加入3 mol/L盐酸0.05 mL中止反应,在340 nm激活下,测450 nm荧光。根据荧光—浓度曲线计算出组胺含量。
1.5 戊四唑诱导癫痫模型的建立取20只大鼠,随机分为模型组和对照组 (腹腔注射相同容积的等渗氯化钠溶液),各10只。建模一周后,通过Morris水迷宫观察戊四唑诱导癫痫对空间记忆形成的影响,方法同1.3。
1.6 组氨酸对模型大鼠空间记忆形成能力的干预实验取50只大鼠,随机分为正常对照组、模型对照组和三种浓度组胺酸组,共五组,每组10只。除正常对照组外,其余各组均采用戊四唑诱导大鼠癫痫模型,其中组氨酸三组在诱导癫痫形成后一周,每天第一次训练前半小时分别腹腔注射200、500、1000 mg/kg质量浓度的组氨酸,然后进行Morris水迷宫实验观察模型大鼠记忆形成能力,方法同1.3。
1.7 吡拉明对模型大鼠空间记忆形成能力的干预实验取50只大鼠,随机分为模型对照组、组胺酸对照组和组胺酸+三种浓度吡拉明组,共五组,每组10只,均采用戊四唑诱导大鼠癫痫模型。诱导癫痫形成后一周,组胺酸对照组腹腔注射1000 mg/kg组氨酸,组胺酸+吡拉明三组分别注射1000 mg/kg组氨酸和4、10、20 mg/kg吡拉明,均在每天第一次训练前半小时注射。Morris水迷宫实验观察模型大鼠空间记忆形成能力,方法同1.3。
1.8 卓兰替丁对模型大鼠空间记忆形成能力的干预实验方法同1.7,其中用卓兰替丁代替吡拉明。
1.9 统计学方法采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。数据均以均数±标准差 (x±s) 表示。组间比较采用单因素方差分析法,组间方差齐性时两两比较采用Bonferroni法,组间方差不齐时两两比较采用Games-Howell法。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 戊四唑诱导癫痫对癫痫模型空间记忆形成和脑组织中组胺含量的影响模型组在水迷宫中训练1、2和3 d的逃脱潜伏期分别为 (43.5±8.1) s、(30.2±5.4) s和 (17.3±4.4) s;对照组在水迷宫中训练1、2和3 d的逃脱潜伏期分别为 (47.4±8.8) s、(17.3±4.4) s和 (5.6±2.1) s。两组大鼠的逃脱潜伏期均随着训练时间的增加而缩短,模型组在训练第三天的逃脱潜伏期短于第一天 (P<0.05),对照组在训练的第二天和第三天逃脱潜伏期均短于第一天 (均P<0.05)。与对照组比较,模型组训练第一天的逃脱潜伏期相似 (P>0.05),但第二天和第三天逃脱潜伏期均延长 (均P<0.05)。这些结果提示,两组大鼠均有空间记忆形成,但模型组空间记忆形成能力差于对照组。
大鼠脑组织中组胺含量测定结果见表 1。统计分析发现,模型组海马、下丘脑和丘脑组胺含量较对照组均下降 (均P<0.05);模型组皮质组胺含量与对照组比较也表现出下降趋势,但差异无统计学意义 (P>0.05)。这些结果提示,戊四唑诱导癫痫导致了大鼠脑组织中组胺含量下降,可能是空间记忆形成能力下降的原因之一。
(x±s, ng/g) | |||||
组别 | n | 皮质 | 海马 | 下丘脑 | 丘脑 |
对照组 | 10 | 48.1±6.8 | 48.1±7.7 | 817.5±26.3 | 328.6±31.6 |
模型组 | 10 | 37.5±5.9 | 14.9±2.3* | 430.1±13.7* | 146.1±35.1* |
与对照组比较,*P<0.05. |
在训练第二天,1000 mg/kg组氨酸组逃脱潜伏期[(23.6±4.8) s]较模型对照组下降[(39.3±6.8) s,P<0.05];训练第三天,500 mg/kg[(18.5±5.1) s]和1000 mg/kg[(12.7±4.3) s]的组氨酸组逃脱潜伏期均较模型对照组[(32.1±5.7) s]下降 (均P<0.05),而200 mg/kg组氨酸组与模型对照组差异无统计学意义 (P>0.05), 见图 1。提示组氨酸可改善戊四唑诱导癫痫大鼠的记忆形成障碍。
2.3 吡拉明对组氨酸改善癫痫模型空间记忆形成障碍作用的影响各剂量的吡拉明均不影响组氨酸对大鼠空间记忆形成障碍的改善作用,见图 2。提示组氨酸对戊四唑诱导癫痫大鼠空间记忆形成障碍的保护作用与组胺H1受体无关。
2.4 卓兰替丁对组氨酸改善癫痫模型空间记忆形成障碍作用的影响训练第二天,组氨酸+20 mg/kg卓兰替丁组的逃脱潜伏期[(39.5±5.2) s]比组氨酸对照组延长[(23.6±4.8) s,P<0.05];训练第三天,组氨酸+10 mg/kg卓兰替丁组的逃脱潜伏期[(27.6±5.1) s]和组氨酸+20 mg/kg卓兰替丁组的逃脱潜伏期[(29.8±4.9) s]均比组氨酸对照组延长[(12.7±4.3) s,均P<0.05],见图 3。提示组氨酸对戊四唑诱导癫痫大鼠空间记忆形成障碍的保护作用可能与组胺H2受体有关。
3 讨论临床研究和动物实验均表明,脑内组胺含量下降与学习记忆功能受损相关。尸体解剖发现,阿尔茨海默病患者的下丘脑、海马和颞叶皮质都较健康人下降一半以上[6];还有研究发现,在血管性痴呆模型大鼠的下丘脑中,组胺水平下降[8]。在我们早期的研究中,用组胺脱羧酶 (脑内组胺的合成酶) 抑制剂α-氟甲基组氨酸减少脑内组胺,发现大鼠的记忆再现能力下降[9]。本研究中,戊四唑诱导癫痫完全形成后一周时,大鼠的空间记忆获得能力较对照组下降。同时发现,戊四唑完全诱导后一周,大鼠海马、丘脑和下丘脑组胺含量减少,皮质中的组胺含量也有减少趋势,与国外报道大鼠杏仁核电诱导后第七天脑内组胺含量下降一致[10]。我们以前的研究也发现,戊四唑诱导癫痫能使脑内组胺含量下降,且这种下降持续三周以上[11-12]。综合这些现象,我们推断脑内组胺含量减少是戊四唑诱导癫痫大鼠空间记忆形成能力受损的机制之一。
组胺本身不能透过血脑屏障,但其前体物质组氨酸可以透过血脑屏障。因此,我们采用组胺的前体物质组氨酸来提高大鼠脑内的组胺含量,看其能否改善戊四唑诱导癫痫导致的大鼠空间记忆障碍。结果发现,组氨酸可以改善戊四唑癫痫导致的大鼠空间记忆障碍,且具有剂量依赖性,表现为在训练第二天,1000 mg/kg的组氨酸使癫痫大鼠的逃脱潜伏期缩短;训练第三天,500 mg/kg和1000 mg/kg的组氨酸均导致癫痫大鼠的逃脱潜伏期缩短,而200 mg/kg的组氨酸则无明显改善作用。我们以前的研究曾证实,组氨酸是通过增加脑内组胺水平来发挥改善记忆的作用的,因为组氨酸的保护作用可被组氨酸脱羧酶抑制剂α-FMH所逆转[12-13]。因此我们的结果不仅再次证实了组胺神经功能缺陷是戊四唑诱导癫痫导致大鼠空间记忆障碍的发病机制之一,而且提示活化脑内组胺神经功能的药物是潜在的治疗癫痫诱发记忆障碍的手段之一。
脑内的神经组胺主要通过其四大受体,即H1、H2、H3和H4受体发挥其作用[14]。其中,H3受体为突触前受体,主要发挥调节组胺自身及其他神经递质的合成释放作用[15];H4受体在脑内的作用尚不明确。H1和H2受体是突触后受体,目前,两者中哪个与记忆功能有关尚存在争议。本研究发现,组胺H2受体拮抗剂卓兰替丁剂量依赖性地逆转了组氨酸对癫痫导致空间记忆障碍的改善作用,而组胺H1受体拮抗剂吡拉明不影响组氨酸对癫痫导致空间记忆障碍的改善作用。在我们的预实验中,发现单独给予卓兰替丁并不影响大鼠的空间记忆能力,而最近有报道,组胺H2受体激动剂dimaprit能模拟组胺的作用,促进小鼠记忆能力的巩固[16]。因此,我们认为组胺对癫痫大鼠空间记忆障碍的改善作用可能是通过H2受体实现的。其具体作用机制可能是组胺通过H2受体/PKA/CREB (环磷腺苷反应元件结合蛋白) 信号转导通路,增强细胞核内蛋白质的合成,从而发挥增强记忆获得的作用[17-18]。
总之,戊四唑诱导癫痫大鼠的空间记忆形成能力受损,脑内组胺含量下降可能是其发病机制之一。增加脑内组胺含量,可能通过组胺H2受体发挥改善戊四唑诱导癫痫大鼠的空间记忆形成障碍的作用,但其作用的具体机制仍有待于进一步研究。
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