2. 浙江大学转化医学研究院, 浙江 杭州 310029
2. Institute of Translational Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China
杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是一种X染色体隐性遗传疾病,以神经肌肉退行性变为特征。该病通常由抗肌萎缩蛋白基因突变引起,并由此导致抗肌萎缩蛋白功能缺失。DMD多见于儿童,在男性新生儿中占1/3500~1/4000,而女性常为携带者,极少发病[1]。DMD患儿通常在3~5岁开始出现症状,包括运动迟缓、步态异常、站立困难及易跌倒等。少数患者还可表现出语言发育迟缓或全面性发育落后,血清肌酸激酶水平升高,极少数还可出现转氨酶升高。DMD患者首先出现上肢近端和躯干肌无力,随后累及上肢及远端肌肉群。对患儿的体格检查可发现蹒跚步态、腓肠肌肥大及Gowers征阳性。由于肌肉呈进行性破坏,如未治疗,患儿在11~12岁即需依赖轮椅,20岁之前可能因心肺功能衰竭而死亡[2]。目前,DMD尚无彻底治愈的方法,除了维持治疗外,携带者筛查和产前诊断对防治DMD有一定的帮助。近年来,DMD的基因和细胞治疗研究取得了空前进展,相关试验在动物模型上也取得了不少进展。
1 DMD的分子遗传学机制DMD主要由编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的抗肌萎缩蛋白基因突变引起,该基因位于染色体Xp21.2上,包含79个外显子和78个内含子,全长2400千碱基对,是人类最大的基因,约占人类基因组的0.1%[3]。抗肌萎缩蛋白基因片段较长导致其易发生突变(突变率约为1/10 000) ,且突变方式复杂多样。其中,突变类型以缺失突变为主,占全部突变的65%,重复突变占6%~10%,其余25%~30%的突变包括点突变、小缺失突变及插入突变[4]。缺失及重复突变主要发生在两个热点区域,分别位于该基因的5’端(约占20%)和中央区(约占80%),点突变和小缺失突变随机分布,无明显突变热点区域[5]。
抗肌萎缩蛋白是一种细胞骨架蛋白,主要分布于心肌和骨骼肌肌纤维膜的胞质面,由3685个氨基酸构成,相对分子质量为427 000[6]。全长的抗肌萎缩蛋白有四个功能性结构域,从氨基端到羧基端依次为氨基端区、中央杆状区、半胱氨酸富含区和羧基端区。氨基端区与α-辅肌动蛋白高度同源,由232~240号氨基酸残基构成;中央杆状区由25个三螺旋重复组成,其结构与血影蛋白类似,包含近3000个氨基酸残基;半胱氨酸富含区由280个氨基酸残基组成;位于末端的羧基端区由420个氨基酸残基构成[7]。
全长的抗肌萎缩蛋白在转录时受三种不同的启动子调控,分别是B启动子(代表脑)、M启动子(代表横纹肌)和P启动子(代表浦肯野细胞),各字母表明了其表达位点。除此之外,根据抗肌萎缩蛋白表达时RNA的剪接不同又可分为五种非全长亚型,根据其相对分子质量大小命名,分别是Dp260亚型(在视网膜中表达为主)、Dp140亚型(在脑、视网膜和肾脏中表达)、Dp116亚型(仅在成人外周神经中表达)、Dp71亚型(在除肌肉外的大多数组织中表达)以及Dp40亚型(在大脑中表达)[8]。
在骨骼肌和心肌细胞中,抗肌萎缩蛋白与肌营养不良聚糖、肌聚糖、肌长蛋白、互养蛋白和α-小肌营养蛋白共同组成肌营养不良糖蛋白复合物(dystrophin-glycoprotein complex,DGC)[9]。肌营养不良聚糖是DGC的核心蛋白,它由单基因编码,并在翻译后裂解为α、β两个亚基。其中α、β肌营养不良聚糖分别与细胞外的层黏连蛋白和细胞内的抗肌萎缩蛋白相连,而抗肌萎缩蛋白又与肌膜下的肌动蛋白和中间丝细胞骨架结合,因而起到连接细胞骨架和细胞外基质的作用[10]。肌聚糖是DGC的另一个跨膜成分,由α、β、γ、δ、ε五个亚基组成。互养蛋白包含α1、β1、β2、γ1、γ2亚基,它和α-小肌营养蛋白直接与抗肌萎缩蛋白的羧基端相连[11]。
DGC使肌动蛋白细胞骨架和细胞外基质相连,同时它可在细胞收缩时稳定肌纤维膜,并把肌节的收缩力传递到细胞外基质中。DGC在维持肌细胞完整性方面有着至关重要的作用,组成其各个成分的异常都可导致不同类型的肌肉疾病[9]。当DMD患者发生基因突变时,抗肌萎缩蛋白结构发生改变,组成DGC的其它蛋白也相应地出现继发性缺失,因而DGC的功能会随之发生改变[12]。骨骼肌和心肌细胞因缺少全长的抗肌萎缩蛋白而失去完整的DGC结构时,细胞膜将变得不稳定,且易在收缩时受到机械力的损害,最终出现变性和坏死。
2 常用的DMD动物模型DMD基因突变及其编码的抗肌萎缩蛋白相关研究为DMD的发病机制及治疗策略研究奠定了基础,而后者必须依赖DMD动物模型的建立。目前,DMD的实验动物模型已达60余种,其中最为常用的是鼠类及犬类模型,而猫类及非哺乳类模型则较少应用。
2.1 鼠类模型 2.1.1 mdx 小鼠模型小鼠模型广泛用于DMD发病机制及其治疗的研究中,这些小鼠通常带有DMD基因突变。其中,mdx鼠是最常用于探索抗肌萎缩蛋白基因表达和功能的小鼠模型。这种模型的23号外显子发生无义点突变而导致终止密码子提前出现,由此引起全长抗肌萎缩蛋白的表达缺失[13]。然而,尽管与DMD患者有着同样的基因缺陷,但mdx小鼠的肌营养不良表型更为轻微,其生存寿命仅比正常小鼠减少20%,而DMD患者的寿命则会减少75%[14]。mdx小鼠骨骼肌病变相对温和且呈缓慢波动进展,具有几个独特的阶段:在出生后两周,mdx小鼠肌肉与正常小鼠无明显差异;至3~6周时,mdx小鼠的肌肉组织出现明显的坏死,这一时期与DMD患者的表型最为接近;随后,由于肌肉组织的再生,mdx小鼠进入一个相对平稳的阶段,此时mdx小鼠的四肢肌肉往往会过度肥厚;直至15个月以上时,mdx小鼠才会出现肌肉萎缩、脊柱侧凸、心功能衰竭等肌营养不良表型。mdx小鼠的这些轻微表型被认为与抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)的代偿作用有关[15]。
2.1.2 基因双敲除(double knock out,DKO)鼠模型为了使mdx小鼠的肌肉表型与DMD患者更加相似,研究人员在mdx小鼠上设计了几个额外突变,产生了DKO鼠。其中最常见的是抗肌萎缩蛋白基因与抗肌萎缩蛋白相关基因双敲除鼠,即mdx/utrn-/-鼠。这一鼠种呈现出较为严重的肌营养不良表型,表现为严重的肌肉无力、关节挛缩和脊柱后突,且其平均生存期仅为3个月,这反过来支持了抗肌萎缩蛋白相关蛋白对肌萎缩蛋白缺失有代偿作用的说法。而且,mdx/utrn-/-鼠在DMD基因治疗研究中是非常有用的,其表型在很大程度上可被抗肌萎缩蛋白相关蛋白在肌肉内特异性表达所缓解[16]。
2.1.3 Dmdmdx大鼠模型Larcher等[17]提出用大鼠作为DMD的研究模型。大鼠比一般的mdx小鼠在行为表现上更具特征,其运动协调性也更为精确。为了产生这种抗肌萎缩蛋白缺陷的大鼠,他们通过转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases)使大鼠DMD基因第23号外显子缺失。验证实验发现,Dmdmdx大鼠表现出与DMD患者相似的肌肉损害,并以骨骼肌重量减轻、肌纤维坏死、纤维大小多变为特征。此外,Dmdmdx大鼠还伴有进行性扩张型心肌病的表现,因而Dmdmdx大鼠对DMD心功能不全的研究也有重要意义。
2.2 斑马鱼模型斑马鱼作为肌病的模型非常有吸引力,因为它具有以下几点优势:①能够快速生成大量的后代(每代有100~300个胚胎);②能在子宫外迅速生长;③胚胎和幼卵的光学透明性方便了其用于遗传操作;④胚胎随时都能吸收药物。斑马鱼模型的表型比相应的小鼠模型更接近人类临床表现的严重程度。例如,抗肌萎缩蛋白缺乏斑马鱼在第4天表现出严重的运动表型,且生命周期仅为2周;而抗肌萎缩蛋白缺陷的mdx小鼠的表型非常温和,只是适度地影响肌肉功能和小鼠生存周期[18]。
2.3 犬类模型犬类模型亦可用于DMD的研究,其中最常见的是抗肌萎缩蛋白缺陷犬,特别是肌营养不良金毛猎犬(golden retriever muscular dystrophy,GRMD),它的作用犹如“小鼠和人类之间转化的桥梁”。相比其它哺乳动物模型,GRMD可以更好地模仿人类抗肌萎缩蛋白缺乏症。其包含一个抗肌萎缩蛋白基因突变,并表现出营养不良的肌肉损伤、炎症聚集、进展性的纤维化和脂肪浸润、早期运动损害等,最终可因呼吸或心脏衰竭而提前死亡[19]。这些临床病理表现均与DMD患者极为相似,因而GRMD在DMD的治疗研究中具有一定价值。
3 基于DMD动物模型的基因治疗研究基于DMD的分子遗传学基础,研究者设法通过导入具有正常功能的基因或在mRNA水平进行矫正,以恢复或补偿抗肌萎缩蛋白的表达,从而达到治愈的目的。目前,DMD基因治疗的方法主要有五种。
3.1 终止密码子通读大约15%的DMD患者发生终止密码子提前产生(premature termination codons,PTC)的无义突变,此类患者可被能促使PTC发生通读的药物治愈。对通读的生物化学和分子生物学研究显示,氨基糖苷类可结合到RNA核糖体的特定位点,并在氨酰基转运RNA接受位点破坏密码子与反义密码子的识别[20]。这一原理可以产生通过忽略PTC而使翻译正常进行的错义突变,其产物是包含抗肌萎缩蛋白全长的蛋白[21]。有研究发现,对mdx小鼠进行庆大霉素治疗后其抗肌萎缩蛋白的表达轻微增加,而在人体试验中这一蛋白表达的增幅很小,并且长期使用这类药物会有肾毒性和耳毒性[13]。
3.2 反义寡核苷酸介导的外显子跳跃法反义寡核苷酸介导的外显子跳跃疗法已证实可在目前的临床试验中恢复DMD患者抗肌萎缩蛋白基因表达功能。反义寡核苷酸可结合到mRNA前体上的互补序列并通过调节mRNA前体剪接产生有效的目标外显子跳跃,以此恢复转录阅读框并产生一种长度缩短但仍具部分功能的抗肌萎缩蛋白[22]。这种外显子跳跃的方法对83%的抗肌萎缩蛋白基因突变适用:包括54%的缺失突变患者、23%的小突变患者和6%的重复突变;而剩下17%的突变因为缺失突变多于36个外显子或突变发生在抗肌萎缩蛋白与肌动蛋白结合的N端或C端,不能用外显子跳跃法治疗[23]。
3.3 外显子基因切除法Ousterout等[24]研究发现,可通过锌指核酸酶编辑基因组来永久移除抗肌萎缩蛋白的51号外显子中的必要拼接序列,使该外显子不能发生转录,导致51号外显子在转录后的mRNA中消失,从而恢复抗肌萎缩蛋白的表达。这种方法可以恢复13% 的DMD患者中抗肌萎缩蛋白的开放阅读框,并可与现有DMD的基因治疗和细胞治疗等方法共存[25]。与外显子跳跃法相比,这种基因剪辑在已矫正的细胞及其子代细胞中可以持续存在,并可能恢复那些可通过分化来取代肌营养不良组织的内源性祖细胞[26]。
3.4 相关基因的表达上调抗肌萎缩蛋白相关蛋白是抗肌萎缩蛋白的同源结构蛋白,相对分子质量为395 000。在成年人的骨骼肌中,抗肌萎缩蛋白相关蛋白可分布在肌纤维膜的任何位置,但最主要分布在神经肌肉接头处。在DMD患者及mdx小鼠的肌肉中,抗肌萎缩蛋白相关蛋白的表达有所上调,可以部分弥补抗肌萎缩蛋白的缺失并发挥稳定肌膜的作用[27-28]。一些动物实验已经证实可通过转基因途径、病毒载体等方法来上调抗肌萎缩蛋白相关蛋白的表达水平,从而改善肌营养不良的症状[29]。应用mdx鼠的大量理论验证研究表明,抗肌萎缩蛋白相关蛋白的表达量增加3~4倍时可使小鼠肌肉达到功能学恢复,这主要是抗肌萎缩蛋白相关蛋白的过表达形成了抗肌萎缩蛋白相关蛋白相关蛋白复合物(utrophin-associated protein complex),它的出现刚好替代了缺失的DGC。这一方法目前仍处于试验阶段,并且将面临相当复杂的技术障碍。此外,对抗肌萎缩蛋白相关蛋白基因表达的分子调控也尚需做进一步的研究[30]。
3.5 CRISPR/Cas9系统介导的基因修复CRISPR/Cas9技术是近年最热门的基因编辑方法,它通过gRNA(single-guide RNA)锁定目标DNA序列并用Cas9核酸酶使其双链断开,之后通过非同源末端连接(non-homologous end joining)对DNA进行修复,从而完成对目的基因的改造[31]。用这一方法可以移除基因组DNA中一个或者多个外显子,适用于83%左右DMD的治疗。Mendell等[32]用AAV载体将特定的gRNA/Cas9传递入mdx骨骼肌和心肌中,借此移除mdx产生自发突变的23号外显子,并由此产生截短的、但仍具部分功能的抗肌萎缩蛋白。被CRISPR/Cas9系统处理后的小鼠表现出功能学的恢复,包括肌收缩力增加、抗偏心收缩改善以及血清肌酸激酶水平下降。组织学检查发现,肌肉组织中坏死现象出现逆转、炎症细胞浸润减少、肌纤维化比例降低。免疫染色发现,神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase)的活性及DGC成分得以恢复。此外,心肌细胞中的抗肌萎缩蛋白表达也得到恢复[33]。
4 诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)与DMDDMD动物模型为了解其疾病机制研究打下了基础,并在此基础上出现了各种针对性的基因治疗策略。然而,人类细胞与动物细胞存在很大的区别,基于动物模型的病因机制及治疗研究等结果并不能完全应用于人类。一方面,DMD患者与动物模型的心肌和骨骼肌细胞在结构和生理上存在较大差异,这种差异可能会使两者在应对相同的基因突变或治疗措施时产生不同的结果,如mdx小鼠的心脏和骨骼肌表型不如DMD患者严重,且心肌电生理变化与DMD患者有明显不同[15]。另一方面,动物模型并非DMD患者疾病遗传突变的等价物,少数情况下在动物模型中单独引入DMD的突变类型可出现遗传不稳定性甚至不出现疾病表型[34]。因此,基于人体来源的细胞将成为DMD各项研究的一大需求。
在众多人体细胞类型中,胚胎干细胞可无限再生,并可分化成有特定功能的任何一种细胞,对于基因缺陷性疾病的研究有巨大的潜能[35-36]。然而,人类胚胎的应用始终存在伦理学争议。此外,如何抑制患者的免疫排斥反应也是胚胎干细胞应用中所面临的一个难题[37-38]。为了避免伦理学和免疫学问题,iPSC成为了研究的热点[39]。iPSC是在体细胞中外源导入四种转录因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)经过“重编程”而来[40],与胚胎干细胞具有相似特点,即均表达多潜能标志物,均能在体内或体外分化成三个胚层的细胞成分等。因此,iPSC可为研究DMD机制及治疗方法提供理想的细胞来源[41]。
iPSC技术的应用可为建立患者特异的疾病模型创造前所未有的机会。iPSC具有自我更新能力,并且具有分化成任何细胞类型的潜能,包括骨骼肌、心肌、神经元等。而且,iPSC仍然携带着和患者一致的突变类型,患者来源的iPSC仍然维持着其特有的基因型和表型。因此,用这一方法建立患者特异的iPSC疾病模型不仅有助于疾病的研究,也为可纠正基因缺陷的自体细胞疗法奠定基础。已有研究报道利用DMD患者自体细胞建立患者特异的iPSC模型。Luo等[42]先从已确诊为DMD的流产儿中获取皮肤成纤维细胞,并在体外进行扩增培养。随后,通过逆病毒将上述四个转录因子转导入成纤维细胞内将之重编程为iPSC。对获得的iPSC进行鉴定发现,这些DMD来源的iPSC与其成纤维细胞有着相同的核型,且能与胚胎干细胞一样在体外分化成三胚层细胞。此外,他们还证实了这类iPSC在扩增培养中不会丢失胚胎干细胞样的干细胞特性。Hashimoto等[43]从两例DMD患者外周血中获取T淋巴细胞,并用带有OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC四个因子的仙台病毒使之发生重编程。这种方法获取的iPSC比通过活检获得皮肤成纤维细胞再用逆病毒感染更具优越性,因为T细胞的获取相对无创,且经仙台病毒感染目的细胞对人体正常染色体的影响很小,甚至可以忽略不计。接着,他们还将DMD患者特异的iPSC细胞分化成心肌细胞,检测发现所得到的患者特异的心肌细胞内未表达抗肌萎缩蛋白。
人类细胞来源的疾病模型是对DMD动物模型很好的补充。从DMD患者中产生患者特异的iPSC细胞系,可为DMD疾病机制及治疗研究提供新的平台。
5 结语DMD的病因明确,主要由编码抗肌萎缩蛋白基因突变引起,然而其突变类型复杂多样,所导致的病理机制尚未完全研究透彻。目前,对DMD的研究大多在动物模型上进行,然而动物模型并不能完全模拟DMD患者的疾病进展。应用iPSC技术建立患者特异的疾病模型很好地填补了这一空白,为深入研究DMD病因机制提供了新的途径。此外,iPSC亦可结合基因修复和细胞移植等技术,为彻底治疗DMD提供新的思路。同时,随着基因测序技术的普及及成本的降低,每位DMD患者查清自身突变类型已成为可能。基于此,诸如CRISPR/Cas9等针对DMD患者不同突变类型的基因编辑技术有望成为治愈DMD的新方法,且其疗效已在动物模型上得到肯定。
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