骨质疏松症是一种全身性、系统性的骨代谢性疾病，主要发生在老年人群，即绝经后的妇女及50岁以上的男性[1-2]。治疗不及时的骨质疏松症患者易发生骨折，导致瘫痪甚至死亡，给社会、家庭、个人带来沉重经济负担的同时严重威胁着老年人的健康[3]。骨质疏松的发生主要是由生长期的骨质量和老年时骨丢失决定的，因此提高生长期骨质量可有效预防老年时骨质疏松症的发生[4]。中医认为,淫羊藿具有补肾壮阳、强筋健骨之功效，常用于治疗腰酸疼痛、促进骨折愈合[5]。淫羊藿中含有丰富的黄酮类化合物及淫羊藿苷，是近年来备受关注的抗骨质疏松新药[6]。淫羊藿总黄酮胶囊(icariin total flavonoids capsule，ITFC)中淫羊藿总黄酮提取物含量高达88.29%，具有抗骨质疏松症的潜力，其经过改良和加工做成的制剂更有利于机体的吸收。本研究通过灌胃不同浓度ITFC，探讨其对大鼠骨密度及骨形态计量学的影响，进一步证实其抗骨质疏松作用并对其中机制进行探索。
1 材料与方法 1.1 仪器和试剂LD4-2A低速离心机(北京医用离心机厂)，双能X线骨密度仪(美国GE公司)，酶标仪(美国BioTek公司)，SP1600硬组织切片机(德国Leica公司)；ITFC(江苏康缘阳光药业有限公司，产品批号150501) ，抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)试剂盒、骨碱性磷酸酶(BALP)试剂盒(英国IDS公司)。
1.2 实验动物及分组1月龄雌性SPF级SD大鼠30只，体质量为(120±10) g，由中国人民解放军第四军医大学实验动物中心提供，动物检验合格证编号SCXK(军)2012-0007。饲养温度控制在(22±5) ℃，湿度为(60±10) %，饮用水为自来水，标准大鼠饲料喂养，不限制饮食和饮水。在实验开始前驯化一周，安置在塑料饲养框内。将30只SD大鼠按体质量随机分为三组，每组10只，微调使每组大鼠体质量均值相当。ITFC-1组和ITFC-2组分别用50 mg·kg-1·d-1和100 mg·kg-1·d-1的ITFC灌胃，正常对照组用等体积蒸馏水灌胃。每周一测定一次体质量，每周的灌药量根据周一测得的体质量做相应调整。灌胃时间为早上10:00至10:30。
1.3 双能X线骨密度仪检测骨密度分别在灌胃4、8、12周后，将大鼠用10%水合氯醛以3 mL/kg的剂量腹腔注射麻醉后置于双能X线骨密度仪测量大鼠全身骨密度；12周后麻醉测量全身骨密度后处死，分离右股骨和腰椎分别测定离体骨密度。
1.4 ELISA试剂盒检测血清生物化学指标大鼠麻醉后，用10 mL针管于心脏取血，置于离心机3350×g离心15 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存；ELISA试剂盒测定血清中TRACP 5b和BALP的水平，按说明书绘制标准曲线，于酶标仪405 nm和450 nm处测定吸光度值，用公式计算浓度含量。
1.5 大鼠胫骨骨形态计量学指标分析大鼠处死后分离右侧胫骨保存于70%乙醇中用于骨形态学分析，用不脱钙树脂包埋法包埋，硬组织切片机切片，后用1500～2000目的砂纸均匀磨片至半透明，后配制品红—苦味酸进行染色，IPP 6.0 软件分析骨小梁相关参数，并观察骨组织形态结构。
1.6 统计学方法采用SPSS 16.0 分析软件进行统计分析，正态分布的计量数据用均数±标准差(x±s)表示，单因素方差分析采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 三组体质量增加比较与正常对照组比较，ITFC-1组和ITFC-2组大鼠体质量增加减少，但差异无统计学意义(均P>0.05) ，见图 1。说明ITFC灌胃对大鼠体质量的增长无明显影响。
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| 图 1 大鼠体质量测定结果曲线图 Fig. 1 Body weights of rats |
与正常对照组比较，ITFC-1组和ITFC-2组灌胃12周后全身骨密度升高，差异有统计学意义(均P＜0.05) ，但ITFC-1组与ITFC-2组之间比较差异无统计学意义(P>0.05) ，见图 2。与正常对照组比较，ITFC-1组和ITFC-2组离体骨密度均升高(均P＜0.01) ，且ITFC-2组升高的幅度大于ITFC-1组(均P＜0.05) ，见图 3。提示ITFC能提高大鼠全身和离体骨密度，高浓度的ITFC作用效果更为显著。
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| 与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01． 图 2 各组大鼠全身骨密度比较 Fig. 2 Whole body bone mineral density of rats |
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| 与正常对照组比较，**P＜0.01；与ITFC-1组比较，#P＜0.05，##P＜0.01． 图 3 不同浓度淫羊藿总黄酮胶囊作用12周后各组离体骨密度比较 Fig. 3 Bone mineral density of bone in vitro in rats after 12-week's intervention of icariin total flavonoids capsule |
如表 1所示，与正常对照组比较，IFTC-1组和IFTC-2组血清BALP含量增加(P＜0.05或P＜0.01) ，且IFTC-2组血清BALP含量增加更显著(P＜0.05) ；IFTC-1组血清TRACP 5b含量与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05) ，但IFTC-2组血清TRACP 5b含量比正常对照组减少(P＜0.01) 。提示ITFC可增加血清中骨形成相关因子BALP含量，高浓度ITFC可减少骨吸收相关因子TRACP 5b含量，浓度越高这一作用效果越明显。
| (x±s) | |||
| 组别 | n | TRACP 5b(U/L) | BALP(ng/L) |
| 正常对照组 | 10 | 2.893±0.056 | 0.240±0.013 |
| ITFC-1组 | 10 | 2.361±0.033 | 0.283±0.009* |
| ITFC-2组 | 10 | 1.807±0.144*## | 0.309±0.027**# |
| TRACP 5b：抗酒石酸酸性磷酸酶5b；BALP：骨碱性磷酸酶. 与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与ITFC-1组比较，#P＜0.05，##P＜0.01． | |||
ITFC-1组和ITFC-2组胫骨骨组织中骨小梁数量增加，骨小梁分离度低于正常对照组；与ITFC-1组比较，ITFC-2组骨小梁数量较多，分离度较低，见图 4。与正常对照组比较，ITFC-1组和ITFC-2组骨小梁分离度均低于正常对照组(P＜0.05或P＜0.01) ，骨小梁面积百分比高于正常对照组(均P＜0.05) ；ITFC-1组骨小梁数量和宽度增加，但与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05) ；ITFC-2组骨小梁数量和宽度增加与正常对照组差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01) 。与ITFC-1组比较，ITFC-2组骨小梁数量、骨小梁面积百分比及骨小梁分离度差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01) ，见表 2。提示ITFC可通过增加骨小梁数量、面积、宽度，降低骨小梁分离度，改善骨组织形态结构，且高浓度效果较好。
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| A：正常对照组胫骨组织中骨小梁数量稀少、分离度较大，组织结构稀疏；B:ITFC-1组骨组织中网状结构稍有增加，骨小梁宽度增加；C:ITFC-2组骨组织中骨小梁网状结构致密，骨小梁数量明显增多. 红色表示骨小梁和皮质骨，蓝色表示骨髓腔，黑色表示骨骺线.标尺=1000 μm． 图 4 各组大鼠胫骨近心干骺端组织形态学变化 Fig. 4 Histomorphological changes of proximal tibia proximal metaphysis in rats |
| (x±s) | |||||
| 组别 | n | 骨小梁宽度(μm) | 骨小梁分离度(μm) | 骨小梁数量(/mm) | 骨小梁面积(%) |
| 正常对照组 | 10 | 51.22±4.17 | 222.96±9.74 | 3.92±0.23 | 25.56±1.57 |
| ITFC-1组 | 10 | 52.29±2.68 | 208.88±7.28* | 4.09±0.19 | 27.58±0.98* |
| ITFC-2组 | 10 | 55.24±3.29* | 170.02±9.85**## | 5.02±0.52**# | 35.64±1.52**## |
| 与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01 ；与ITFC-1组比较，#P＜0.05，##P＜0.01． | |||||
骨质疏松是老年性骨骼慢性疾病，易发生于绝经后的妇女，其特点是骨量减少或受损，骨强度下降，骨折的风险增加[7]。淫羊藿是小蘖科多年生草本植物，全草供药用，主治阳痿早泄、腰酸腿痛、四肢麻木、半身不遂、神经衰弱、健忘、耳鸣、目眩等症[8]。淫羊藿中的主要成分为淫羊藿苷，是抗骨质疏松的主要成分，具有开发成抗骨质疏松用药的前景[9]。青年期大鼠骨密度和骨组织微结构的增加有可能预防老年骨质疏松症的发生。本实验主要通过灌胃ITFC，设置两个浓度，研究其对生长期大鼠骨密度和组织形态学的影响，并探索其中的作用机制。其中，大鼠灌胃浓度的选择来源于成人剂量和大鼠之间的换算，降低一半为低浓度药物组。
骨密度是检测骨质量的重要指标，通过骨密度检测，可以初步判定骨折发生的可能性[10]。全身骨密度检测可以初步判定药物是否对骨代谢有影响。本实验12周时的数据显示，ITFC可显著增加大鼠的全身骨密度和离体骨密度，其中高浓度ITFC的作用效果更为明显。需要注意的是，在灌胃4周和8周时，与正常对照组比较，ITFC组大鼠骨密度均有增高趋势，但差异无统计学意义，提示ITFC作用于机体需要累积作用。
血清生物化学指标能反映骨代谢的本质，是骨形成和骨吸收的直观反映，能客观地评价骨转换效率[11]。血清中有许多骨形成和骨吸收的相关因子，本研究选择的骨形成相关因子BALP和骨吸收相关因子TRACP 5b是目前骨代谢研究中比较热门的血清骨转换因子。骨形成相关因子增加，骨吸收相关因子降低，是增加骨量最有效的途径。本研究结果显示，ITFC能显著提高大鼠血清中BALP的含量，且高浓度ITFC对TRACP 5b的含量有降低的作用。说明ITFC可促进血清中骨形成相关因子的表达，高浓度ITFC有抑制骨吸收相关因子表达的作用。因此，ITFC抗骨质疏松的作用可能是通过增加骨形成、抑制骨吸收来实现的。
骨形态计量学指标是对骨组织微结构的重要评价指标，反映机体组织形态学方面的变化。本实验观察结果显示，ITFC能显著改善骨组织微细结构，尤其能够增加骨小梁数量和面积百分比，高浓度的ITFC还能够增加骨小梁宽度，降低骨小梁分离度，说明ITFC也能够通过改善骨组织微结构来增加骨质量。
综上所述，ITFC可以通过提高大鼠骨密度、增加骨形成、降低骨吸收、改善骨组织微结构来预防骨质疏松的发生。
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