2. 浙江省立同德医院检验科, 浙江 杭州 310012
2. Clinical Laboratory, Tongde Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou 310012, China
CMV感染是导致异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)受者术后感染和死亡的重要原因之一[1-3]。CMV-IgM抗体是机体发生CMV活动性感染的指标, pp65抗原是机体发生抗原血症的主要抗原之一; 因此, 移植受者发生pp65抗原血症和IgM抗体阳性通常是诊断CMV激活感染的重要指标[4-5]。
T细胞受体(TCR)通过位于β链可变区域(BV)的互补决定区(CDR3)与抗原肽结合[6]。在CMV激活状态下, TCR与CMV特异性抗原通过CDR3介导相互作用, 导致抗原特异性T细胞克隆增殖[7]。一种特定的CDR3序列可代表一个T细胞克隆, 故通过检测特定CDR3序列出现的频率, 可反映某种特定T细胞克隆扩增程度及HSCT受病毒激活和机体免疫功能重建的状况[8]。
CMV激活与机体的免疫应答密切相关, 临床研究多以测定CMV感染指标为主, 本研究结合TCR BV家族分子特征分布, 了解CMV激活状态下HSCT受者体内的免疫应答状态, 分析HSCT受者术后TCR表达与CMV激活感染的关系, 为CMV激活感染的早期诊断, 以及为其将来作为免疫治疗靶点打下基础。
1 材料与方法 1.1 标本来源选择2009年8月至2012年6月在浙江大学医学院附属第一医院接受HSCT的受者7例, 其中男性5例, 女性2例; 年龄18~48岁, 中位年龄23岁。基础疾病:急性髓细胞白血病2例, 急性淋巴细胞白血病3例, 急性粒单核细胞白血病1例, 急性杂合细胞性白血病1例。所有受者干细胞来源为外周血, 在移植前均接受预处理, 预处理方案为白消安、环磷酰胺加抗胸腺细胞球蛋白, 或阿糖胞苷、司莫司汀、白消安、环磷酰胺加抗胸腺细胞球蛋白。
选择同期健康对照者3名。7例移植受者和3名健康对照者均排除HIV、肝炎病毒(HBV、HCV、HDV、HEV)、单纯疱疹病毒(HSV)和EB病毒感染, CMV-IgG均为阳性。
术后3个月分别采集新鲜外周血3~5 mL, 抗凝, 用淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)用于TCR检测和抗原血症检测。术后第3个月抽取新鲜外周血约5 mL, 分离血清用于抗体检测。
本研究方案经医院伦理委员会审批通过[(2015)科研快审第(437)号], 并获研究对象知情同意。
1.2 主要仪器及试剂荧光定量PCR仪型号为ABI 7500, 普通PCR仪型号为ABI 9700, 均购于美国应用生物系统公司; Ferment逆转录试剂盒购于美国Thermo公司; 全式金PCR扩增试剂由北京全式金生物技术有限公司提供; Promega试剂盒购自美国普洛麦格公司; CMV pp65单克隆抗体和EnVisionTM System检测试剂盒购自丹麦Abcam公司; 光学显微镜为日本奥林巴斯CHA213;MRC-5细胞和CMV标准株Towne细胞购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC); CMV-IgM检测采用意大利DiaPro Diagnostic BioProbes s.r.l.试剂盒, 酶标仪来自美国Bio-Bad公司。
1.3 采用荧光定量PCR熔解曲线分析技术检测TCRTRIzol法从PBMC中提取总RNA, 逆转录, 扩增cDNA; PCR扩增获得TCR BV家族熔解曲线图, 包括单克隆峰、寡克隆峰、多克隆峰(出现1个明显单峰为单克隆峰, 出现2个明显单峰为寡克隆峰, 出现3个或以上峰或宽型单峰为多克隆峰[9])。挑选单克隆峰、寡克隆峰的样本进行PCR扩增。取PCR产物5 μL 1.2%琼脂糖凝胶进行电泳, 将电泳结果只有一个条带且大小为200~300 bp的样品测序。用Chromas软件分析测序结果, 将碱基序列翻译成氨基酸序列并进行序列比对分析。
1.4 采用免疫组织化学法检测CMV-pp65抗原血症分离白细胞, 涂片。以正常MRC-5细胞和Towne株感染的MRC-5细胞分别作为阴性对照和阳性对照。阳性细胞呈棕黄色或棕褐色, 阴性细胞呈淡蓝色。阳性结果以阳性细胞数/5×104白细胞表示, 有1个及以上pp65阳性细胞判为pp65抗原血症阳性。检测三次, 取平均值用于统计学分析。
1.5 采用ELISA法检测CMV-IgM按照说明书操作, 以样本吸光度值与临界值(cut-off)的比值(S/CO值) > 1判定为阳性, 检测三次, 取平均值用于统计学分析。
1.6 统计学方法采用Fisher检验分析TCR BV单克隆家族表达在CMV抗原血症阳性组与抗原血症阴性组之间, 以及在CMV-IgM阳性组与CMV-IgM阴性组之间的差异。采用Prism 5.0软件进行统计学分析, P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 TCR BV家族表达情况3名健康对照者24个TCR BV家族均表达, 各家族PCR产物的熔解曲线谱型图呈现熔点不同的CDR3多态性, 为多克隆峰的高斯分布。
7例受者移植后TCR BV家族CDR3谱型PCR扩增结果显示TCR BV部分家族呈单克隆峰、寡克隆峰。7例受者表达单克隆峰的TCR BV家族各不一样, 其中BV9、BV11各出现4次, BV17、BV20各出现3次, BV1、BV13.2、BV16、BV24各出现2次, BV5.2、BV18、BV21、BV22各出现1次, 未发现其它TCR BV家族CDR3谱型的单克隆表达, 见表 1。
| 受者编号 | TCR BV家族 | CDR3 |
| 1 | BV1 | VSQTVAGIYNEQ |
| BV13.2 | PLAEQ | |
| 2 | BV1 | VADPSGPYNEQ |
| BV11 | LGDEQ | |
| BV20 | VTSGGFYNEQ | |
| BV22 | AVVSGTEQ | |
| BV24 | RVAGETQ | |
| 3 | BV9 | QVRGGTDTQ |
| BV11 | VATDEQ | |
| BV17 | IGQGNTEA | |
| 4 | BV16 | PFGGQGSYEQ |
| BV18 | PEGTGL | |
| BV24 | RDQGGQVNYGY | |
| 5 | BV5.2 | FEKTGANTGS |
| BV9 | QVRGGTDTQ | |
| BV16 | QDRVEL | |
| BV17 | IGQGNTEA | |
| BV20 | VGLAANEQ | |
| 6 | BV9 | QVRGGTDTQ |
| BV11 | VATDEQ | |
| BV13.2 | PLAEQ | |
| BV17 | IGQGNTEA | |
| BV20 | VGLAANEQ | |
| 7 | BV9 | QVRGGTDTQ |
| BV11 | VATDEQ | |
| BV21 | GMIGRLTDTQ |
对受者TCR BV家族在熔解谱型图上表现为单克隆峰、寡克隆峰的样本进一步扩增并测序, 测得CDR3区的氨基酸长度为5~12(aa)。经比较发现有共同的CDR3序列, 其中表达BV9的4例受者中发现含有“QVRGGTDTQ”共有氨基酸序列; 表达BV11的3例受者中发现含有“VATDEQ”共有氨基酸序列, 另1例受者中含有“LGDEQ”氨基酸序列; 表达BV17的3例受者中含有“IGQGNTEA”共有氨基酸序列; 表达BV20的3例受者中含有“VGLAANEQ”共有氨基酸序列, 见图 1。
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| 图 1 7例异基因造血干细胞移植受者T细胞受体β链可变区域(TCR BV)互补决定区(CDR3)谱型图 Fig. 1 TCR BV CDR3 spectratyping in 7 HSCT recipients |
随访过程中, 有2例受者发生移植物抗宿主病(GVHD)。其中受者2 TCR CDR3单克隆表达TCR BV1、BV11、BV20、BV22、BV24家族, 受者4 TCR CDR3单克隆表达BV16、BV18、BV24家族。虽然这2例受者均单克隆表达了TCR BV24, 但是测序结果并未发现有共同的CDR3氨基酸序列。
2.2 HSCT受者CMV激活感染指标检测 2.2.1 CMV-pp65检测结果7例受者中, CMV-pp65抗原血症检测阳性5例、阴性2例。5例阳性受者pp65阳性细胞数为(2~15)个/5×104白细胞, 见表 2。
| 受者编号 | CMV-pp65(个/5×104白细胞) | CMV-IgM (S/CO值) |
| 1 | 阳性(4) | 阳性(2.400) |
| 2 | 阳性(3) | 阴性(0.051) |
| 3 | 阴性(0) | 阴性(0.077) |
| 4 | 阳性(15) | 阳性(12.100) |
| 5 | 阳性(2) | 阳性(3.100) |
| 6 | 阴性(0) | 阴性(0.064) |
| 7 | 阳性(2) | 阴性(0.098) |
| 表中数值均为检测三次的平均值. | ||
7例受者中, CMV-IgM阳性3例, 阴性4例, 见表 2。
2.3 TCR BV家族CDR3谱型表达与CMV激活感染指标的相关性 2.3.1 TCR BV家族CDR3谱型表达与CMV-pp65抗原血症7例受者移植术后3个月检测CMV-pp65, 有5例出现CMV-pp65抗原血症, 其TCR BV家族各不相同。统计学分析结果显示, TCR BV家族CDR3谱型表达在CMV-pp65抗原血症阳性受者与阴性受者中差异无统计学意义(均P > 0.05), 见图 2; 5例CMV-pp65阳性的受者其TCR BV家族CDR3谱型表达也各不相同。结果没有发现与CMV抗原血症相关的特定TCR BV家族。
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| 图 2 CMV-pp65阳性与阴性异基因造血干细胞移植受者TCR BV家族CDR3谱型表达比较 Fig. 2 Comparison of TCR BV CDR3 spectratyping between CMV-pp65-positive and -negative recipients |
将受者分为CMV-IgM阳性组与CMV-IgM阴性组, 分析表达的TCR BV家族。结果TCR BV11表达CMV-IgM阳性组与阴性组差异有统计学意义(P < 0.05), 而CMV-IgM阳性组均不表达TCR BV11;TCR BV1、TCR BV5.2、TCR BV9、TCR BV13.2、TCR BV16、TCR BV17、TCR BV18、TCR BV20、TCR BV21、TCR BV22、TCR BV24的表达在两组之间的差异无统计学意义(均P > 0.05), 见图 3。TCR BV11可能是与CMV激活相关的特定TCR BV家族CDR3谱型。
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| 图 3 CMV-IgM阳性与阴性异基因造血干细胞移植受者TCR BV家族CDR3谱型表达比较 Fig. 3 Comparison of TCR BV CDR3 spectratyping between CMV-IgM-positive and -negative recipients |
在CMV-IgM阳性组中, 受者4 CMV-IgM的S/CO值最高, 单克隆表达3个TCR BV家族; 受者1和受者5 CMV-IgM的S/CO值较低, 单克隆表达2个和5个TCR BV家族。另外, 3例CMV-IgM阳性的受者中, 几乎没有重复表达的TCR BV家族, 仅受者4和受者5同时单克隆表达了TCR BV16, 但并不存在共同的氨基酸序列。
3 讨论CMV是HSCT受者感染的常见病原体[10-11]。HSCT受者在移植术后3个月左右, 免疫功能低下, 容易发生CMV激活感染[12]。CMV-pp65抗原血症和CMV-IgM阳性是CMV激活感染的指标[4-5]。本研究7例HSCT受者中, 5例出现CMV-pp65抗原血症阳性, 3例出现CMV-IgM阳性。受者1、4、5抗原血症和CMV-IgM都阳性, 受者2、7抗原血症阳性而CMV-IgM阴性, 说明在CMV激活感染情况下, CMV-pp65抗原比CMV-IgM抗体更易检测到。
机体通过TCR识别CMV抗原产生特异性细胞免疫, 通过体液免疫在血清中产生CMV抗体[13]; CMV-pp65抗原刺激可引起特定的CDR3区的T细胞扩增, TCR BV亚家族出现单克隆或寡克隆基因表达[14]。机体免疫功能受损是HSCT受者CMV激活的主要原因[15-16], TCR BV谱型检测能很好地反映机体免疫功能状况[17]。因此分析HSCT受者CMV激活与TCR BV家族谱型的关系, 能了解CMV感染后HSCT受者体内的免疫应答状态; 同时分析TCR BV谱型可以鉴定出与CMV感染相关的特定T细胞克隆, 具有特异性CDR3谱系的T细胞克隆可作为分子标志物, 在疾病早期未出现明显的临床症状之前就作出诊断, 并可能指导进一步的免疫治疗。
正常机体的TCR BV家族为多克隆表达, 机体免疫功能低下或受损时TCR BV家族可出现单克隆、寡克隆表达。本研究中健康对照者TCR 24个BV家族均为多克隆表达, 而7例HSCT受者TCR BV家族呈单克隆、寡克隆表达。有报道TCR BV谱型表达与病毒感染关系密切, 机体TCR BV家族CDR3谱型能反映T细胞在病毒活动性感染状态下的免疫应答功能[18-19]。本研究的7例受者已排除其他病毒感染, 其表达的同一TCR BV家族大多有共同的CDR3序列:BV9共有序列“QVRGGTDTQ”, BV11共有序列“VATDEQ”, BV17共有序列“IGQGNTEA”, BV20共有序列“VGLAANEQ”。这些共同的氨基酸片段是否与CMV感染有关, 在CMV激活的过程中起了什么作用还有待进一步研究。在CMV感染激活状态下分析特定CDR3谱系在HSCT受者术后免疫重建尚不完善时具有诊断意义, 与CMV相关的特定CDR3谱型的表达也可能可以用来预测移植受者CMV的激活或清除情况。
TCR BV家族在CMV抗原血症阳性受者与阴性受者中的表达差异无统计学意义, 表明移植后3个月T细胞对CMV抗原的免疫无应答或应答较弱。而TCR BV11家族的表达在CMV-IgM阳性组与阴性组之间差异有统计学意义, 7例受者中4例CMV-IgM持续阴性的受者都表达了TCR BV11, 而CMV-IgM阳性的3例均不表达TCR BV11。有TCR BV11表达时CMV-IgM阴性, 说明TCR BV11可能干预了CMV的激活; 单克隆增殖的TCR BV11很可能参与了机体对CMV的T细胞特异性免疫应答, 与清除CMV或干扰CMV激活有关, 具体机制尚不明确。TCR BV11的表达在CMV-IgM阳性组与阴性组有差异, 而在CMV-pp65抗原阳性与阴性受者之间的表达无差异, 提示HSCT术后3个月机体需多重免疫相关因素才可能抑制CMV激活; 或者T细胞抑制CMV激活过程中可能存在多个BV家族的协同作用, 仅仅表达TCR BV11家族是不够的。因此, 临床上需要多个免疫学指标、从多角度研究CMV激活。
2例受者移植后发生了GVHD, 属移植后急性肠道GVHD和Ⅲ度皮肤GVHD。血清学检测结果为1例CMV-IgM阳性、1例CMV-IgM阴性, 虽然两者都表达了TCR BV24, 但未发现共同的CDR3氨基酸序列, 不能确定TCR BV24的表达是否与GVHD有关, 需进一步研究。
本研究初步探讨了HSCT受者移植后TCR BV家族CDR3谱型表达与CMV激活的关系, 其中TCR BV11的表达可能与抑制术后CMV激活有关。
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