急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia，AML)是一种异质性恶性克隆性疾病，系基因突变导致的造血干细胞/祖细胞克隆性增殖性失调引起的造血系统恶性肿瘤。每年约50%的中青年及80%以上的老年AML患者(>60岁)因原发耐药、缓解后复发及治疗相关并发症而死亡[1]。目前，尽管多种新药正在进行临床试验，但AML的治疗仍没有突破蒽环类药物联合阿糖胞苷的经典的“3+7”方案。异基因造血干细胞移植虽然是治疗AML最有效的方法，但适宜人群的局限性限制了其应用范围。因此我们亟需研发新的药物改善AML患者的总存活率及其生活质量。
在近十年内，研究人员通过基因测序识别出许多参与了表观遗传调控蛋白编码的重现性基因突变,提示白血病的发生与表观遗传学修饰异常密切相关，而DNA甲基化异常是其重要机制之一。DNA甲基化是指通过DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)将CG两个核苷酸的胞嘧啶催化成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的过程，它是细胞调节基因启闭的一种方式。异常的DNA甲基化会引起癌基因的活化以及抑癌基因的失活,导致白血病发生。本文总结了与AML相关的DNA甲基化酶突变的特点，阐述了AML重现性基因改变与甲基化异常的相关性及某些融合基因通过改变DNA甲基化状态参与白血病发病的机制，探讨了AML患者对化疗耐药与基因甲基化状态改变的关系，总结了国内外关于AML表观遗传学修饰异常的靶向治疗现状。
1 与AML相关的DNA甲基化大部分DNA甲基化发生在跨越启动子区域的CpG岛，但近期研究发现，在外显子区域、CpG岛岸(发生在CpG岛两侧2 kb的区域)及增强子区域也会发生频繁的甲基化调节。这些CpG岛外的甲基化在白血病的发生过程中同样具有重要作用[2]。参与甲基化调控的因素主要包括DNMT、TET(ten-eleven translocation)酶及IDH1/2酶(isocitrate dehydrogenase- 1/2)。
1.1 DNA甲基转移酶DNA的甲基化依赖于DNMT,后者主要包括DNMT1、DNMT3A和 DNMT3B。DNMT1主要负责DNA复制过程中的甲基化，即根据亲链的甲基化位点进行相应的甲基化修饰。DNMT3A和 DNMT3B则主要负责DNA的全新甲基化，即在原来没有甲基化的DNA双链上进行甲基化修饰。大约23%的AML患者会发生DNMT3A突变，这在正常核型AML患者中比例更高，约占36%[3]。其主要发生在DNMT3A催化区域的R882(R882H最常见)。研究显示DNMT3A基因突变者与非突变者的完全缓解率差异并无统计学意义，但DNMT3A突变者无病生存期和总生存期均明显缩短[4]。
DNMT3A对维持造血干细胞正常的自我更新及分化潜能具有重要意义[5]，其突变导致白血病发生的机制尚处于研究阶段。目前有两种假说，其一为单倍剂量不足：大约60%的DNMT3A突变是杂合性的，DNMT3A突变后，野生型DNMT3A的等位基因正常表达，但DNMT3A酶的水平只有正常的50%，不足以维持细胞的正常功能[6]。另一种假说为显性抑制效应。Kim等[7]研究显示，突变的DNMT3A蛋白可能通过与野生型DNMT3A和DNMT3B形成无功能的二聚体，从而抑制野生型蛋白的正常功能。正常小鼠移植敲除DNMT3A的造血干细胞后，会引起造血干细胞的自我更新增加及分化受阻，形成前白血病干细胞(LSC)[5]。当合并有二次打击(例如C-KIT、FLT3-ITD突变)时，后者即可进展为白血病。
此外，DNMT1对LSC功能的维持也具有重要意义。研究发现AML患者DNMT1的表达水平远远高于健康人群，而在获得完全缓解后,DNMT1的水平又有明显下降[8]。在敲除DNMT1的小鼠模型中，DNMT1单倍剂量不足并不会影响正常的造血功能,但却能够延迟白血病的发生、发展，损伤LSC的自我更新[9]。
1.2 DNA的羟甲基化和TET酶最初，人们认为DNA甲基化是一种相对稳定的DNA修饰，但随着TET酶的发现，人们意识到DNA甲基化是一个动态的过程。TET酶家族(TET1-3)是一组依赖亚铁离子和α-酮戊二酸(α-KG)的双加氧酶，能够催化5-mC向5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)转化。这种修饰能够阻止蛋白质结合并识别甲基化的DNA，从而逆转某些基因的转录沉默。TET2突变发生在8%的AML患者中[10]，在中危组或正常核型AML患者中更常见，约占23%[11]。在我国，TET2突变率约为14%[12]。在正常核型AML患者中，无论FLT-ITD突变与否,TET2突变均提示预后不良。
目前5-hmC及其衍生物的确切功能尚未完全阐释。有研究显示,5-hmC及其衍生物是去甲基化的重要媒介，能够招募和(或)抑制特定的DNA结合蛋白及逆转基因转录沉默[13]。在胚胎干细胞的5-hmC全基因组图谱中研究发现，5-hmC最常分布在转录起始位点及基因体内，且外显子较内含子多见[14-15]。在伴有TET2突变的髓系恶性肿瘤中，5-hmC的整体表达水平是降低的[16-17]。
2011年的三项研究显示，TET2缺失将会导致干祖细胞池渐进性扩增、造血干细胞自我更新增强、增殖性髓系恶性肿瘤进行性发展(例如慢性粒—单核细胞白血病)[18-20]。伴有TET2突变的小鼠并不一定会发生白血病，但是同时伴有FLT3-ITD突变时，发生白血病的概率将会增加[21]。
1.3 IDH1酶和IDH2酶IDH1/2酶能够催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸(α-KG)，而TET蛋白发挥作用依赖于α-KG。IDH1突变(最常位于Arg132)或IDH2突变(最常位于 Arg140或Arg172)将会产生异常的代谢产物——2-羟戊二酸(2-HG)。2-HG是α-KG的竞争性抑制剂,其生成的增加将会抑制TET2活性。同源二聚体酶IDH1和IDH2的突变占AML患者的5%~30%。在正常核型AML患者中，IDH1和 IDH2的突变更多见，分别占10%~19%和10%~16%[10, 22-23]。TET2和DNMT3A突变与正常核型AML患者预后不良相关,而关于IDH1/2突变尽管进行了多个大型对照试验，其与预后的相关性仍不明确[24]。有研究显示，该突变在促进白血病发生中可能与FLT3-ITD和NPM1基因起协同作用[25]。
最近，Sasaki等[26]在伴有IDH1(R132H)突变的小鼠模型中研究发现，突变小鼠能够产生对照组10倍以上的2-HG，但它们的寿命却无明显差异。与此同时，实验组小鼠表现为年龄依赖性的脾肿大(由髓外造血引起)及骨髓增生低下。虽然突变小鼠最初干祖细胞池是扩增的(特别是多能祖细胞)，但各系细胞分化减少。这提示IDH1突变实质上对造血细胞分化具有抑制作用并呈年龄依赖性。
除了上述IDH1/2突变对造血系统的影响，2-HG过量还会导致髓系分化和依赖细胞因子的TF-1细胞受损(TF-1细胞通常依赖粒细胞集落刺激因子生长)[27]。Losman等[27]利用可透过胞膜的2-HG的R、S对映异构体进行研究，发现2-HG中的R-2HG负责生长转化，而S-2HG则没有这项功能。进一步分析这种现象发现，R-2HG的这种转化作用可能与R-2HG作为辅因子促进EglN脯氨酸—4-羟化酶的活性有关。与此同时，研究者发现敲除EglN能够阻止因高2-HG水平或IDH1突变引起的TF-1细胞转变。有趣的是，敲除EglN同样也可以阻止TET2缺失引起的TF-1细胞的转变。这就提示EglN 脯氨酸—4-羟化酶的活性可能是白血病伴TET2或IDH1突变的治疗靶点。
2 AML重现性基因改变与甲基化异常的相关性全基因组测序发现，DNA甲基化谱可用于AML的分型。部分新的分组与传统的以重现性基因改变为特征的AML亚型具有一致性[28]。伴有MLL/AF9、AML1/ETO 或CBFB/MYH11融合蛋白表达的AML都具有特定的甲基化谱[29]。一些表观遗传学改变可能会导致转录因子缺失。有证据表明，转录因子对指导DNMT活性、改变DNA甲基化状态具有一定作用。如EVI1与DNMT3A和DNMT3B相互作用引起启动子区域的异常甲基化[30]；PML-RARα与DNMT3A相互作用抑制下游基因转录[31]；此外，DNMT1可能是RUNX1/MTG8-DNMT1转录抑制复合物的一部分，后者作为负性调控蛋白与DNMT1相互作用抑制靶基因转录[32]。
一些融合基因将会导致DNA甲基化状态改变，参与白血病发病。其中AML1/ETO与 HIF1α相互作用反式激活DNMT3A导致DNA高甲基化，启动白血病发生[33]。AML1/ETO的拼接异构体AE9a能够招募蛋白质精氨酸甲基转移酶-1(PRMT1)，引起H4A3甲基化及激活转录，且PRMT1还能促进白血病细胞自我更新[34]。此外，AML1/ETO能够促进SFRP1甲基化，从而使Wnt信号通路靶基因如CCND1 和MYC表达下调，而Wnt信号通路失调在AML的发生中具有重要意义[35]。另外，针对PML-RARα与甲基化的关系也有许多研究。Manodoro 等[36]发现，在伴PML-RARα融合基因的急性早幼粒细胞白血病中，14q32高甲基化参与了其发病过程。Laursen等[37]认为RARα融合蛋白能削弱维甲酸诱导的细胞转录并且诱导CpG岛甲基化，通过调节特定启动子区域CpG岛甲基化水平来调控细胞记忆及形成其特征。但也有研究显示，PML-RARα对转录组及甲基化组的影响是有限的[38]。在白血病发生的始动机制中，DNA甲基化与PML-RARα融合基因是两个独立的因素[39]。异常的DNA甲基化虽然与白血病的核型相关，但在PML-RARα介导的白血病发生的始动机制中并不是必需的。DNA甲基化改变相对来说是一个晚期事件，其主要作用是维持白血病状态而不是启动白血病发生[40]。
3 异常甲基化与AML耐药的相关性许多研究显示，基因甲基化状态的改变与AML患者的化疗耐药相关。Liu 等[41]在HL60/ADR及K562的阿霉素耐药衍生细胞株中发现，组蛋白H3赖氨酸9(H3K9)及组蛋白H4赖氨酸20(H4K20)呈高甲基化。在青少年粒单核细胞白血病(JMML)患者中，伴有RASA4高甲基化者易发生耐药及移植后复发[42]。某些异常甲基化的基因还可以通过特定的信号通路引起白血病耐药。如：SFRP5 基因高甲基化能够激活 Wnt/β-catenin信号通路，上调MDR1/P-gp 的表达，维持白血病细胞内较低的药物浓度，由此逃避化疗药物的杀伤[43]。SHP1过甲基化会激活JAK/STAT通路引起白血病的耐药[44]。此外线粒体ATP合成酶β亚基(ATPsyn -β)基因高甲基化使其表达下调，在有氧条件下仍主要依赖无氧酵解产能引起阿霉素耐药[45]。
4 AML的甲基化靶向治疗AML的表观遗传学改变具有可逆性。应用DNA去甲基化药物可以逆转基因的甲基化状态，达到治疗的效果。目前，大部分去甲基化药物还处于研究阶段。关于去甲基化药物有效性的评定也尚无统一标准。越来越多的数据表明，去甲基化药物对不适合强化治疗的患者有一定疗效，但其治疗效果具有很大的个体差异性。前述白血病可以通过表观遗传学特征进行分类[27]，具有特定DNA甲基化特征的AML亚型可能对DNMT抑制剂具有更高的反应性。下面我们主要阐述几种已进入临床应用的代表性药物。
4.1 阿扎胞苷阿扎胞苷(5-氮杂胞苷)是核苷类DNMT抑制剂的代表性药物之一。大剂量阿扎胞苷能够特异性作用于细胞周期的S期，迅速磷酸化并掺入DNA和RNA中，抑制DNA合成，阻碍RNA及蛋白质合成，产生细胞毒性作用。小剂量阿扎胞苷能够抑制DNMT1及DNMT3A，使抑癌基因去甲基化。目前阿扎胞苷已被批准用于治疗骨髓增生异常综合征 (MDS)及原始细胞计数较少的AML患者。
两项研究奠定了阿扎胞苷在AML治疗中的地位。一项多中心Ⅲ期临床试验共入组103例AML患者，入组标准为患者骨髓原始细胞比例20%~30%。实验组以阿扎胞苷每天75 mg/m2 的剂量连续7 d皮下注射，28 d为1个疗程；对照组不给予任何治疗。实验组的反应率为35%~48%，总体生存期为19.3个月，对照组为12.9个月[46]。在美国进行的另一项阿扎胞苷治疗高危MDS(入组标准同前)的临床试验中，实验组同样以阿扎胞苷每天75 mg/m2的剂量连续7 d皮下注射，28 d为1个疗程；对照组用传统治疗方案，包括最好的支持治疗、低剂量阿糖胞苷及大剂量化学药物治疗。阿扎胞苷组的总生存期为24.5个月，对照组为16个月，阿扎胞苷组有明显的生存获益[47]。关于其疗效的评定，Itzykson 等[48]在预测阿扎胞苷对高危MDS患者反应性及总体生存期的研究中指出：基因甲基化水平的预后价值仍然是有争议的，关于微RNA及基因表达水平的预后价值仍需在多中心研究中验证。
4.2 地西他滨地西他滨类似于5-氮杂胞苷，也是DNMT抑制剂的代表性药物之一。它是一种2′-脱氧胞苷类似物。高浓度时能够作用于增殖期(S期)细胞，具有细胞毒作用；低浓度时具有去甲基化作用，在体内外均能通过抑制DNMT使抑癌基因恢复正常的去甲基状态，重新激活因DNA过甲基化失活的基因，恢复正常的细胞分化、衰老或凋亡。地西他滨同样批准用于治疗MDS或原始细胞数较少的AML患者。在欧洲，地西他滨也可用于治疗原始细胞比例超过30%的不适合强化治疗的老年白血病患者。下面是关于地西他滨在AML患者中应用的一些重要的临床试验。
Lübbert等[49]进行了一项多中心Ⅱ期临床研究，该项目共入组227例AML患者，在72 h内静脉滴注地西他滨 135 mg/m2，每6周重复一次为1个疗程，最多4个疗程。部分患者在第2个疗程接受了全反式维甲酸治疗和(或)每4~6周连续3 d给予地西他滨每天20 mg/m2维持治疗。最终患者总反应率为26%，中位生存期为5.5个月。在另外一项多中心Ⅱ期研究中，共入组55例AML患者(入组标准为骨髓原始细胞大于20%，年龄大于60岁，中高危)，地西他滨用量为每天20 mg/m2连续静脉滴注5 d，间隔4周重复一次，结果患者总反应率为25%，中位生存期为7.7个月。细胞遗传学检测提示，预后较差的AML患者以及有白血病前期病变的AML患者治疗反应较好[50]。在另一项Ⅲ期随机临床试验中，比较了上述相同剂量的地西他滨方案和单纯维持治疗以及小剂量阿糖胞苷方案的疗效，结果患者完全缓解率地西他滨组为17.8%，对照组为7.8%，总生存期分别为7.7个月和5.0个月，无明显获益；但随后的计划外数据分析显示，地西他滨组患者的生存获益具有统计学意义，这一结果促使欧洲药品管理局批准了地西他滨用于AML的治疗[51]。但有研究显示，伴有人血小板因子4(PF-4/CXCL4)或人血小板碱性蛋白(PBP/CXCL7)过表达的慢性粒单核细胞白血病(chronic myelomonocytic leukemia)患者对地西他滨的反应性较差[52]。
4.3 IDH1/2抑制剂针对IDH1/2酶突变的小分子靶向抑制剂正在早期临床试验中。AGI-6780是一种选择性IDH2 R140Q突变的抑制剂，在体外通过结合位于2-HG二聚体内侧的变构位点，诱导AML细胞系分化[53]。BCL2抑制剂(例如ABT-199)通过干扰电子传递链同样对IDH1/2突变的AML患者有一定疗效[54]。此外，IDH1 R132H突变能够激活肿瘤特异性潜在新抗原诱导特异性T细胞应答，其突变可能成为免疫接种策略的靶点[55]。与此同时，IDH1/2突变动物模型的建立使得在分子水平上研究药物的作用成为可能。
4.4 其 他至今针对TET2阳性的白血病仍无特异性治疗，但近期研究显示，去甲基化药物对TET2突变的MDS及AML具有一定疗效。此外，Shih等[56]研究显示，同时伴有FLT3-ITD及TET2突变的小鼠能够进展为AML并表现出特定的甲基化特征。这些小鼠中的GATA2基因因甲基化而发生沉默。DNMT抑制剂可以使肿瘤细胞重新编码诱导GATA2基因重现性表达从而抑制LSC的活性、降低白血病的发生率。
5 结 语高通量基因组技术的日益普及为我们提供了更精确的诊断和预后信息，使个体化医疗的实现成为可能。虽然表观遗传调控具有异质性，但其在血液系统恶性肿瘤发病过程中仍有共通点。我们可以通过模型寻找表观遗传的关键节点和调控途径。既往将基因突变整合入预后分析模型有助于我们选择适合的化疗方案。在发生基因组突变后，一些体细胞突变例如DNMT3A、TET2、IDH1/2突变等仍能通过某些信号通路改变患者的预后。这就为表观遗传学靶向药物的应用提供了更多的可能。但与此同时仍有许多问题亟待解决。治疗人群的选择是目前去甲基化治疗应用的难点。其理论基础是抑癌基因的过甲基化，该治疗的应用取决于患者的甲基化水平，因此明确抑癌基因的甲基化水平尤为重要。目前甲基化水平检测结果是全基因组甲基化的“总和”，尚不能区分具体基因的甲基化水平，这即是目前技术上存在的难点。而应用高通量基因检测方法进行甲基化相关基因的检测为我们带来了曙光。我们相信，随着生物医学技术的发展，越来越多的表观遗传学药物将运用于临床，与传统化疗方案相结合实现医疗个体化，改善AML患者总体存活率及生活质量。
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