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zeste基因增强子同源物2抑制剂GSK126对前列腺癌细胞的作用及机制
林伟仁1, 陈亚天2, 曾玲晖2, 应荣彪1, 朱锋2     
1. 浙江省台州市肿瘤医院内科, 浙江 温岭 317502 ;
2. 浙江大学城市学院医学院, 浙江 杭州 310015
摘要: 目的 探究zeste基因增强子同源物2(EZH2)抑制剂GSK126对前列腺癌细胞增殖、凋亡及迁移的作用及机制。 方法 以磺酰罗丹明B实验考察GSK126对PC-3和DU145细胞增殖的影响,以Annexin V/PI双染法考察GSK126对细胞凋亡的影响,以Transwell实验和细胞划痕实验观察GSK126对细胞迁移和侵袭的影响,以荧光定量PCR检测GSK126对肿瘤相关基因mRNA表达的影响,以蛋白质印迹法检测相关蛋白水平的变化。 结果 GSK126仅在50.0μmol/L的高浓度剂量时能有效抑制PC-3和DU145细胞增殖,并促进其凋亡。经GSK126小、中、大剂量(5.0、20.0、50.0μmol/L)处理后,PC-3细胞划痕间距分别为(247.2±24.4)μm、(347.2±19.2)μm、(410.5±18.1)μm,与对照组(171.3±17.8)μm比较差异均有统计学意义(均P < 0.05),且呈一定的量效关系。Transwell实验结果显示,每视野下侵袭的PC-3细胞数对照组为322.0±17.9,而经GSK126小、中、大剂量处理后分别为198.3±15.4、82.7±6.2、30.2±4.1,与对照组比较差异均有统计学意义(均P < 0.05)。GSK126处理前列腺癌细胞后,与上皮细胞间质转化相关的E-cadherin基因mRNA表达量上升,N-cadherin、Vimentin基因mRNA表达量下降,但Snail、Fibronectin、VEGF-A基因的mRNA表达无变化。同时,蛋白质印迹法检测结果提示,E-cadherin的蛋白表达量增加,而VEGF-A蛋白表达量无明显改变。DU145细胞上述实验结果相似。 结论 GSK126能有效抑制PC-3细胞和DU145细胞迁移和侵袭,其机制与抑制上皮细胞间质转化相关。GSK126可作为潜在的前列腺癌临床治疗用药。
关键词: 基因, 肿瘤抑制/药物作用     前列腺肿瘤/药物疗法     肿瘤蛋白质类/生物合成     蛋白甲基转移酶类     细胞运动     细胞增殖     细胞凋亡     细胞系, 肿瘤    
Effect of a novel EZH2 inhibitor GSK126 on prostate cancer cells
LIN Weiren1, CHEN Yatian2, ZENG Linghui2, YING Rongbiao1, ZHU Feng2     
1. Department of Internal Medicine, Taizhou Cancer Hospital, Wenling 317502, China ;
2. School of Medicine, Zhejiang University City College, Hangzhou 310015, China
Corresponding author: ZHU Feng, E-mail:zhuf@zucc.edu.cn; http://orcid.org/0000-0002-3220-6762
Abstract: Objective To investigate the effect of a novel EZH2 inhibitor GSK126 on cell growth, apoptosis and migration of prostate cancer cells. Methods Prostate cancer PC-3 and DU145 cells were treated with GSK126 at different doses. Cell growth was detected by sulforhodamine assay. Cell apoptosis was assayed by Annexin V-/PI kit. Transwell chamber and wound healing assays were conducted to detect cell migration. The mRNA level was detected by quantitative PCR, and protein expression was detected by Western blot analysis. Results GSK126 showed significant effect on cell growth and apoptosis when the dose was higher than 50μmol/L. Wound healing assay revealed that scratch space in PC-3 cells was significantly increased in a dose-dependent manner in GSK126-treated groups[(247.2±24.4), (347.2±19.2) and (410.5±18.1)μm in low, medium and high dose (5.0, 20.0, 50.0μmol/L), respectively] as compared with the control group[(171.3±17.8)μm](all P < 0.05). Transwell assay showed that migrated PC-3 cells in control group was 322.0±17.9, while those in GSK126-treated groups were 198.3±15.4 (low), 82.7±6.2 (medium) and 30.2±4.1 (high), and the differences between the control group and GSK126-treated groups were significant(all P < 0.05). In addition, GSK126 up-regulated E-cadherin mRNA expression and down-regulated N-cadherin and Vimentin mRNA expression, whereas had no significant effect on Snail, Fibronectin and VEGF-A mRNA expression. The protein expression of E-cadherin was elevated but VEGF-A protein did not change in GSK126-treated groups. Similar results were exhibited in DU145 cell. Conclusion GSK126 can significantly inhibit cell migration and invasion in prostate cancer PC-3 and DU145 cells, which may be resulted from its effect on epithelial-mesenchymal transition. GSK126 may be used as a potential anti-prostate cancer dug in clinic.
Key words: Genes, tumor suppressor/drug effects     Prostatic neoplasms/drug therapy     Neoplasm proteins/biosynthesis     Protein methyltransferases     Cell movement     Cell proliferation     Apoptosis     Cell line, tumor    

前列腺癌是全球范围内男性第二常见的癌症[1],好发于老年人,以65岁以上者居多,其病死率随着年龄增长而增加[2]。在我国,由于人口老龄化加剧、生活水平提高以及生活方式改变等因素,前列腺癌发病率呈显著增长趋势。大多数患者潜伏期很长,而且前列腺肿瘤细胞生物学特性多变,加上老年患者体质差异较大,导致前列腺癌的诊断和治疗难度大大增加[3-4]

Zeste基因增强子同源物2 (enhancer of zeste homolog 2,EZH2)为多梳基因蛋白家族的主要成员之一,可调节组蛋白H3K27甲基化,在基因沉默和转录抑制中发挥重要作用。对EZH2的研究早期主要集中在调节人体造血系统功能方面,但近年的研究发现,EZH2在肿瘤发生、发展中有着至关重要的作用[5]。过度表达的EZH2可通过调节RKIP基因、上皮细胞间质转化相关基因以及雄性激素相关基因等途径促使前列腺癌恶化,而敲除EZH2可明显抑制前列腺癌的增殖与转移[6]

GSK126是一种新型EZH2抑制剂,2012年首次研究发现GSK126在体外与体内实验中均能有效抑制人B细胞淋巴瘤增殖,同时提高移植瘤模型小鼠的存活率[7]。目前关于GSK126在实体瘤的药效探究相对较少,仅在前列腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌方面有初步报道[8-10],其在实体瘤转移中的作用及机制研究还鲜有报道。因此,深入开展相关研究以探寻GSK126的抗肿瘤作用机制,有助于为临床实践提供坚实的实验依据和理论基础。

我们在前期研究中发现,GSK126能抑制胃癌和肺癌的生长和转移,其抑制胃癌转移的作用与下调血管内皮生长因子(VEGF)-A的表达相关[11]。本研究在明确GSK126对前列腺癌细胞增殖、凋亡及迁移能力影响的基础上,通过Transwell技术、蛋白质印迹法、荧光定量PCR等实验方法进一步探究GSK126对上皮细胞间质转化的干预作用,进一步充实GSK126抗肿瘤作用的分子生物学机制。

1 材料与方法 1.1 试 剂

GSK126购自上海瀚香生物科技有限公司,先溶解于DMSO,保存于-20℃冰箱中,实验时用培养基稀释至终浓度。磺酰罗丹明B(sulforhodamine,SRB)粉末购自美国Sigma公司,Annexin V/PI凋亡试剂盒购自美国Life Technologies公司,Transwell小室购自美国Corning公司,DMEM/F12和RPMI1640培养液购自美国Gibco公司。mRNA提取用Trizol、逆转录酶SuperscriptⅢ 及SYBR试剂均购自日本TaKaRa公司。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。E-Cadherin抗体购自美国Cell Signaling Technology公司,VEGF-A抗体购自英国Abcam公司。流式细胞仪 FACSCalibur购自美国BD公司,DMI3000B荧光倒置显微镜购自德国Leika公司,CFX96荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养

人前列腺癌细胞PC-3用含10%FBS的DMEM/F12(1∶1)培养基培养,DU145细胞用含10%FBS的RPMI 1640培养基培养,均于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养,细胞传代处理时用胰蛋白酶消化,以含血清培养基终止消化,离心后以新鲜培养液重悬,接种于细胞培养瓶或者培养板中。

1.3 SRB实验观察细胞增殖抑制率

取对数生长期的细胞消化后计数,以每孔4×103个细胞接种于96孔板中,培养24 h后予GSK126,在1.9、3.8、7.5、15.0、30.0、60.0 μmol/L六种药物浓度下观察肿瘤细胞的增殖情况,每种药物浓度设平行三孔,对照组给予含相同浓度DMSO的等容量培养基。继续培养48 h后收集细胞,弃去培养液,先加入10%三氯乙酸4 ℃固定1 h,经蒸馏水冲洗后自然晾干。然后采用1%冰醋酸配制的SRB溶液染色15 min,并用1%冰醋酸冲洗后自然晾干,加10 mmol Tris溶解后酶标仪测定吸光度值。计算细胞增殖抑制率:肿瘤细胞增殖抑制率(%)=(1-给药组吸光度值/对照组吸光度值)×100%,并计算半数有效抑制浓度。

1.4 Annexin V/PI双染检测细胞凋亡率

取对数生长期的细胞消化后计数,以每孔5×104个细胞接种于12孔板中,培养24 h后给药,参照我们之前的实验,设定GSK126的小、中、大浓度分别为5.0、20.0、50.0 μmol/L,每个浓度设平行三孔,对照组给予含相同浓度DMSO的等容量培养基,作用48 h后收集细胞,经PBS洗涤两次,调整细胞浓度为2×105个/L,加入195 μL结合液重悬细胞后,加入5 μL AnnexinV-FITC混匀,室温避光孵育10 min 后离心,弃上清液。然后加入190 μL结合液轻轻重悬细胞,再加入10 μL PI混匀,于1 h内用流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.5 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

将细胞以每孔5×105个的密度接种于24孔板,至90%汇合度时,用200 μL灭菌移液器枪头对贴壁细胞制造划痕,然后更换含药培养液(500 μL/孔),使其终浓度达到设计浓度,对照组给予含相同浓度DMSO的等容量培养基,每个浓度剂量组设三个平行孔。继续培养72 h后去培养液,PBS清洗两次,用4%甲醛固定细胞 30 min,用结晶紫法染色细胞,拍照记录给药后划痕区的相对距离。

1.6 Transwell实验检测细胞的迁移情况

细胞用无血清培养液饥饿处理12 h后消化,置无血清培养液中重悬,接种于上室(200 μL/孔,4×104/孔),下室放入不含或含不同浓度GSK126的培养液(500 μL/孔)。置于培养箱72 h后,用PBS清洗上室和下室一次,用预冷的4%甲醛固定30 min,擦净滤膜内表面细胞,用0.1%结晶紫进行染色。显微镜下随机选取3个视野拍照,采用Image-Pro Plus 6.0计算侵入下层的细胞数目。

1.7 荧光定量PCR检测上皮细胞间质转化相关基因mRNA表达量

细胞以每孔5×105个的密度接种于六孔板中,培养24 h后给药,分GSK126给药组(5.0、20.0、50.0 μmol/L)及对照组(给予含相同浓度DMSO的等容量培养基),作用48 h后收集各组细胞,采用Trizol一步法提取各组细胞总RNA,采用Superscript Ⅲ逆转录酶50 °C下作用1 h将mRNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板应用SYBR进行荧光定量PCR反应,20 μL反应体系为:2×Ultra SYBR Mixture 10 μL,10 μmol/L的上游和下游引物各1 μL(引物序列见表 1),cDNA 2 μL,去核糖核酸酶水6 μL。PCR反应条件为95 ℃变性30 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,共计39个循环。每种mRNA重复至少三次,以β-actin为内参,并以 2-△△Ct法计算并比较不同组EZH2基因mRNA表达量。

表 1 实时荧光定量PCR引物 Table 1 Primer sequences of real-time quantitative PCR
名称引物序列(5′-3′)
Vimentin正向: AGCATCTCCTCCTGCAATTT
反向: AGGTGGACCAGCTAACCAAC
N-cadherin正向: CTGAGCCTCACCTGTGCGC
反向: GAAGTTACCTGCGGCTAGC
E-cadherin正向: ACAACGCCCCCATACCAGA
反向: CACTCGCCCCGTGTGTTAGT
Snail正向: CCCCAATCGGAAGCCTAACT
反向: AGATGAGCATTGGCAGCGA
Fibronectin正向: GAAGCTCTCTCTCAGACAACCA
反向: GCCCACGGTAACAACCTCTT
VEGF-A正向: CTTGCCTTGCTGCTCTACC
反向: ACACAGGATGGCTTGAAGATG
β-actin正向: TCCATCATGAAGTGACGT
反向: TACTCCTGCTTGCTGATCCAC
1.8 蛋白质印迹法检测E-cadherin及VEGF-A蛋白的表达

收集细胞,加入改良的RIPA细胞裂解液冰上裂解30 min后4 ℃12 000×g 离心20 min,采用BCA法定量上清液中的蛋白浓度。之后,加入等量2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀煮沸10 min使蛋白变性。取40 μg总蛋白样品,用4%~20% SDS-PAGE电泳90 min后电转印至硝酸纤维素膜上,5%牛奶封闭60 min后加入人抗兔E-Cadherin抗体(1∶1000)或人抗兔VEGF-A抗体(1∶1000),4 ℃孵育过夜,洗膜后使用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000)室温孵育2 h,ECL试剂发光,在暗室中用暗盒压片,洗片,扫描记录结果。采用ImageJ软件对各蛋白条带进行灰度分析,比较各给药组相关蛋白表达量的变化。

1.9 统计学方法

采用SPSS 16.0软件对各实验结果进行分析。数值以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用 Student's t 检验,两组以上比较采用one-way ANOVA分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 不同浓度GSK126对前列腺癌细胞增殖的影响

不同浓度GSK126处理后,PC-3和DU145细胞的增殖抑制率见表 2。GSK126浓度为1.9~30.0 μmol/L时PC-3细胞和DU145细胞增殖与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。当其浓度增加到60.0 μmol/L时,对PC-3细胞的抑制作用达70.9%,对DU145细胞的抑制作用达87.8%,与对照组(PC-3:0.8%±0.5%,DU145:0.4%±0.3%)比较差异均有统计学意义(均P<0.01)。提示GSK126在低浓度下对PC-3及DU145细胞增殖抑制作用不显著,浓度达60.0 μmol/L时对前列腺癌细胞增殖具有明显的抑制效果(与对照组比较,均P<0.01)。

表 2 不同浓度GSK126对前列腺癌细胞生长的抑制率 Table 2 Suppression ratios of GSK126 against PC-3 and DU145 cells
(x±s,%)
GSK126浓度(μmol/L)PC-3DU145
1.91.3±0.60.7±0.5
3.82.2±0.81.2±0.6
7.54.5±1.33.6±1.1
15.06.5±1.97.2±1.8
30.011.8±3.513.9±4.9
60.070.9±10.687.8±12.3
2.2 GSK126对前列腺癌细胞凋亡的影响

不同浓度GSK126处理后,PC-3和DU145细胞凋亡检测结果见图 1。各组凋亡率分别为:对照组(4.4±0.9)%和(1.4±0.2)%,小剂量组(4.8±0.5)%和(3.3±0.2)%,中剂量组(5.7±0.6)%和(4.1±0.4)%,大剂量组(8.4±1.0)%和(12.9±0.8)%。小剂量(5 μmol/L)和中剂量(20 μmol/L)时细胞凋亡增多不明显(与对照组比较,均P<0.05),在大剂量(50 μmol/L)GSK126处理后细胞凋亡增多有统计学意义(与对照组比较,P<0.05),提示低浓度GSK126促进前列腺癌细胞凋亡的作用不明显,50 μmol/L浓度GSK126才有促凋亡作用。

图 1 不同浓度GSK126对前列腺癌细胞凋亡率的影响 Fig. 1 Effect of GSK126 on cell apoptosis in PC-3 and DU145 cells
2.3 GSK126对前列腺癌细胞迁移和侵袭的影响

细胞划痕实验中平均划痕间距大小表明细胞迁移距离,划痕间距越大说明细胞迁移速度越慢。给药前PC-3细胞各组间划痕间距差异无统计学意义;划痕72 h后,对照组的划痕间距为(171.3±17.8)μm,GSK126小、中、大剂量组划痕间距分别为(247.2±24.4)、(347.2±19.2) μm、(410.5±18.1) μm,与对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05),且随药物浓度变化呈现一定的量效关系,表明GSK126在体外能够有效抑制PC-3细胞迁移(图 2)。在DU145细胞中也得到了类似的实验结果。DU145细胞GSK126小、中、大剂量组的划痕间距分别为(283.3±20.8)、(458.7±55.7)、(506.8±75.0) μm,与对照组(216.7±32.1)μm比较差异均有统计学意义(均P<0.05),见图 2。以上结果提示GSK126可抑制前列腺癌细胞的迁移。

标尺=100μm. 图 2 不同浓度GSK126对前列腺癌细胞迁移作用的影响 Fig. 2 Effect of GSK126 on scratch space in PC-3 and DU145 cells

Transwell实验结果显示,对照组PC-3细胞从微孔滤膜上层侵入到下层每视野下细胞数为322.0±17.9,而GSK126小、中、大剂量组的侵入细胞数分别为198.3±15.4、82.7±6.2、30.2±4.1,与对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.01);DU145细胞从微孔滤膜上层侵入到下层每视野下细胞数由对照组的339.3±18.0分别降为214.7±16.5、101.7±12.5、47.0±10.5,差异均有统计学意义(均P<0.01)。两种细胞中,GSK126各剂量组均能抑制细胞从微孔滤膜上层侵入到下层,且抑制程度随药物浓度的变化呈现剂量依赖性,在高浓度作用下抑制效果尤为显著(图 3),与划痕实验结果一致。以上结果提示,GSK126能够有效抑制前列腺癌细胞的侵袭。

标尺=100μm. 图 3 GSK126对前列腺癌细胞侵袭作用的影响 Fig. 3 Effect of GSK126 on cell invasion in PC-3 and DU145 cells
2.4 GSK126对前列腺癌上皮细胞间质转化相关基因mRNA表达量的影响

GSK126作用后前列腺癌细胞PC-3和DU145中Snail、Fibronectin及VEGF-A基因的mRNA表达无改变,但能上调E-cadherin的mRNA表达,同时下调N-cadherin、Vimentin的mRNA表达(图 4)。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin与上皮细胞间质转化密切相关,提示GSK126有可能通过抑制前列腺癌上皮细胞间质转化,从而抑制其迁移与侵袭。

与对照组比较,*P<0.05 ,**P<0.01. 图 4 GSK126对前列腺癌细胞相关基因mRNA表达量的影响 Fig. 4 Effect of GSK126 on mRNA expression in PC-3 and DU145 cells
2.5 GSK126对前列腺癌细胞中E-cadherin和VEGF-A蛋白表达的影响

为了进一步验证上述结果,分别检测E-caherin和VEGF-A蛋白表达。GSK126处理后PC-3细胞和DU145细胞中E-cadherin蛋白表达随着给药浓度的增加而上升,而两种细胞经不同浓度GSK126处理后VEGF-A蛋白表达无显著变化(图 5)。上述结果进一步印证了mRNA检测的结果,提示GSK126参与调节上皮细胞间质转化。

A:蛋白质印迹法检测E-cadherin、 VEGF-A结果;B:不同浓度GSK126处理后 E-cadherin、VEGF-A蛋白表达量比较.与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01. 图 5 GSK126对前列腺癌细胞中E-cadherin及VEGF-A蛋白表达的影响 Fig. 5 Effect of GSK126 on E-cadherin and VEGF-A protein expression in PC-3 and DU145 cells
3 讨 论

EZH2为多梳基因蛋白家族的主要成员之一,过表达的EZH2对前列腺癌的发生与发展有至关重要的作用。EZH2可以通过下调RKIP基因促进PC-3细胞增殖[6],也可以通过下调DAB2IP[10]和E-Cadherin[12]促进前列腺癌上皮细胞间质转化,从而促进其转移。另外EZH2的过表达可以抑制MSMB基因从而抑制前列腺癌细胞凋亡,抑制下调基质金属蛋白酶抑制因子(TIMP)-2、TIMP-3、神经生长导向因子2(SLIT2)从而促进前列腺癌细胞增殖及转移[13-14]

抑制EZH2表达或活化已被作为抗肿瘤药物研发的新靶标,GSK126是近年研发的一种新型EZH2选择性酶活性抑制剂,关于其抗肿瘤药效方面的探究目前处于初步阶段。已有文献报道,在非实体瘤细胞中GSK126可显著抑制细胞增殖,并诱导相关基因的转录活性[7]。在前期对胃癌细胞系MGC803和肺癌细胞系A549的研究中,我们发现GSK126能显著抑制肿瘤细胞迁移和浸润,并显著抑制新生血管形成,其作用与上调VEGF-A相关[11]

而在本研究中,我们分别以前列腺癌细胞系PC-3和DU145为观察对象,发现GSK126抑制上述两种细胞增殖和促进凋亡的作用并不明显,但抑制细胞迁移和侵袭的作用较强,其作用机制与促进上皮细胞间质转化密切相关,而与上调VEGF-A促进肿瘤新生血管形成无关,提示GSK126对前列腺癌亦具有治疗作用,但其作用机制与胃癌和肺癌并不相同。有关GSK126与其他前列腺癌转移抑制药物联用的抗肿瘤效果及相关机制正在进一步研究探讨中。

转移是肿瘤致死的主要原因,对于肿瘤转移的机制也有较多报道,其中上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)与肿瘤的侵袭和转移密切相关。当上皮细胞的极性丧失后,其迁移和运动能力显著增加[15]。EMT在前列腺癌的转移过程中发挥着重要作用[16]。已有文献报道,高表达的EZH2蛋白可下调上皮间质转化基因E-cadherin的表达量[8]。本研究发现,GSK126可有效上调E-cadherin基因mRNA和蛋白的表达量,下调N-cadherin、Vimentin基因mRNA表达量。E-cadherin、N-cadherin与Vimentin是肿瘤细胞发生上皮间质转化的重要靶基因,E-cadherin的下调配合N-cadherin、Vimentin的上调,可有效促进肿瘤细胞发生上皮间质转化,促使其迁移。在后续的研究我们将以此为基础对GSK126的作用机制做进一步的探究。

综上所述,GSK126可上调E-cadherin的表达,抑制前列腺癌细胞发生上皮间质转化,达到抑制其转移的作用。GSK126针对不同来源的实体瘤细胞的作用和机制略有不同,提示其可能可以作为一种新型的抗肿瘤药物在多种肿瘤疾病中发挥重要作用,为肿瘤的临床治疗提供一个新的研究方向。

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文章信息

林伟仁, 陈亚天, 曾玲晖, 应荣彪, 朱锋
LIN Weiren, CHEN Yatian, ZENG Linghui, YING Rongbiao, ZHU Feng
zeste基因增强子同源物2抑制剂GSK126对前列腺癌细胞的作用及机制
Effect of a novel EZH2 inhibitor GSK126 on prostate cancer cells
浙江大学学报(医学版), 2016, 45(4): 356-363
Journal of Zhejiang University(Medical Sciences), 2016, 45(4): 356-363.
http://dx.doi.org/10.3785/j.issn.1008-9292.2016.07.05

文章历史

收稿日期: 2016-02-18
接受日期: 2016-07-10
基金项目: 浙江省医药卫生科研项目(2015KYA148);浙江省自然科学基金(LY12H16005)
第一作者: 林伟仁(1971-), 男, 学士, 副主任医师, 主要从事肿瘤的诊治和研究; E-mail:linweiren1971@163.com; http://orcid.org/0000-0002-0224-5496
通讯作者: 朱锋(1978-), 女, 硕士, 讲师, 主要从事药理学研究; E-mail:zhuf@zucc.edu.cn; http://orcid.org/0000-0002-3220-6762

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