高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy，HAART)方案能有效抑制病毒，使HIV感染者血浆中病毒载量减少^[1]，降低艾滋病患者病死率，但并不能完全清除患者体内HIV，大部分患者体内长期存在少量病毒。这些病毒存在于储存库中，以整合至人体基因组的方式存在于某些细胞，主要包括未经刺激不表达病毒的CD4⁺T细胞和一些抗病毒药物渗透效果不佳的器官组织如脾脏、淋巴结、胃肠相关淋巴组织等^[1]。HIV在其中处于一种可逆的潜伏状态，可逃避宿主免疫系统监视和清除。由于CD4⁺T细胞半衰期为44个月，如果自然清除至少需要70年^[2]。现在主张“shock and kill”疗法，即激活储存库中的病毒来诱导整合DNA的表达，使其易被免疫细胞和抗病毒药物杀灭^[3-5]。为了评估该新疗法的有效性，首先应精确评估和测定HIV储存库。检测HIV储存库中整合病毒有如下难点：第一，整合有HIV前病毒DNA的CD4⁺T细胞很难与未感染病毒细胞鉴别；第二，只有百万分之一的静止CD4⁺T细胞携带有整合HIV前病毒基因，因此检测需要大量的血样本^[5]。针对上述难点，目前国内外研发了Alu-gag PCR、定量病毒产物分析(quantitative-viral outgrowth assay，Q-VOA)、tat/rev诱导的有限稀释法(tat/rev induced limiting dilution assay，TILDA)等测定病毒储存库的方法，本文就上述方法进行介绍和分析。

Alu-gag PCR通过定量测定整合DNA数值来评估储存库大小。Alu是人基因组中普遍存在基因；gag即HIV组抗原基因，是病毒颗粒结构性成分。整合是逆转录病毒感染过程的基础和必要步骤。当病毒处于潜伏状态时最稳定，整合DNA即前病毒不产生大量病毒，可逃避机体免疫系统监视和清除，成为抵抗HAART治疗方案的主要组成^[6]。Alu-gag PCR检测机制是，从HIV感染者中分离出总DNA，用与Alu、gag序列匹配的引物扩增gag和最近Alu之间的区域，接着用识别这段特异性扩增产物中长末端重复序列LTR的R-U5区域进行第二步PCR。该方法敏感性较强，对体外实验或者正在治疗的个体都适用。同时由于包含多克隆整合标准，与自然状态下感染的整合位点多样性相符，提高了检测的精确性^[7]。

Alu-gag PCR操作需要两步扩增反应。首先，预扩增整合后gag序列与最近距离的Alu序列之间区域。该法能检测出距离Alu序列(2～5)千对碱基的整合HIV。预扩增后的特异性产物在第二步中被扩增，而引物主要识别HIV LTR的R-U5区域^{[3, 6-7]}。同时，用只扩增gag结构基因(gag代表HIV未整合至宿主基因组中)的PCR作为对照，扩增Alu-gag(表示HIV DNA已整合至宿主基因组中) PCR为实验组，只有当Alu-gag数值比gag的数值高，才代表整合成功。那些未整合的DNA会慢慢被稀释至检测不到的程度，整合的DNA则稳定存在。另外，由于HIV整合过程可发生于人体基因组不同位置，实验中有一条代表整合位点的多样性的标准曲线，该曲线符合不同位置整合的检测要求^[7]。

Alu-gag PCR在未经治疗患者中检测整合病毒具有优势，因为这些患者未整合的DNA量极大，可能与总的病毒混淆。另外，该法可了解目前新型药物如组蛋白去乙酰化酶抑制剂是否降低病毒整合的发生率，进而间接测定病毒储存库。通过该方法也可发现早期启动HAART的患者比未启动HAART的患者病毒整合水平低。但如果在人体内整合DNA量非常少，或病毒存在变异的现象，或整合位点距离Alu序列很远，用Alu-gag PCR法就不能检测到整合的发生^{[6, 8]}。

Q-VOA技术在纯化的未表达病毒的CD4⁺T细胞中进行，对储存库中有复制功能病毒的检测具有较高的敏感性。其原理是用刺激剂刺激患者静止的高度纯化CD4⁺T细胞，促使病毒改变潜伏状态，在细胞培养的基础上感染健康供者的CD4⁺T细胞后被检测出来^[2-3]。

操作方法：首先通过负磁选择方法从外周血单核细胞中分离出所有CD4⁺T细胞，用流式荧光细胞分选术区分活化CD4⁺T细胞与非活化CD4⁺T细胞；然后通过免疫表型筛选出未表达病毒的CD4⁺T细胞，用有丝分裂原植物凝集素和受γ射线辐照过的同种异体外周血单核细胞刺激CD4⁺T细胞中潜伏病毒表达，逆转潜伏状态；再加入健康供者CD4⁺T细胞培养数日，使其被释放的病毒感染；最后在第14天用ELISA法测定健康供者CD4⁺T细胞产生的病毒产物p24抗原，即表达p24抗原的健康供者CD4⁺T细胞数，结果用每百万细胞感染单位(IUPM)表示^{[2, 9-10]}。

改良的Q-VOA选择表达高水平CD4抗原及CCR5和CXCR4共受体的MOLT-4/CCR5体外细胞株，代替健康供者CD4⁺T细胞，从而使病毒高效复制，最后分别在第7天和第14天用实时定量PCR测定体外细胞株表达的病毒产物^{[2-3, 9-10]}。改良Q-VOA弥补了上述传统实验技术的缺陷，如缩短实验时间，不需健康人提供CD4⁺T细胞和外周血单个核细胞，从而省时省力，更加便捷。这使得原本只适用于小规模研究的Q-VOA可应用于大规模的临床检测^[5]。

Laird等^[2]通过比较传统实验组与改良实验组检测结果，发现潜伏细胞数差异并无统计学意义。随细胞培养时间延长，两种方法测得的潜伏感染细胞数均呈指数上升。改良实验组在第7天与传统实验组在第14天的检测结果相似，提示改良实验组比传统实验组能更早检测到病毒产物，改良实验可以有效代替传统实验来检测HIV^[2]。

Q-VOA技术有如下优点：首先，能检测到单个未表达病毒的细胞；其次，该技术不会检测到大量的缺陷病毒，避免了假阳性结果，弥补了PCR的不足^[2]。但也存在以下缺点：首先，该技术可能低估了储存库大小，因为这是一个随机过程，每个完整前病毒子都只能被有限诱导，每孔培养基不一定都生成病毒产物；其次，检测需要较大的血样本量(150～200 mL)，这在临床很难实现；另外还需提供健康人外周血单核细胞；最后，Q-VOA检测成本较高，检测时间较长，一般需时1～2周。在目前，改良Q-VOA是快速可行的方法之一^{[2-3, 11]}。

TILDA即通过诱导产生tat/rev的多拼接RNA(msRNA)来检测整合HIV的CD4⁺T细胞频数的有限稀释法。该技术不依赖病毒复制，且由于产生病毒子的感染细胞可产生msRNA，通过超速离心和实时定量PCR法测定msRNA值即可有效代替潜伏病毒数^[12]。msRNA、非拼接RNA(usRNA)、不完全拼接RNA(isRNA)均属于细胞相关HIV生物学标志物。细胞相关HIV生物学标志物在监测和预测治疗有效性及病毒持续存在程度方面有较大的应用价值^[6]。转录初期，以msRNA为主，编码调节蛋白Tat、Rev。转录后期，以usRNA和isRNA为主，编码结构和辅助蛋白Gag、Pol、Env。随疾病进展，usRNA/msRNA比值增大。在未表达病毒的CD4⁺T细胞中，msRNA被滞留在细胞核中，阻止Tat和Rev调节蛋白的翻译，促进了HIV潜伏状态的发生。而当潜伏细胞受刺激激活后，msRNA才出现于潜伏细胞中^[13]。因此测定细胞相关msRNA可预测未治疗患者疾病进展、病毒复制以及在抗病毒治疗过程中储存库大小。由于该技术所需样本量少，检测时间短，适用于大规模临床检测^[12]。

具体方法:首先从外周血单个核细胞中用负磁选择法分离出所有的CD4⁺T细胞，这样浓缩的CD4⁺T细胞的纯度超过95%，在适宜培养环境中放置后分成两组。实验组用刺激剂如聚丙烯酸甲酯和离子霉素刺激相应的时间，使其能最大限度地产生tat/rev msRNA，同时保存细胞的生存能力。刺激过后冲洗细胞，使培养基中细胞浓度稀释到几种不同范围，取少量悬液分别转移至96孔板上，进行预扩增。在扩增的结尾，用上述产物作为tat/rev的模板链进行实时定量PCR，得到HIV msRNA。基线对照组则不用聚丙烯酸甲酯和离子霉素刺激，余步骤同实验组。比较在有无刺激剂的条件下，不同实验浓度中产生msRNA的CD4⁺T细胞的频数。通过用刺激诱导得到的值减去基线对照组频数值，即为含有可诱导的HIV的细胞频数^[12]。只有7%的CD4⁺细胞可自主产生msRNA，绝大多数CD4⁺T细胞必须在刺激作用下才能产生msRNA。TILDA法测得的CD4⁺T细胞数与总的HIV DNA及整合的DNA均呈正相关。这证明大多数病毒细胞整合有潜伏HIV，且不主动表达病毒颗粒^[10]。

TILDA是一种特异的、敏感的、可重复的方法。Procopio等^[12]通过用携带绿色荧光蛋白基因的HIV克隆株来感染CD4⁺T细胞，筛选GFP阳性和GFP阴性细胞后，用TILDA方法分别检测tat/rev msRNA。在GFP阳性细胞中，87.5%的HIV DNA呈阳性，其中79%可由TILDA检测出来。相反，在GFP阴性细胞中，绝大多数细胞HIV DNA呈阳性，但msRNA却是阴性的。这些结果提示msRNA可以特异性替代病毒蛋白质^[12]。

这种技术的优点在于只需要10 mL血样本量，不超过1百万数量的细胞，不需要抽提RNA，操作完成只要两天时间^[12]。TILDA可测出未表达病毒的CD4⁺T细胞频数大约为24 IUPM，是用Q-VOA测得频数的48倍。TILDA也存在缺陷，虽然释放病毒颗粒的细胞可以产生tat/rev msRNA，但在实验中产生tat/rev msRNA的细胞并不一定产生病毒颗粒。因此，TILDA会高估储存库的大小。尽管如此，它比其他现有的以PCR为基础的实验方法能更精确捕捉功能储存库，因为TILDA结果阳性源于有完整LTR端的整合HIV基因的转录^[12]。

Procopio等^[12]通过比较以上三种方法，发现用TILDA测量的潜伏感染细胞中位数是24×10⁶细胞，是Q-VOA的48倍，但Alu-gag PCR实验值却是它的6～27倍^{[10, 12]}。另外，PCR法测得平均300×10⁶个未表达病毒的CD4⁺T细胞整合有前病毒^[3]，大致整合比例为1:1000。TILDA是在总CD4⁺T细胞基数上实施，上述两种方法可能高估了储存库大小^{[12, 14-15]}；而Q-VOA主要在纯化静止CD4⁺T细胞基数中进行，约1×10⁶个未表达病毒的CD4⁺T细胞整合有前病毒^[3]，因此可能低估储存库大小^{[11, 15]}，使患者产生“已被治愈”的错觉，一旦撤除HARRT，可能导致患者体内病毒数量的反弹^{[3, 11]}。

针对最新的“shock and kill”治疗理念，Alu-gag PCR和Q-VOA均不能兼顾“shock”和“kill”。如以RNA培养为基础的方法可使病毒先受到刺激，以致源源不断地产生，然后用病毒产物分析法来量化并加用相关试剂杀灭病毒。结合RNA培养与Alu-gag PCR法可观测储存库大小的改变^[11]。

笔者认为，以上Alu-PCR、Q-VOA、TILDA各有其优势与不足。目前，改良Q-VOA仍是检测储存库大小的金标准。但也正由于其高敏感性，小部分无复制功能的病毒接受了有丝分裂原刺激后也能被检测到，导致假阳性结果。同时，潜伏感染的静止CD4细胞中有复制能力的病毒频数低，所需样本量相对较大，但这在任何形式的病毒产物分析中都不可避免。

目前抗HIV病毒方案能有效地抑制新近感染病毒复制，但并不能完全清除，依然能检测到低拷贝的病毒数^[16]。体内记忆CD4⁺T细胞和脾脏、淋巴结、胃肠相关淋巴组织都将作为稳定的HIV储存库存在^{[1, 17]}。HIV储存库存在的机制与病毒整合、染色质微环境改变、转录因子的下调、tat功能受损、细胞miRNA干预作用等有关^{[1, 18-20]}。在进行任何长期维持的治疗方案前必须要准确计算出HIV储存库大小，可采用上述几种常用的Alu-gag PCR、Q-VOA、TILDA方法。目前临床上治疗HIV感染建议“shock and kill”联合HAART方案，可用激活CD4⁺T细胞的以下方式：①使潜伏感染细胞暴露于IL-2、IL-6、TNF-α作用下，或者IL-2联用CD3单克隆抗体，使T淋巴细胞活化；②在转录水平上诱导HIV基因表达；③改变非编码miRNA作用。而在激活潜伏病毒后，又有以下免疫疗法可以进一步清除被释放的病毒：①治疗用疫苗；②广谱中和单克隆抗体；③免疫检验点阻断剂；④免疫调节药物^{[4, 18]}。尽管有些方法尚在临床试验阶段，相信随着科学进步，将会出现更多简便有效的方法，使更多HIV感染者从中受益。