结核病(tuberculosis)作为全球最致命的传染病之一长期威胁着人类的健康，在2000年至2013年期间，全球通过结核防控工作的有效实施，已经避免了约3700万人的死亡。而对结核病的治疗和防控的关键在于结核病的实验室快速诊断^{[1, 2, 3]}。结核分枝杆菌培养仍是目前诊断结核病的金标准。但由于结核分枝杆菌生长缓慢，需要较长的检测时间是以结核分枝杆菌培养为基础的诊断方法的不足之处。痰涂片镜检作为一种传统方法已使用多年，但因低灵敏度削弱了其在临床上的实用价值^{[4, 5]}。以核酸扩增为基础的分子生物学诊断技术应运而生，因其高效性和高灵敏度的特点正在临床上得到越来越广泛的应用。但由于分子扩增的高效性和实验中的交叉污染易导致结果的假阳性^{[6, 7]}，因此，区分分子生物学诊断结果的真假阳性显得尤为重要。

在结核分枝杆菌的非编码区中存在一些DNA片段，他们以40～100 bp的单元为串联重复序列。不同的结核分枝杆菌可以具有不同的重复数。这些随机重复序列被称为结核分枝杆菌散在重复单元—可变数目串联重复序列(mycobacterial interspersed repetitive units-variable number of tandem repeats，MIRU-VNTR)^{[8, 9]}。长期以来MIRU-VNTR作为流行病分析的一种手段，尤其MIRU-VNTR的24位点分型和15位点分型应用最为广泛。目前大多采用的方法是先将结核分枝杆菌分离培养，再用于结核分枝杆菌的基因分型分析^{[10, 11, 12]}，这样耗时多，不利于临床的及时诊断。本研究直接对痰液样本进行MIRU-VNTR分析，以缩短检测时间和提高检测准确度。

选择130例2015年1月至2015年5月就诊于上海市肺科医院的肺结核患者为结核组，其中男性62例，女性68例，年龄15～72岁，平均年龄(44±4)岁，诊断标准参照文献^[13]；分别收集结核组患者痰液标本130例。选择200例2015年1月至2015年5月就诊于上海市肺科医院的其他肺部疾病患者为非结核组，其中男性101例，女性99例，年龄14～81岁，平均年龄(48±6)岁；分别收集非结核组患者痰液标本200例。所有患者皆为人类免疫缺陷病毒阴性，所有患者皆签署知情同意书。

患者清晨漱口后，咳出深部痰液于一次性痰杯中并加盖送检，应尽量避免唾液的混入，以免影响检测结果。采用N-乙酰-N-半胱氨酸-氢氧化钠法对痰液进行前处理，沉淀后用生理盐水重悬后作为标本，用于MIRU-VNTR分析、荧光定量聚合酶链反应(fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，FQ-PCR)、罗氏培养以及备用。备用标本用于MIRU-VNTR分析与FQ-PCR不一致结果的基因测序。

自制罗氏培养基，制备方法及检测规程参照文献^[14]。

H37RV是结核分枝杆菌标准菌株。本研究以超声法处理痰液标本，获得标本的基因组DNA。以H37RV菌株为阳性对照，以无菌水为阴性对照，参照文献处理痰液标本^[6]，获得的基因组DNA用于FQ-PCR检测。样本采用结核分枝杆菌FQ-PCR体外试剂盒(德国凯杰生物工程有限公司)在LightCycler480(德国罗氏生物技术有限公司)上进行测定(参照试剂盒说明书)。

以文献报道和前期预实验结果为基础，选取分辨率较高、变异度较大的MIRU-VNTR作为候选位点^{[11, 15]}；同时为了简化实验操作，筛选并确定了扩增条件一致的八个MIRU-VNTR位点作为检测位点。MIRU-VNTR位点及引物序列参照文献^[16]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，见表1。

以超声法处理痰液标本，获得标本的基因组DNA。以H37RV菌株为阳性对照，以无菌水为阴性对照。取得含DNA上清液后首先进行各个编码位点的PCR扩增，扩增条件为：预变性95 ℃ 10 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重复30个循环；终末72 ℃延伸7 min。扩增产物通过1.0%的琼脂糖凝胶150 V电泳1.0～1.5 h，通过在紫外灯下观察是否有特异性条带判定其是否为结核分枝杆菌。在MIRU-VNTR分析中，只要样本具有特异性的MIRU-VNTR位点则为结核分枝杆菌阳性。每个位点的重复单元数计算公式为：重复单元数=(MIRU-VNTR产物长度-侧翼序列长度)/一个重复序列的长度。

采用Gel-Pro analyzer 3.1软件对琼脂糖凝胶电泳结果进行数字化处理，指纹图谱数字化后，用BioNumerics 3.0数据库软件进行聚类分析。采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。计算MIRU-VNTR和FQ-PCR分别以罗氏培养和临床诊断为判断标准时的灵敏度、特异度和准确度[准确度=(真阳性样本数＋真阴性样本数)/总样本数]，并计算不同MIRU-VNTR位点对于诊断结果的分辨力。用χ²检验比较MIRU-VNTR与FQ-PCR的结核分枝杆菌检测结果，P＜0.05为差异具有统计学意义。

以罗氏培养法为判断标准时，MIRU-VNTR分析的灵敏度为93.1%(108/116)，特异度为97.7%(209/214)；FQ-PCR检测的灵敏度为94.0%(109/116)，特异度为96.7%(207/214)，两者准确度差异无统计学意义(96.1%与95.8% χ²=0.352，P=0.569)。详见表2。

以临床诊断为判断标准时，MIRU-VNTR分析的灵敏度为86.9%(113/130)，特异度为100%(200/200);FQ-PCR检测的灵敏度为87.7%(114/130)，特异度为99.0%(198/200)，两者准确度(94.8%与94.5%)差异无统计学意义(χ²=0.030，P=0.862)。详见表3。

MIRU-VNTR分析与FQ-PCR检测结果不符的样本共有11例，其中结核组9例，非结核组2例，结果见表4。

在本研究中，不同的位点对于结核分枝杆菌的独特性分辨能力各不相同。如表5所示，一些位点的重复数分布较为分散，如QUB18，在0～12个重复皆有分布，且出现最多的八个重复的概率也只为0.3370，能较好地区分不同结核分枝杆菌之间的重复片段差异，对结核的分辨能力表现较好；一些位点的重复数分布较为集中，如MIRU10，其只在两个重复至六个重复分布，且出现重复数为3的样本占到了总样本的76.1%，较难区分不同结核分枝杆菌之间的重复片段差异，分辨能力较差。MIRU-VNTR产物重复数判定如图1所示。

M： DNA marker；1～11: QUB18位点0～10个重复PCR产物位置． 图1 QUB18位点重复读取示意图 Fig.1 Schematic diagram of the repeats of QUB18 loci

图选项

本研究选取八个MIRU-VNTR位点对113例MIRU-VNTR阳性患者的痰液标本DNA进行指纹检测。根据被检测标本扩增后的电泳片段长度，计算其重复次数，再利用BioNumerics软件进行聚类分析，聚类方式采用平均连锁聚类法，将所检标本分为七个类型。其中Ⅱ型所占比例最大，为75.2%(85/113)，Ⅰ型占5.3%(6/113)，Ⅲ型占3.5%(4/113)，Ⅳ型占3.5%(4/113)，Ⅴ型占5.3%(6/113)，Ⅵ型占5.3%(6/113)，Ⅶ型占1.8%(2/113)。

结核患者的早期快速诊断一直是结核病防控和治疗的关键。传统的实验室结核病检测方法都有各自的缺陷，随着近年来核酸扩增技术的发展，分子生物学检测正在临床上得到越来越广泛的应用^[17]。在本研究中，为了兼顾核酸扩增技术的高效性和检测结果的准确性，将MIRU-VNTR技术引入到结核分枝杆菌的检测中。本研究选取了八个扩增条件一致、变异频率较高的编码位点MTUB21、MTUB04、QUB18、QUB26、QUB11b、MIRU31、MIRU10和MIRU26作为检测靶标。在MIRU-VNTR分析检测为阳性的结果中，经聚类分型，可分为七种基因型，其中Ⅱ型为华东地区优势流行菌群。通过对指纹图谱的分析，在MIRU-VNTR阳性样本中98.2%(111/113)的样本分子编码互不相同，只有两份阳性样本的分子编码一致(皆为5-4-6-8-5-5-3-8)。加强对结核分枝杆菌各种菌型的检测和研究，丰富了MIRU-VNTR指纹图谱的数据库，有利于华东地区结核疫情的防控。

以罗氏培养结果为判断标准时，MIRU-VNTR分析比FQ-PCR检测灵敏度高；以临床诊断为判断标准时，MIRU-VNTR分析比FQ-PCR检测特异度高；MIRU-VNTR分析与FQ-PCR结果不符的样本共有11份，其中两份MIRU-VNTR分析为阴性，但FQ-PCR检测为阳性，经罗氏培养检测为阴性，测序结果显示不是结核分枝杆菌，提示FQ-PCR检测所得为假阳性结果。FQ-PCR检测的假阳性可能是实验室交叉污染造成，而得益于独特性的数字化结果与批内比对，MIRU-VNTR分析对于这些阳性结果有着良好的质量保证，从而使检验结果对临床诊断和治疗更有指导价值。上海市肺科医院是华东地区最大的结核病诊疗医院，日常工作中同批次最多会出现10～15例结核病标本。假如将同一批次最多默认为20份标本，重复数完全一致的可能性也相当小，足以满足MIRU-VNTR分析自身质控的需要。标本相对较少的其他医院，更适合应用MIRU-VNTR分析。当同批次MIRU-VNTR分析有编码完全一致的标本时，还可通过重复实验及其他诊断实验来保证结果的准确性。在结核病的临床诊断工作中，假阳性结果的出现并不少见，而每一个假阳性结果都可能会损害患者，通过MIRU-VNTR分析对检验结果进行的批内比对，可有效地识别出假阳性结果，减少结核分枝杆菌误诊误治。传统MIRU-VNTR分析都是采用培养后的菌株用于结核分枝杆菌的分子分型和结核病的流行病学研究，而结核分枝杆菌培养耗费时间较长，导致疫情的监控滞后，不能及时地反映结核病的分布情况；本方法MIRU-VNTR分析因直接采用临床患者的痰液菌株进行分型检测，可对结核病的疫情做出更快速有效的反应，更好地对结核病疫情进行防控。

研发新型结核分枝杆菌检测技术目的在于提高检测结核分枝杆菌的敏感度及特异度，并更好地服务于临床，控制结核病的传播。MIRU-VNTR分析不仅有着传统核酸扩增实验的简便、快速、敏感的优点，还有区分真假阳性结果的能力，此外MIRU-VNTR位点本身就可应用于结核分枝杆菌的菌株分型和溯源追踪^[18]，如能建立检测结果的数据库，将不同医院的临床检验结果与流行病学监测结果及时有效地结合起来分析结核病流行的现状和趋势，对于结核病的早期诊断和防控将具有重要的理论和实践价值。