2. 南昌大学第一附属医院心内科, 江西 南昌 330006
2. Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China
缝隙连接是细胞间一种特殊的膜通道结构,几乎存在于哺乳动物所有的组织和细胞中,相邻的细胞可以通过缝隙连接进行信息交流、能量和物质的交换。缝隙连接蛋白(connexin,Cx) 是缝隙连接得以表达的主要结构成分之一,不同类型的Cx构成的缝隙连接功能各异。缝隙连接通道的功能主要受Cx羧基末端的磷酸化和去磷酸化的调节,Cx磷酸化时,缝隙连接功能下降[1]。研究发现蛋白激酶C、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)及 Src 家族中酪氨酸激酶可通过调节Cx羧基末端的磷酸化和去磷酸化调控缝隙连接功能[2],钙离子浓度和pH值也可影响缝隙连接通道的开启和关闭。当细胞内钙离子浓度下降、细胞内pH值降低时,缝隙连接功能减弱甚至关闭。缝隙连接既可以通过改变Cx的比例来调节其功能,也可选择性通过不同的第二信使如环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷、钙离子或三磷酸肌醇而影响其不同的生物学功能[3]。
糖尿病足是指糖尿病患者由于合并神经、血管病变而导致下肢感染、溃疡形成和/或深部组织的破坏。最新研究发现缝隙连接在周围神经损伤修复、维持血管稳定性及伤口愈合方面起到重要作用。周围神经再生所需要的神经因子和促生长因子的分泌需要通过细胞间的缝隙连接来完成;细胞间缝隙连接的存在使血管成为统一的整体,在维持血管收缩功能方面起到重要作用。同时内皮细胞上缝隙连接的表达异常会促进动脉硬化的形成,加重缺血;肢体形成溃疡后,神经再生、血管再生及功能异常使溃疡难以愈合,同时缝隙连接在炎症因子的分泌及信号的传递过程中起重要作用。因此探讨缝隙连接与糖尿病足的关系及机制,有望为糖尿病足的治疗提供新思路。
1 缝隙连接与周围神经病变周围神经病变是糖尿病足发生的常见原因。施万细胞与轴突之间存在大量的缝隙连接,使得物质交换和信息交换便捷、有效地进行。正常情况下周围神经损伤后,施万细胞大量增殖,通过缝隙连接分泌神经因子和促生长因子,为神经再生提供物质基础[4]。Cx32存在于成髓鞘胞体与其包绕在轴突周围胞浆间[5]。高糖环境下离体培养施万细胞,发现其代谢活性及增殖能力下降,表明高糖具有抑制神经再生作用[6, 7]。研究发现糖尿病周围神经损伤后,施万细胞上的Cx32表达下降[8, 9],致使受伤部位的信号不能传递至临近细胞。其主要机制是激活了MAPK系统,导致缝隙蛋白磷酸化[10]。缝隙连接还可以调控细胞外钾离子的重新分布、神经递质的代谢以及介导ATP受体信号传导等,可见缝隙连接对细胞外环境的调控具有重要作用。细胞外环境的改变导致的后果之一是神经元兴奋性的改变以及伤害性感受。
2 缝隙连接与血管病变正常血管中完整的内皮细胞是维持其生理功能所必需的,而缝隙连接在维持内皮连续性及完整性中发挥重要作用[11]。内皮细胞和平滑肌细胞是血管壁上的两种主要细胞,内皮细胞间、平滑肌细胞间、内皮细胞与平滑肌细胞间存在着大量的缝隙连接使血管成为统一的整体。在血管内皮细胞、平滑肌细胞和单核细胞上主要表达Cx37、Cx40及 Cx43三种Cx[12],内皮细胞上还有Cx32的表达。
在末梢血管,钙离子通过非选择性的离子通道或细胞内储存的钙离子释放引起内皮细胞内的钙离子浓度增加启动内膜源性的超极化因子引起平滑肌舒张。胞内钙离子浓度的增加引起内皮细胞超极化,该电信号直接通过缝隙连接引起平滑肌细胞的超极化,促进平滑肌细胞舒张。糖尿病时内皮细胞功能障碍和胰岛素抵抗均可抑制内膜源性的超极化因子的合成和释放[13],同时缝隙连接下降使信号传递下降,血管处于收缩状态,加重缺血。
高血糖使内皮细胞损伤引起Cx32功能异常,Cx32可以促进内皮细胞迁移而促进血管生成,还可以调节炎症因子的表达抵抗血管炎症发生[11]。内皮细胞受损后还可导致生长因子、细胞因子、血管活性物质分泌失调,这种分泌功能失调与平滑肌细胞增殖和迁移有密切关系。Liao等[14]发现特异性敲除平滑肌细胞上的Cx43基因会促进损伤后血管内膜形成。Matsushita等[15]对处于增殖和迁移的平滑肌细胞进行研究,发现其中Cx43表达上调,提示Cx43与平滑肌迁移及增殖有关,同时平滑肌增殖及迁移会导致斑块增大[16]。这主要由于MAPK促进Cx43磷酸化,然后后者与细胞周期素E结合,从而促进平滑肌增殖迁移[17]。Kuroki等[18]在高糖条件下培养平滑肌细胞,用荧光染料转移技术发现缝隙连接减少与蛋白激酶C促进Cx43过度磷酸化有关,证实高糖通过蛋白激酶C途径导致平滑肌细胞缝隙连接减少。
有研究发现内皮细胞上的Cx43还参与动脉粥样硬化形成[19, 20],Cx37与Cx40具有抗动脉粥样硬化的作用,主要表现为调节一氧化氮合酶的功能和表达[21]。Cx43表达下调50%可减少LDL受体缺陷小鼠粥样斑块处巨噬细胞和T细胞数,从而抑制斑块形成[22, 23]。选择性抑制内皮细胞上Cx43可抑制白细胞的黏附。特异性敲除Cx43基因的血管内皮细胞,会呈现黏附分子的低表达情况,从而减少单核细胞与内皮细胞之间的黏附和迁移。其机制可能是高血糖导致血管细胞内二酰甘油大量合成使蛋白激酶C激活,激活的蛋白激酶C通过使缝隙连接蛋白磷酸化、抑制内皮细胞一氧化氮合酶mRNA表达等多种途径发挥其致动脉粥样硬化作用[24, 25],同时一氧化氮的扩散在一定程度上依赖缝隙连接[26]。糖尿病患者酮体升高,而酮体通过激活细胞外信号调节激酶和p38 MAPK导致动脉内皮细胞上的Cx43磷酸化加强[27]。有研究发现,单核/巨噬细胞源性的Cx43也参与调节单核细胞和内皮细胞的黏附,但其在半通道和蛋白水平发挥不同效应,Cx43构成的半通道可通过刺激ATP释放并转变为腺苷而抑制黏附,而Cx43蛋白本身则促进单核细胞黏附[28]。
3 缝隙连接与伤口愈合Cx除了在内皮细胞、平滑肌细胞及单核细胞上表达外,在皮肤的角质层细胞及成纤维母细胞上也有表达,其在伤口愈合过程中发挥重要作用。如Cx43在皮肤上广泛表达。正常皮肤损伤情况下,Cx43表达减少,诱导伤口愈合;而在糖尿病患者足部溃疡时,在损伤前24 h内,成纤维细胞上的Cx43表达增加,直到48 h皮肤再生时,Cx43表达才减少,伤口愈合延迟[29]。研究发现破溃伤口局部应用Cx43抑制剂会加速伤口愈合、减小破溃面积[30]。对敲除Cx43基因的小鼠研究发现,Cx43活性的降低是伤口愈合的必要条件[31]。Wang等[32]对糖尿病大鼠研究发现,破溃伤口边缘的皮肤成纤维细胞上的Cx43表达增加,而直到Cx43表达减少后,细胞才开始出现迁移;应用Cx43抑制剂后,可以抵抗糖尿病引起的Cx43表达增加,同时加快伤口愈合。Cx43表达增加还会导致神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)增多,两者相互影响,延缓成纤维母细胞的迁移聚集[33, 34]。Mendoza等[35]对10例平均年龄在59岁的糖尿病足患者作破溃皮肤活组织研究发现,患者成纤维细胞上的Cx43表达较正常人明显增加。体外高糖培养成纤维细胞时,也发现其Cx43表达增加。糖尿病足患者伤口不易愈合,与高糖诱导成纤维细胞上的Cx43表达升高而妨碍成纤维细胞的增殖和迁移有关;同时高血糖本身通过形成晚期糖基化终末产物诱导炎性因子(TNF-α、IL-1)的产生并干扰胶原合成,从而对伤口愈合产生破坏性影响[36]。
4 缝隙连接与感染感染不是糖尿病足发生的主要原因,但是其加重的重要因素。糖尿病患者机体免疫力下降,同时合并肢体缺血及皮肤裂纹,极易感染。在炎症发生过程中血管内皮细胞上的Cx表达发生改变[37],影响炎症因子及细胞黏附因子的表达[38]。在炎症早期缝隙连接具有一定的保护作用;即当个别内皮细胞受损或死亡时,细胞间的缝隙连接通道会及时关闭,避免有害物质经通道传递至邻近细胞内,防止炎症进一步扩散[39]。缝隙连接的这种变化使得血管内皮连续性及完整性发生改变。同时缝隙连接的改变还会导致机体自身免疫力下降[40],主要影响cGAMP引起的免疫应答反应,第二信使cGAMP的传递主要通过细胞间的缝隙连接实现的。体外用细菌内毒素刺激血管内皮细胞,内皮细胞上的Cx43 mRNA表达下降[41]。随着感染进一步加重,患者出现脓毒血症时,机体处于应激状态,同时内环境紊乱,如内皮细胞膜电位下降、pH值变小或细胞液钙离子浓度升高均可引起Cx的构象改变,导致通道管径变小甚至关闭。
5 结 语糖尿病足是一种涉及多种致病因素和作用机制的复杂病症,它的病因病机尚未完全清楚,除了目前公认的下肢血管病变和神经病变两大病理生理机制外,还有许多我们没有认识的发病机制。同时糖尿病足患者医疗费用巨大,患者有很高的截肢率,这提示我们需要加强对糖尿病足的基础与临床研究,规范足病诊治行为,进而减少足病的发生及降低患者截肢率和病死率。而Cx所介导的细胞缝隙连接通讯与糖尿病足发病机制有着密切的关系。今后研究中可将Cx作为新的设计靶点,干预连接蛋白及其功能单位,继而发挥其有利的作用,抑制其有害的功能,为糖尿病足的治疗思路提供新方向。
[1] | PALATINUS J A, RHETT J M, GOURDIE R G. Enhanced PKCepsilon mediated phosphorylation of connexin43 at serine 368 by a carboxyl-terminal mimetic peptide is dependent on injury[J]. Channels (Austin), 2011,5(3):236-240. |
[2] | SOLAN J L, LAMPE P D. Specific Cx43 phosphorylation events regulate gap junction turnover in vivo[J]. FEBS Lett, 2014,588(8):1423-1429. |
[3] | DE MELLO W C. Chemical communication between cardiac cells is disrupted by high glucose: implications for the diabetic heart[J]. Exp Cell Res, 2015,331(1):232-238. |
[4] | GLENN T D, TALBOT W S. Signals regulating myelination in peripheral nerves and the Schwann cell response to injury[J]. Curr Opin Neurobiol, 2013,23(6):1041-1048. |
[5] | MEIER C, DEMMIETZEL R, DAVIDSON K G, et al. Connexin32-containing gap junctions in Schwann cells at the internodal zone of partial myelin compaction and in Schmidt-Lanterman incisures[J]. J Neurosci, 2004,24(13):3186-3198. |
[6] | JOLIVALT C G, VU Y, MIZISIN L M, et al. Impaired prosaposin secretion during nerve regeneration in diabetic rats and protection of nerve regeneration by a prosaposin-derived peptide[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2008,67(7):702-710. |
[7] | CHEN D K, FRIZZI K E, GUEMSEY L S, et al. Repeated monitoring of corneal nerves by confocal microscopy as an index of peripheral neuropathy in type-1 diabetic rodents and the effects of topical insulin[J]. J Peripher Nerv Syst, 2013,18(4):306-315. |
[8] | POLADIA D P, SCHANBACHER B, WALLACE L J, et al. Innervation and connexin isoform expression during diabetes-related bladder dysfunction: early structural vs. neuronal remodelling[J]. Acta Diabetol, 2005,42(3):147-152. |
[9] | CHANDROSS K J, KESSLER J A, COHEN R I, et al. Altered connexin expression after peripheral nerve injury[J]. Mol Cell Neurosci, 1996, 7(6): 501-518. |
[10] | YANG D P, KIM J, SYED N, et al. p38 MAPK activation promotes denervated Schwann cell phenotype and functions as a negative regulator of Schwann cell differentiation and myelination[J]. J Neurosci, 2012,32(21):7158-7168. |
[11] | OKAMOTO T, AKIYAMA M, TAKEDA M, et al. Connexin32 protects against vascular inflammation by modulating inflammatory cytokine expression by endothelial cells[J]. Exp Cell Res, 2011,317(3):348-355. |
[12] | BRISSET A C, ISAKSON B E, KWA B R. Connexins in vascular physiology and pathology[J]. Antioxid Redox Signal, 2009,11(2):267-282. |
[13] | AWUMEY E M, BRIDGES L E, WILLIAMS C L, et al. Nitric-oxide synthase knockout modulates Ca2+-sensing receptor expression and signaling in mouse mesenteric arteries[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2013,346(1):38-47. |
[14] | LIAO Y, REGAN C P, MANABE I, et al. Smooth muscle-targeted knockout of connexin43 enhances neointimal formation in response to vascular injury[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2007,27(5):1037-1042. |
[15] | MATSUSHITA T, RAMA A, CHAROLIDI N, et al. Relationship of connexin43 expression to phenotypic modulation in cultured human aortic smooth muscle cells[J]. Eur J Cell Biol, 2007,86(10):617-628. |
[16] | MANOLAKOU P, ANGELOPOULOU R, BAKOYIANNIS C, et al. Cellular proliferation in complicated versus uncomplicated atherosclerotic lesions: total cell population, foam cells and newly formed microvessels[J]. Tissue Cell, 2009,41(6):408-413. |
[17] | JOHNSTONE S R, KRONCKE B M, STRAUB A C, et al. MAPK phosphorylation of connexin 43 promotes binding of cyclin E and smooth muscle cell proliferation[J]. Circ Res, 2012,111(2):201-211. |
[18] | KUROKI T, INOGUCHI T, UMEDA F, et al. High glucose induces alteration of gap junction permeability and phosphorylation of connexin-43 in cultured aortic smooth muscle cells[J]. Diabetes, 1998,47(6):931-936. |
[19] | PFENNIGER A, CHANSON M, KWA B R. Connexins in atherosclerosis[J]. BBA-Biomembranes, 2013,1828(1):157-166. |
[20] | MOREL S, BUMIER L, KWAK B R. Connexins participate in the initiation and progression of atherosclerosis[J]. Semin Immunopathol,2009,31(1): 49-61. |
[21] | LOOFT-WILSON R C, BILLAUD M, JOHNSTONE S R, et al. Interaction between nitric oxide signaling and gap junctions: effects on vascular function[J]. Biochim Biophys Acta,2012,1818(8): 1895-1902. |
[22] | MOREL S, CHANSON M, NGUYEN T D, et al. Titration of the gap junction protein connexin43 reduces atherogenesis[J]. Thromb Haemost, 2014,112(2):390-401. |
[23] | WONG C W, BURGER F, PELLI G, et al. Dual benefit of reduced Cx43 on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice[J]. Cell Commun Adhes, 2003,10(4-6):395-400. |
[24] | MUNZEL T, SINNING C, POST F, et al. Pathophysiology, diagnosis and prognostic implications of endothelial dysfunction[J]. Ann Med, 2008,40(3):180-196. |
[25] | YANG Z, MING X F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis[J]. Clin Med Res, 2006,4(1):53-65. |
[26] | FIGUEROA X F, LILLO M A, GAETE P S, et al. Diffusion of nitric oxide across cell membranes of the vascular wall requires specific connexin-based channels[J]. Neuropharmacology, 2013,75:471-478. |
[27] | HO C F, CHAN K W, YEH H I, et al. Ketone bodies upregulate endothelial connexin 43 (Cx43) gap junctions[J]. Vet J, 2013,198(3):696-701. |
[28] | YUAN D, WANG Q, WU D, et al. Monocyte-endothelial adhesion is modulated by Cx43-stimulated ATP release from monocytes[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012,420(3):536-541. |
[29] | COUTINHO P, QIU C, FRANK S, et al. Limiting burn extension by transient inhibition of connexin43 expression at the site of injury[J]. Br J Plast Surg, 2005,58(5):658-667. |
[30] | QIU C, COUTINHO P, FRANK S, et al. Targeting connexin43 expression accelerates the rate of wound repair[J]. Curr Biol, 2003,13(19):1697-1703. |
[31] | KRETZ M, MAASS K, WILLECKE K. Expression and function of connexins in the epidermis, analyzed with transgenic mouse mutants[J]. Eur J Cell Biol, 2004,83(11-12):647-654. |
[32] | WANG C M, LINCOLN J, COOK J E, et al. Abnormal Connexin expression underlies delayed wound healing in diabetic skin[J]. Diabetes, 2007,56(11):2809-2817. |
[33] | MENDOZA-NARANJO A, COMMIE P, SERRANO A E, et al. Targeting Cx43 and N-cadherin, which are abnormally upregulated in venous leg ulcers, influences migration, adhesion and activation of Rho GTPases[J]. PLoS One, 2012,7(5):e37374. |
[34] | WEI C J, FRANCIS R, XU X, et al. Connexin43 associated with an N-cadherin-containing multiprotein complex is required for gap junction formation in NIH3T3 cells[J]. J Biol Chem, 2005,280(20):19925-19936. |
[35] | MENDOZA-NARANJO A, COMMIE P, SERRANO A E, et al. Overexpression of the gap junction protein Cx43 as found in diabetic foot ulcers can retard fibroblast migration[J]. Cell Biol Int, 2012,36(7):661-667. |
[36] | LOUGHLIN D T, ARTLETT C M. 3-Deoxyglucosone-collagen alters human dermal fibroblast migration and adhesion: implications for impaired wound healing in patients with diabetes[J]. Wound Repair Regen, 2009,17(5):739-749. |
[37] | SCHECKENBACH K E, CRESPIN S, KWAK B R, et al. Connexin channel-dependent signaling pathways in inflammation[J]. J Vasc Res, 2011,48(2):91-103. |
[38] | OKAMOTO T, AKIYAMA M, TAKEDA M, et al. Connexin32 protects against vascular inflammation by modulating inflammatory cytokine expression by endothelial cells[J]. Exp Cell Res, 2011,317(3):348-355. |
[39] | CASTELLANO P, EUGENIN E A. Regulation of gap junction channels by infectious agents and inflammation in the CNS[J]. Front Cell Neurosci, 2014,8:122. |
[40] | ABLASSER A, SCHMID-BURGK J L, HEMMERLING I, et al. Cell intrinsic immunity spreads to bystander cells via the intercellular transfer of cGAMP[J]. Nature, 2013,503(7477):530-534. |
[41] | 明 佳,袁侨英,周 艳,等. 体外LPS诱导血管内皮细胞通透性改变及其与连接蛋白43的关系[J]. 第三军医大学学报, 2010(24):2582-2585. MING Jia, YUAN Qiao-ying, ZHOU Yan, et al. Effect of LPS on vascular permeability of vascular endothelial cells and role of connexin43 in the process[J]. Journal of Third Military Medical University, 2010(24):2582-2585. (in Chinese) |