肿瘤是经济发达国家的主要死亡原因，是发展中国家的第二位死亡原因^{[1, 2]}。在经济发展中国家，由于人口老龄化和人口增长，肿瘤相关生活方式增多如吸烟、运动减少和高糖、高脂、高蛋白饮食等，肿瘤发病仍在持续增加^[1]。2012年全世界范围内，肿瘤新发病例约1410万，肿瘤相关死亡病例约820万^[3]。目前肿瘤治疗主要依赖于手术切除，但手术并发症较多、术后肿瘤复发率高，患者预后较差。因而，寻找新型的肿瘤防治手段迫在眉睫。

肿瘤免疫治疗目的是激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞^[4]。这种治疗方法可以产生持续的临床反应，一部分患者甚至拥有长期疗效。这种治疗方法的关键在于激发和活化针对肿瘤细胞的机体免疫反应。因此，既可以微创消融肿瘤，又能够激发针对肿瘤细胞特异性的免疫反应的新型肿瘤治疗手段则具备更强的临床应用潜力。

脉冲电场(pulsed electric field)是最近20年来发展起来的横跨生物电磁学、高电压和微电子等领域的新技术，已经被广泛应用于电化学治疗^[5]、基因治疗^[6]、细胞融合、微生物消毒和药物投送^[7]等领域。微秒脉冲电场也称为不可逆电穿孔(irreversible electroporation)，已经应用于临床试验，可以微创消融不同类型的肿瘤，包括肝脏肿瘤^{[8, 9, 10]}、胰腺肿瘤^{[11, 12]}、肾脏肿瘤^{[13, 14]}和肺肿瘤^{[13, 15]}等，均获得安全有效的临床疗效。纳秒脉冲电场作为脉冲电场技术的最新发展，比其它致肿瘤坏死的物理手段更具优势，可以诱导肿瘤细胞凋亡^{[16, 17]}、抗血管生成^[17]和减少肿瘤抵抗和复发等。恶性黑色素瘤^{[18, 19, 20]}、皮肤基底细胞癌^{[21, 22]}、皮肤鳞状细胞癌^[23]、肝细胞癌^{[24, 25]}、结肠癌^{[26, 27, 28]}、卵巢癌^[29]、口腔癌^[30]、胰腺癌^[31]等细胞实验和动物模型研究已证实其肿瘤消融的生物学效应和相关机制。然而，脉冲电场原本不属于肿瘤的免疫治疗手段，但其在消融肿瘤时激发的针对肿瘤特异性的免疫反应可以改变肿瘤微环境，靶向抑制肿瘤的复发和转移。这一脉冲电场消融肿瘤的特色优势正逐渐成为肿瘤免疫治疗和肿瘤消融的新兴研究焦点。

现有的研究证据表明，微秒脉冲电场可以破坏细胞膜的稳定性，以一种非产热的方式诱导肿瘤细胞死亡而实现局部肿瘤消融，但许多自体固有的肿瘤抗原在脉冲电场消融以后仍然保留。肿瘤细胞本身具有的免疫原性在靶向抗肿瘤治疗过程中可能会产生危险相关分子，进而触发抗肿瘤的适应性免疫反应^[32]。因此，微秒脉冲电场肿瘤消融中死亡的肿瘤细胞可能成为治疗性的疫苗，并激发机体针对剩余肿瘤细胞的细胞毒性免疫反应。

低强度微秒脉冲电场(20～100 V/cm)处理的细胞可以诱导细胞对大分子的有效摄取，但这种大分子摄取路径不是通过电穿孔，而是通过细胞内吞样机制。在化疗药物存在的情况下，低强度的微秒脉冲电场可以诱导抗肿瘤免疫，进而导致肿瘤生长明显延迟。Entin等^[32]采用高转移的黑色素瘤B16-F10.9细胞皮下注射C57BL/6 雄性小鼠的方法诱导黑色素瘤模型。当肿瘤直径达到5 mm时，使用化疗药物局部注射，然后采用微秒脉冲电场处理肿瘤3～4 min。结果发现，低强度微秒脉冲电场联合化疗药物在原发肿瘤和转移肿瘤模型中均可以明显消除肿瘤，延长小鼠生存期，甚至一些C57BL/6 雄性小鼠肿瘤完全治愈。重要的是，采用联合治疗后再次接受致瘤剂量B16-F10.9细胞接种的小鼠比第一次接种致瘤剂量B16-F10.9细胞的小鼠生存期更长，其中23.5%的小鼠完全没有发展为肿瘤。来自微秒脉冲电场治愈后小鼠的脾脏细胞抑制了未处理小鼠的原发肿瘤的生长。同时，治愈后小鼠肿瘤组织病理学分析显示病灶有多个坏死区域，浸润了凋亡细胞、大量T淋巴细胞和巨噬细胞，表明低强度脉冲电场消融肿瘤激发了免疫应答。低强度脉冲电场联合化疗药物比手术切除对肿瘤消融和复发有更高的疗效。因此微秒脉冲电场在消融肿瘤过程中，激发了机体自身对于肿瘤细胞特异性的适应性免疫应答，该免疫反应有利于抑制继发肿瘤的生长和转移。

微秒脉冲电场消融肿瘤可能激发机体针对肿瘤特异性的免疫应答，但消融肿瘤局部的免疫情况有待阐明。Al-Sakere 等^[33]通过免疫组织化学染色研究了微秒脉冲电场消融小鼠骨肉瘤期间肿瘤局部的免疫细胞招募情况。他们主要观察了巨噬细胞(Mac1抗体标记)、CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞、活化的抗原提呈细胞和树突状细胞(抗CD86、CD80 和 CD11c抗体标记)的表达情况。结果表明，微秒脉冲电场可以完全消融小鼠的骨肉瘤而无热效应。脉冲电场消融后，肿瘤局部T淋巴细胞明显减少，并随着时间进展而进一步降低；抗原提呈细胞在脉冲电场治疗后2 h无变化，在治疗后6 h明显减少。因而推测可能因为免疫细胞浸润通道的破坏，肿瘤消融局部并未发现明显的免疫细胞浸润。因此，肿瘤局部免疫反应并不是微秒脉冲电场消融肿瘤效能的必备因素，微秒脉冲电场消融对于免疫低下的肿瘤患者可能也是一种有潜力的治疗方法。

微秒脉冲电场消融肿瘤并未引起肿瘤局部的免疫细胞招募，但其诱导的机体免疫反应的变化则值得探究。Li 等^[34]建立了大鼠的骨肉瘤模型，直接应用微秒脉冲电场消融肿瘤后分析脉冲电场处理前以及处理后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d大鼠外周血中T淋巴细胞亚群、血清IL-2受体和IL-10水平的变化；同时使用细胞内染色的方法检测了脾脏细胞中γ干扰素和IL-4的水平。结果发现，直接应用微秒脉冲电场可以完全消融肿瘤细胞。在脉冲电场消融联合手术切除组术后7 d，患者外周血淋巴细胞(尤其是CD3阳性淋巴细胞和 CD4阳性淋巴细胞)和CD4阳性淋巴细胞/CD8阳性淋巴细胞比率增加，与手术切除组比较，脉冲电场消融联合手术切除组细胞内免疫反应更强；脉冲电场消融联合手术切除组外周血中血清IL-2受体水平随着术后时间延长而降低，且明显区别于手术切除组。另外，微秒脉冲电场消融可增加γ干扰素阳性的脾脏细胞的比例。因而推测，微秒脉冲电场在荷载骨肉瘤小鼠中不仅可以局部破坏肿瘤，也可以改变机体免疫状态。

作为微秒脉冲电场的升级版，纳秒脉冲电场在诱导生物学效应和激发抗肿瘤免疫反应方面有自身特色的优势。除了诱导肿瘤细胞凋亡和抗血管生成以外，纳秒脉冲电场还可以破坏肿瘤微环境，引起肿瘤细胞相关的信号通路的改变，甚至通过激发机体特异性的免疫反应来抑制肿瘤的迁移和侵袭以及新生肿瘤的生成，最终不仅可消融原发肿瘤，还可抑制肿瘤的复发和转移。

之前的研究已经表明纳秒脉冲电场可以诱导肿瘤细胞凋亡^{[16, 17]}、抗血管生成^[17]等生物学效应，但其相关的肿瘤消融机制亟须阐明。Ren 等^[17]通过体外细胞学实验和荷瘤小鼠模型探讨了纳秒脉冲电场肿瘤消融的可能机制。在胰腺癌细胞学实验中，纳秒脉冲电场产生了广泛的生物学效应，不仅能够通过Bcl-2蛋白家族的失衡而触发线粒体依赖的内源性凋亡通路来诱导细胞凋亡，也可以通过抑制核因子-κB信号通路而降低周期蛋白的表达而抑制细胞增生。另外，纳秒脉冲电场也可通过抑制Wnt/β-Catenin信号通路来下调血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶家族蛋白的表达，从而降低肿瘤细胞的侵袭和转移。在荷瘤小鼠模型中，纳秒脉冲电场可能通过诱导肿瘤细胞凋亡、破坏肿瘤微环境和抑制血管生成来安全有效地发挥抗肿瘤作用。这些发现提示，适当的纳秒脉冲电场强度可能保持肿瘤细胞膜的完整性，从而使肿瘤细胞失去无限增殖、侵袭和转移的肿瘤学特性，进而可能塑造一个无毒性而保持肿瘤细胞抗原性的活肿瘤疫苗。这些研究为纳秒脉冲电场后续引起的免疫学反应以及可能塑造出的肿瘤疫苗奠定良好的理论基础。

纳秒脉冲电场可能激发肿瘤细胞特异性的免疫反应，进而抑制后续肿瘤的定植和生长。Nuccitelli 等^[35]研究人员通过紫外线诱导转基因小鼠的恶性黑色素瘤来观察纳秒脉冲电场的肿瘤消融效果以及激发的免疫学反应。在14只小鼠的27个黑色素瘤经2000个脉冲电场(100 ns，30 kV/cm)处理一天之后，所有的黑色素肿瘤开始皱缩，并在后来的12～29 d 逐渐消失。细胞核皱缩发生于纳秒脉冲电场处理后1 h，TUNEL法检测到的DNA碎片出现于处理后6 h。在一个黑色素瘤异位移植系统中，纳秒脉冲电场消融和手术切除荷瘤小鼠的肿瘤后，通过观察在免疫反应正常的小鼠中第二个肿瘤的生长情况来比较纳秒脉冲电场和手术切除诱导的免疫反应，结果发现，纳秒脉冲电场消融肿瘤后激发的免疫反应比手术切除激发的反应可以更加明显抑制第二个肿瘤的定植和生长，表明纳秒脉冲电场消融肿瘤所激发的免疫反应更有优越性，可以更好地发挥抗肿瘤的保护性免疫反应。这一免疫反应可能通过靶向肿瘤细胞的特异性CD4⁺T细胞的积聚来实现^[35]。

纳秒脉冲电场在黑色素瘤的消融中诱导了保护性的免疫反应，那么在其他肿瘤消融中是否可以激发抗肿瘤的免疫反应呢？Chen等^[36]使用肝细胞癌N1-S1细胞株在大鼠中建立了原位肝细胞癌模型，探讨纳秒脉冲电场对于肝癌消融诱发的免疫反应。结果表明，纳秒脉冲电场处理的N1-S1肿瘤组织中肿瘤细胞表达明显的活化的Caspase-3和Caspase-9(而不是Caspase-8)，这表明脉冲电场诱导了内源性的凋亡机制和Caspase独立的机制。重要的是，在脉冲电场成功消融过肿瘤的大鼠肝脏中再次注射N1-S1细胞，结果肿瘤不能再生长。在治疗期间，免疫细胞的浸润和粒酶B的高表达可能提示抗肿瘤的适应性免疫反应。因此，纳秒脉冲电场不仅能限制N1-S1 肝细胞癌生长，也能诱导一个保护性的免疫反应以防御同样肿瘤复发。

纳秒脉冲电场消融肿瘤可以诱导保护性免疫反应，进而抑制肿瘤复发。那么，脉冲电场消融对于肿瘤的转移作用则是一个亟待回答的问题。Yin等^[37]利用人肝细胞癌细胞株和高转移的肝癌异位移植模型探讨了纳秒脉冲电场消融诱导的免疫学效应。体外细胞学研究显示纳秒脉冲电场诱导的肝细胞癌细胞死亡呈脉冲电场剂量依赖性。在高转移肝癌细胞株(HCCLM3)的异位移植小鼠模型中，纳秒脉冲电场的单一剂量和多次处理均明显抑制了肿瘤的生长。除了局部消融效果以外，纳秒脉冲电场处理可减少肝癌的肺转移。体外实验也证明纳秒脉冲电场可促进人类巨噬细胞对肝癌细胞的吞噬作用。因而，纳秒脉冲电场在控制肝癌进展和降低肝癌转移方面有效。纳秒脉冲电场可能激发了宿主的免疫反应从而抵抗肿瘤细胞。

脉冲电场是一个极有潜力的肿瘤治疗手段，已经显示出了良好的临床应用前景。微秒脉冲电场作为一个相对成熟的肿瘤治疗手段，已经取得了较好的临床疗效；纳秒脉冲电场作为新一代的前沿性的生物电工具，亦在细胞和动物实验中展示出良好的肿瘤消融特性，以及自身独特的肿瘤消融优势。更为重要的是，脉冲电场作为新兴的物理学的肿瘤治疗手段，不仅能够引发肿瘤局部彻底消融，还能够激发机体保护性的免疫反应，进而抑制肿瘤的复发和转移。这些独特优势对于肿瘤的治疗有着广阔的临床应用前景。

然而，肿瘤的脉冲电场消融所激发的保护性免疫反应是如何产生的？其具体机制是什么？这些都是未来亟待回答的关键问题。同时，如何设置脉冲电场参数来保持肿瘤细胞的抗原性而消除其致瘤性则是后续研发肿瘤疫苗的关键节点；肿瘤疫苗如何再次发挥抗肿瘤的保护性免疫作用已成为临床关心的问题。这些问题的解答亟需更多更广泛的研究。