传统中药常用剂型由于服药量大且机体吸收率低，难以充分发挥其效能，因此急需发展新的中药剂型。将纳米技术应用到中药研究领域，不仅能够提高药物的生物利用度，增强靶向性，还可以改变传统中药的给药途径和剂型，是中药剂型的一个重要发展方向^[1]。然而,传统纳米中药在制备过程中往往需要经过复杂的改性如表面修饰等才能达到较好的释药效果，又会对药物活性产生影响;同时存在药物包封率较低，贮存稳定性不好等问题，有待进一步的改进和完善。静电喷射技术制备纳米控释系统的深入研究和发展，为实现中药纳米化提供了契机^[2]。静电纺丝是一种利用高压电场将聚合物的溶液或熔体制备成纤维状物质的方法。用静电纺丝技术制备的纳米纤维膜在三维结构上有大的比表面积和较高的孔隙率，其药物释放量较普通膜的药物释放量显著增加，并且释放时间延长，药物的效用可得到充分发挥。纳米纤维膜具有可控性和加工性，可使药物保持高度稳定的分散状态，并对药物活性几乎不产生影响，是制备纳米药物的研究热点之一^{[3, 4]}。

三七为五加科人参属植物三七的干燥根，其主要活性成分是三七皂苷，具有抗炎、止血化瘀、抗衰老、抗肿瘤等功效。壳聚糖是甲壳素脱乙酰后得到的一种天然高分子聚氨基多糖。它无毒可降解，不仅具有良好的生物相容性、多种生物活性、生物黏性，还能起到促进伤口愈合、吸收伤口渗出物等作用^{[5, 6, 7, 8, 9]}。由于壳聚糖的稳定性较差，因此在使用的时候往往需要进行交联以提高其结构稳定性。目前壳聚糖常用的交联剂主要是戊二醛、环氧氯丙烷和异氰酸酯等，但这些小分子化合物都有一定的生物毒性，会影响壳聚糖在生物、医学领域的应用^[10]。聚丙烯酸是一种低毒性的化合物，其相应的钠盐是一种常用食品添加剂。本研究利用聚丙烯酸链上的羧基分别与壳聚糖链上的氨基和羟基发生酰化和酯化反应，实现纤维交联；然后以三七颗粒为模型中药、壳聚糖为载体、聚丙烯酸为交联剂，采用静电纺丝技术对中药新剂型进行了探究。将中药制备成纳米纤维剂型，研究纳米纤维膜对中药活性组分释放性能的影响，以期为中药纳米纤维剂型的制备和应用提供参考。

壳聚糖(医药级，M_n=2.0×10⁵，脱乙酰度：95%，浙江澳兴生物科技有限公司)；丙烯酸(分析纯，阿拉丁试剂有限公司)；聚氧化乙烯(M_n=1.0×10⁶，上海联盛化工有限公司)；50%戊二醛(分析纯，阿拉丁试剂有限公司)；三七颗粒(直径不超过3 μm，浙江震元医药连锁有限公司)；其他试剂都是分析纯。

主要实验仪器有傅里叶红外光谱仪(NEXUS 670，美国Nicolet公司)；热重分析仪(HCT-3，北京恒久科学仪器厂)；紫外可见光分光光度计(UV-1800PC，上海美普达仪器有限公司)；扫描电镜(Jsm-6360lv，日本Jeol公司)；静电纺丝仪(FM1206，北京富友马有限公司)；万能试验机(YG065HC/PC，山东莱州电子仪器有限公司)。

将0.9 g壳聚糖和0.1 g 聚氧化乙烯溶于20.0 g质量分数为80%的乙酸水溶液中，搅拌溶解后加入0.2 g的三七颗粒，得到悬浮液。

将悬浮液于静电纺丝仪上进行纺丝，其中纺丝参数如下：电压20 kV，针头内径1.1 mm，接收距离18 cm，供料速率1.5 mL/h。接收板上收集得到的纺丝纤维在真空干燥箱中60 ℃干燥12 h。将静电纺丝得到纤维膜置于2.5%的戊二醛水溶液中，浸泡3 h，取出后烘干。

将20.0 g丙烯酸、0.2 g过氧化苯甲酰和200 mL甲苯分别加入到圆底烧瓶中，110 ℃反应5 h，过滤干燥后得到聚丙烯酸，数均分子量为2.98×10⁴，分子量分布指数为2.29。

将0.9 g壳聚糖，0.1 g聚氧化乙烯和0.8 g聚丙烯酸溶于40.0 g 质量分数为80%的乙

酸溶液中，搅拌溶解后加入0.2 g的三七颗粒，搅拌制备悬浮液。静电纺丝方法同上述1.2。制备得到的纤维膜先在真空干燥箱中60 ℃干燥12 h，然后再升温至150 ℃交联反应2 h(见图1)。

图1 交联壳聚糖/聚丙烯酸/聚氧化乙烯包埋三七颗粒纳米纤维的制备示意图 Fig.1 The diagram of preparation of cross-linked chitosan/poly(acrylic acid)/poly(ethylene oxide) fiber

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将制备好的三七、壳聚糖、聚丙烯酸、聚氧化乙烯悬浮液涂于聚乙烯板上，在空气中自然干燥3 h，然后真空干燥12 h。三七涂覆膜从聚乙烯板上剥离后置于150 ℃烘箱内交联1 h。三七涂覆膜的厚度约为120 μm，采用千分尺测量。

称取三七纤维膜或三七涂覆膜放入PBS(pH=7.4)中，在(37±0.5) ^oC下静置15 h，取出后吸干膜表面溶液并称重。溶胀率采用以下公式进行计算：

溶胀率(%)=(W₂－W₁)/W₁×100%

其中W₁和W₂分别是放入PBS前和浸泡吸干后膜的质量。

利用傅里叶红外光谱仪表征纤维膜和涂覆膜的化学结构；利用热重分析仪分析材料的热稳定性，氮气保护，升温速率为10 ℃/min；溶液的吸光度采用紫外可见光分光光度计进行跟踪检测；利用扫描电镜观测纤维膜和涂覆膜的表面形貌，纤维膜和涂覆膜表面进行喷金(2～3 nm)以提高分辨率；利用万能试验机测定纤维膜的拉伸强度，其中测试纤维膜呈1 cm×2 cm的条状。

将样品(三七纤维膜或三七涂覆膜500 mg和三七颗粒50 mg)加入到60 mL PBS中(pH=7.4)，37 ℃恒温水浴中振荡孵育15 h，在特定时间内取样测定其在203 nm处的吸光度，并将所取样品倒回溶液中，记录吸光度值。

将制备的壳聚糖/聚丙烯酸/聚氧化乙烯包埋的三七纤维膜和涂覆膜分别进行扫描电镜观察(图2)。结果显示三七纤维膜上形成了良好形貌的纤维，三七涂覆膜结构致密。实验表明通过静电纺丝可以制备良好形貌的三七纤维膜(图2A)。纤维的平均直径为181 nm，三七颗粒的直径较大(不超过3 μm)，所以在纤维膜上可以看到被纤维包裹的颗粒。而通过涂覆得到的壳聚糖膜，由于膜厚度(120 μm)远远大于三七颗粒直径，膜表面看不到三七颗粒的存在，表明三七颗粒已经完全被包裹在膜内部(图2B)。壳聚糖可溶于酸中，将制备的三七纤维膜和三七涂覆膜分别置于80%的乙酸溶液中15 h后检测其耐溶剂性能。结果显示三七纤维的直径明显增加(图2C)。虽然纤维之间发生了粘连，但是纤维结构并没有被破坏，孔结构也依然存在；涂覆膜的表面结构没有明显的变化(图2D)。

图2 三七纤维膜和三七涂覆膜的扫描电镜照片 Fig.2 Scanning Electron Microscope of pseudo-ginseng nanofibrous membrance and pseudo-ginseng casting film A: 三七纤维膜，标尺=5 μm; B: 三七涂覆膜，标尺=50 μm; C: 在80 %乙酸溶液中浸泡15 h后的三七纤维膜，标尺=5 μm; D: 在80%乙酸溶液中浸泡15 h后的三七涂覆膜，标尺=10 μm．

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拉伸试验结果测定的未交联纤维膜的拉伸强度为5.16 MPa，经戊二醛交联剂处理过的纤维膜拉伸强度基本消失，但采用聚丙烯酸交联的壳聚糖纤维膜，其拉伸强度增加到6.98 MPa。

以聚丙烯酸为交联剂来制取纤维膜得到了较好的性能，但是聚丙烯酸的交联温度为150 ℃。为了探究在交联过程中三七颗粒、未交联三七纤维膜和交联后三七纤维膜是否发生了分解，对上述三种材料进行了热失重分析。实验结果显示三七颗粒的分解温度为208 ℃，未交联三七纤维膜的分解温度为180 ℃，交联三七纤维膜的分解温度为197 ℃(图3)。

图3 三七颗粒、未交联三七纤维膜和已交联三七纤维膜的热失重曲线 Fig.3 Thermogravimetric analysis curves of pseudo-ginseng particles，non-crosslinked pseudo-ginseng fibrous membrane and crosslinked pseudo-ginseng fibrous membrane

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为了研究热交联方法是否对三七纤维膜和三七涂覆膜化学结构产生影响，采用红外光谱对三七纤维膜和涂覆膜的化学结构进行了测定。红外光谱结果显示三七纤维膜和三七涂覆膜具有相似的化学结构(图4)，表明该交联温度没有对三七纤维膜和三七涂覆膜的化学结构产生明显影响。

图4 三七涂覆膜(未交联和已交联)和三七纤维膜的红外光谱 Fig.4 FT-IR spectra of pseudo-ginseng casting film (non-crosslinked)，pseudo-ginseng casting film and pseudo-ginseng fibrous membrane

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三七纤维膜和三七涂覆膜在PBS溶液中的溶胀率见表1，其中平均值分别为(217.0±20.6)%和(112.5±13.8)%，三七纤维膜的溶胀率是三七涂覆膜的1.93倍。

三七的成分非常复杂，其中三七皂苷是三七的主要活性成分，具有紫外吸收特性^{[11, 12]}。三七颗粒、三七涂覆膜和三七纤维膜在PBS中浸泡1 h后溶液的紫外吸收光谱见图5，实验结果显示三者在210 nm处均有一强吸收峰，与文献报道采用203 nm的紫外吸收峰用于三七皂苷的分离鉴定基本一致^{[12, 13]}。

图5 三七颗粒、三七涂覆膜和三七纤维膜在PBS溶液中浸泡1 h后的溶液紫外吸收光谱 Fig.5 UV-Vis spectra of pseudo-ginseng particles，pseudo-ginseng casting film and membrance immersed in PBS solution for 1 h

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由于三七释放的活性组分在210 nm处有一个明显的紫外吸收峰，采用210 nm处的紫外吸光度来表征三七释放的活性组分量(图6)。实验结果显示三七纤维膜中三七的释放速度和释放总量优于三七涂覆膜。

图6 三七颗粒、三七涂覆膜和三七纤维膜于PBS溶液中在210 nm处紫外吸光度随时间变化曲线 Fig.6 The determination of UV-absorption at 210 nm of pseudo-ginseng particles，pseudo-ginseng casting film and pseudo-ginseng fibrous membrane

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聚氧化乙烯是常用于改进壳聚糖纺丝性能的添加剂，少量的聚氧化乙烯(10%)的加入就可以得到良好形貌的壳聚糖纤维膜。文献利用静电纺丝制备聚丙烯酸/聚乙烯醇纤维膜，然后通过简单的热交联促使聚乙烯醇链上的羟基和聚丙烯酸链上的羧基发生酯化反应，最终获得了具有良好结构稳定性的交联聚乙烯醇/聚丙烯酸纳米纤维膜^[13]。为此，我们在三七/壳聚糖/聚氧化乙烯悬浮液中加入了聚丙烯酸，静电纺成纤维膜后通过加热促使壳聚糖链上的氨基或羟基与聚丙烯酸链上的羧基反应，获得了结构稳定性强的交联三七/聚丙烯酸/壳聚糖纳米纤维膜。溶胀结果显示纤维膜虽然有明显的溶胀，但纤维结构依旧存在；而且制备的涂覆膜也没有发生溶解，表明纤维之间的确发生了交联反应。

戊二醛是使用最为广泛的壳聚糖交联剂之一^[10]。戊二醛虽能使壳聚糖纤维发生交联，但是交联后的壳聚糖纤维膜几乎无力学强度。利用聚丙烯酸作为交联剂，在提高壳聚糖纤维膜耐溶剂性能的同时，还增加了壳聚糖纤维膜的力学强度，是一种更为可取的方法。

聚丙烯酸的交联需在150 ^oC下进行，因此纤维膜和三七的热稳定性也需要进行考察研究，以避免纤维或三七发生分解。结果显示未交联三七纤维膜和三七颗粒的分解温度均高于150 ^oC，同时热交联过程还可以提高三七纤维膜的热稳定性。根据文献报道，采用适当的高温处理，可以使三七中主要的人参皂苷Rb₁、Rd、Re、Rg₁转化为稀有人参皂苷Rg₃、Rg₂、Rh₂、C-K和苷元等，更有利于人体吸收和利用^{[11, 12]}。红外光谱也证明交联后的三七纤维膜化学结构没有发生明显改变。所以150 ^oC的交联温度对三七颗粒和三七纤维膜是安全的。

相比于三七涂覆膜(膜厚=120 μm)，三七纤维膜具有更小的径向直径(181 nm)和更大的通量，从而有利于纤维内部小分子化合物快速地释放进入缓冲液中；另外，根据文献报道，在高分子材料中，高分子链之间无规堆积，存在大量的空穴结构(自由体积)，这些空穴结构可以容纳小分子化合物，而且空穴结构随材料的溶胀而发生扩张。其中,三七纤维膜的溶胀率为三七涂覆膜的2.17倍，也一定程度上促使纤维膜具有更好的释药性能^[14]。

总之，采用静电纺丝技术将三七颗粒负载于交联壳聚糖/聚丙烯酸/聚氧化乙烯纤维膜上，纤维平均直径为(181±71) nm。采用简单的热处理提高了三七纤维膜的机械性能、耐溶剂性能和热性能；体外释药实验结果表明纤维结构可以促进三七活性组分的释放，而且释放药物总量也明显增加，有望应用于制备新型中药制剂。