脓毒症是由感染引起的全身炎性反应综合征，具有发展快、预后差的特点，早期如不能给予有效的治疗，极易发展为脓毒症休克，诱发多脏器衰竭[1]。改善脓毒症休克治疗效果的关键在于早期发现、早期诊断、正确评估以及早期干预[2]。脉搏指示连续性心输出量(pulse indicator continuous cardiac output，Picco)检测是近年来开展的一种微创血流动力学检测技术，可反映患者血流动力学参数和心脏收缩、舒张功能，广泛用于休克患者的补液和给药指导[3]。MicroRNA是近期较为热门的生物学指标，有研究表明脓毒症患者早期的microRNA-150水平较低[4]。但关于脓毒症休克患者microRNA-150水平和Picco指标的关系及两者与患者预后关系的报道还较少见，因此本研究探讨脓毒症休克患者的microRNA-150水平变化与Picco指标的相关性，分析两者与患者预后的关系，同时探索两者联合判断患者预后的临床价值。
1 对象与方法 1.1 研究对象回顾性收集2012年8月至2014年8月由上海市交通大学附属第一人民医院松江分院急诊危重病科收治的脓毒症休克患者的临床资料。研究共纳入患者48例，其中男性29例，女性19例。中位年龄42岁(24～69)岁。研究纳入标准为：成年脓毒症休克患者，存在明显临床感染表现，符合国际严重脓毒症/脓毒性休克治疗指南(2012)定义的诊断标准[5]；存在全身炎症反应综合征；收缩压＜90 mm Hg或减少程度＞40 mm Hg或需接受血管活性药物维持血压；平均动脉压＜60 mm Hg；少尿。排除标准：未成年患者；感染外原因造成的休克，如失血性休克；不适合行Picco监测的其他原因。根据治疗28 d后的转归，将研究对象分为死亡组和存活组。患者或患者家属对研究内容知情同意，研究内容经相关伦理委员会批准。
1.2 主要试剂和材料MiRcute miRNA提取分离试剂盒购自北京天根生物科技有限公司，TaqMan® microRNA反转录试剂盒购自美国Life Technologies公司，SYBR® Premix Ex TaqTM II kit购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.3 实时定量PCR检测脓毒症休克患者血浆microRNA-150水平在脓毒症休克诊断成立的2 h内采集患者静脉血，使用miRcute miRNA 提取分离试剂盒，按照说明书方案提取血浆标本中的microRNA。使用TaqMan® microRNA反转录试剂盒将获取的microRNA反转录为cDNA，反转录体系和条件参考说明书。对获得的cDNA进行实时定量RT-PCR扩增，试剂盒采用SYBR® Premix Ex TaqTM II 试剂盒，反应体系和条件参考说明书。引物序列参考相关文献报道[5]，其中，microRNA-150上游引物序列为5′-GCTCTCCCAACCCTTGT-3′，下游引物为5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′，使用mcroRNA-16 作为内参，其上游引物序列为 5′-CGCGCTAGCAGCACGTAAAT-3′，下游引物为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以2-ΔΔCT表示microR-150的相对表达倍数，ΔCT=CT值目标基因-CT值内参基因，ΔΔCT=ΔCT值死亡组-ΔCT值存活组。
1.4 Picco监测与治疗常规留置中心静脉导管检测中心静脉压和平均动脉压。自股动脉置入Picco导管，采用德国PULSION PC8500监测系统记录心指数、血管外肺水指数(EVLWI)、胸腔内血容量指数(ITBVI)、体循环阻力指数(SVRI)以及肺毛细血管通透性指数(PVPI)。所有患者均积极接受早期常规基础治疗，包括复苏、血管活性药物维持血压、抗感染、机械通气等。
1.5 统计学方法统计学分析采用SPSS 19.0软件进行，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，并采用K-S检验进行正态分布检验。正态分布计量资料两组间的比较采用t检验，率的比较采用卡方检验，相关性分析采用spearman相关分析，生存分析采用Kanplan-Meier生存曲线结合log-rank检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果 2.1 不同预后患者的microRNA-150水平根据患者转归情况，有23例患者存活，25例患者死亡。存活患者和死亡患者之间的年龄、性别及原发感染部位差异无统计学意义(P<0.05)。患者血浆中microRNA-150检测结果，死亡组microRNA-150水平较低，为存活组的(61±3)%，差异有统计学意义(t=-10.32，P<0.05)，见图1。
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| 图1 不同预后患者的microRNA-150相对表达水平 Fig.1 Relative expression levels of microRNA-150 in patients with different prognoses *两组比较，P<0.05. |
以所有患者microRNA-150水平(2-ΔCT)的均值为界，可将所有患者分为低microRNA-150水平组(26例)和高microRNA-150水平组(22例)，分析Kanplan-Meier生存曲线，结果低microRNA-150水平组患者的28 d存活率较低(21.8%)，与高 microRNA-150水平组(68.2%)差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。单因素分析结果，低microRNA-150水平是患者预后不良的危险因素(OR=2.176，95%CI：1.121～4.223，P<0.05)，详见表1。
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| 图2 不同microRNA-150水平患者的28 d生存曲线 Fig.2 Survival curves of 28 d in patients with different microRNA-150 levels |
( ±s) | ||||||
| 组别 | n | CI(L·min-1·m-2) | EVLWI(mL·kg-1) | ITBVI(mL·m-2) | SVRI(d·s-1·m-2·cm-5) | PVPI |
| 存活组 | 23 | 3.41±0.32 | 9.54±0.98 | 954.21±46.82 | 2025.33±156.56 | 1.95±0.11 |
| 死亡组 | 25 | 2.23±0.28 | 17.22±1.13 | 964.14±81.89 | 2223.43±189.21 | 2.93±0.14 |
| t值 | 13.653 | -14.061 | -0.252 | -0.337 | -15.658 | |
| P值 | <0.05 | <0.05 | >0.05 | >0.05 | <0.05 | |
| CI：心指数，EVLWI：血管外肺水指数，ITBVI：胸腔内血容量指数，SVRI：体循环阻力指数，PVPI：肺毛细血管通透性指数． | ||||||
存活组和死亡组患者入ICU时的中心静脉压及平均动脉压差异均无统计学意义(P<0.05)。分析Picco检测指标发现，仅心指数、EVLWI以及PVPI 三个指标在两组间的差异具有统计学意义(均P<0.05)，其中，存活组患者的心指数较高，EVLWI及PVPI均低于死亡组(均P<0.05)，详见表1。Logistic多因素回归分析发现，低心指数、高EVLWI、高PVPI为患者死亡的独立风险因素，OR值分别为2.13(95%CI：1.563～5.644，P<0.05)、1.86(95%CI：1.982～10.323，P<0.05)、1.67(95%CI：1.5912～9.681，P<0.05)，以X1、X2、X3分别代表变量心指数、EVLWI及PVPI，得到回归方程P=1/[1+e-(2.55+0.75X1+0.62X2+0.51X3)]。
2.3 MicroRNA-150水平与Picco指标的关系及二者联合判断患者预后的价值Spearman相关性分析显示，microRNA-150水平与心指数呈正比(r=0.712，P<0.05)，但与EVLWI和PVPI呈反比(r=-0.622和-0.689，均P<0.05)。分别以microRNA-150水平、Picco参数模型、microRNA-150+Picco参数模型作为检验量，绘制诊断患者死亡的ROC曲线。3条ROC曲线下的面积分别为0.691(95%CI：0.533～0.849，P<0.05)、0.716(95%CI：0.558～0.873，P<0.05)和0.831(95%CI：0.693～0.970，P<0.05)，可见与单独采用microRNA-150或Picco参数模型相比，microRNA-150联合Picco参数诊断患者死亡的临床价值较高(P<0.05)，见图3。
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| 图3 MicroRNA-150及Picco参数单用或联合用于诊断脓毒症休克患者死亡的ROC曲线 Fig.3 ROC curves of microRNA-150,Picco,and microRNA-150 combined with Picco for the diagnosis of deaths of patients with septic shock |
脓毒症休克因其较高的死亡率备受重症医学领域的关注。目前对于脓毒症休克的治疗主要采用集束化方案，即根据患者情况综合应用液体复苏、机械通气、血管活性药物以及抗感染治疗。这些治疗的实施，特别是液体复苏和血管活性药物的使用有赖于患者血流动力学的检测结果[6]。既往使用的一些检测指标，如肺动脉楔压易受胸内压、机械挺起的影响，具有一定的应用局限性。Picco检测是近年新发展的一项检测技术，具有微创、操作简便的优点。特别是Picco检测指标敏感性强、重复性好，较少受呼吸运动和心肌顺应性的影响[7]。有很多研究表明，在脓毒症休克患者的治疗中应用Picco后，复苏液体用量更加合理，血管活性药物使用及时、用量减少，肾损伤等不良反应也减少[8]。本研究发现，预后不佳的死亡组患者心指数较低、EVLWI较高、PVPI较高。心指数反应心输出量大小，较低的心指数表示患者心排量不充足，在同等液体复苏治疗下，复苏效果可能更差。EVLWI是肺组织内血管外的液体总量，
较大的EVLWI意味着肺水肿的发生，表明患者出现了肺泡毛细血管的损伤，提示脓毒症对肺部的损伤较重，而且较重的肺部损伤增加了心脏的负担，容易诱发心力衰竭，增加了脓毒症休克患者的病死率。PVPI与EVLWI类似，也是用于反应肺水肿的程度，用于评估肺毛细血管的损伤。PVPI与EVLWI可用于评价脓毒症休克患者的预后，这一研究结果与其他研究一致。
尽管Picco在脓毒症休克患者的集束化治疗中具有重大优势，但其毕竟仅反映血流动力学的变化，因此有必要引入其他生物学指标从而对患者病情的监测更加全面、合理。本研究中，我们考虑引入microRNA-150作为评估脓毒症休克患者的辅助指标。MicroRNA是真核生物中普遍存在的一类短链非编码RNA，具有调节靶基因表达，进而影响细胞增殖、凋亡等生理活动的功能[9]。近期研究表明，脓毒症过程中伴有多种microRNA的表达变化。如有研究表明，儿童脓毒症患者血浆microRNA-223水平上升可作为早期诊断脓毒症休克的标志物。microRNA-143水平在脓毒症发生时会降低，与炎性因子的水平呈负相关[10, 11]。本研究发现，预后不佳的脓毒症休克患者microRNA-150水平较低，且microRNA-150水平与患者的Picco指标相关性较好。MicroRNA-150水平较低的患者发生死亡事件的风险较高(OR=2.176)，且28 d存活率较低，可见较低水平的microRNA-150预示着患者预后不良。至于microRNA-150影响脓毒症休克患者预后的机制，结合既往报道有关microRNA在脓毒症中的作用机制，我们考虑可能与如下几个方面有关：①microRNA-150可能影响免疫应答或者免疫识别，影响Toll样受体对细菌胞壁脂多糖成分的识别，进而调控炎性介质释放；②microRNA-150影响细胞免疫和体液免疫的活性，调控机体抗感染能力；③microRNA-150影响治疗药物的效果，如对激素反应性的影响。MicroRNA-150结合Picco指标预测脓毒症休克患者死亡的临床效能更高。因此，我们认为microRNA-150与Picco指标均能预测脓毒症患者的预后，两者具有相关性，而且本文研究结果提示联合应用的临床价值更大。
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