机体抗病毒感染免疫应答涉及多种机制和信号转导通路,而对某些重要信号分子的调控在机体抗病毒中起着关键作用,这些调控方式包括磷酸化、泛素化、甲基化、乙酰化等,其中泛素化越来越受到人们的重视[1, 2]。泛素化作为一种蛋白质转录后修饰方式,可将泛素分子共价连接到底物蛋白质上,形成结构与功能的复合体,其与去泛素化作用共同调节细胞功能,在蛋白酶体和溶酶体依赖的蛋白质降解、DNA修复、细胞周期调节、内吞作用以及激酶激活的调节中起着重要作用。泛素化过程主要有三种酶参与:E1泛素活化酶、E2泛素结合酶、E3泛素连接酶。而去泛素化酶是与泛素化相关的一类蛋白酶,它能够逆转底物蛋白质的单泛素或多泛素链修饰,从而调节细胞功能。人类基因组编码100多种具有特异性的去泛素化酶,后者分为5个家族,分别是泛素C端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolase)家族、泛素特异性蛋白酶(ubiquitin specific protease,USP)家族、 卵巢肿瘤家族、Josephin 结构(Josephin domain)家族和JAMM金属酶(JAB1/MPN/Mov34 metalloenzyme)家族。前四种属于半胱氨酸蛋白酶家族,第五种属于金属酶家族[3]。近年还发现一种去泛素化酶称为单核细胞趋化蛋白诱导蛋白(monocyte chemotactic protein-induced protein),也属于半胱氨酸蛋白酶,是第六种去泛素化酶[4]。本文就USP家族及其调控抗病毒感染免疫的研究进展作一综述。
1 USP家族简介USP家族是目前所知的去泛素化酶中成员最多、结构最具多样性的一类。USP分子由三个亚区域组成,分别是手指区、手掌区和拇指区,共同形成一个类似右手的结构。大多数USP分子都包含一个催化结构域和一个蛋白质相互作用区域,然而USP家族大多数成员的结构和功能尚不十分清楚。USP作为去泛素化酶,可以裂解底物蛋白的单泛素分子和(或)多聚泛素链,影响信号转导通路或是介导底物蛋白进行依赖蛋白酶体的蛋白降解。目前对K48和K63位多聚泛素化的研究比较广泛,K48位多聚泛素化主要介导底物蛋白依赖蛋白酶体的降解,而K63位多聚泛素化则介导细胞周期调节、DNA修复和信号转导等功能[5, 6, 7]。USP家族大多通过调控核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)信号转导通路或/和干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3,IRF3)信号转导通路中重要蛋白分子的K48和/或K63位去泛素化而调控机体抗病毒感染免疫应答[8]。NF-κB是核转录因子,其激活后入核才能影响基因转录及表达。当机体处于正常状态时,NF-κB存在胞浆内。静息状态下,NF-κB二聚体与其抑制蛋白核转录因子κB抑制因子(inhibitor κB,IκB)结合,NF-κB以无活性的三体形式存在于细胞质中;病毒入侵后,IκB被降解,其对NF-κB的抑制作用消失,NF-κB转位入核调控基因转录及表达,产生I型干扰素等抗病毒细胞因子[9]。IRF3亦为核转录因子,当细胞未受到刺激时其存在于细胞浆内;病毒侵入机体时,可与相应受体反应诱导IRF3磷酸化而活化,形成同源二聚体转位入核,与特定的DNA序列结合从而调控I型干扰素等细胞因子的产生[10]。USP家族有50多个成员,目前发现与抗病毒免疫应答相关的USP分子包括USP2b、USP3、USP4、USP13、USP15、USP17、USP18、USP25等。
2 USP2b与抗病毒感染免疫USP2至少有三个亚型:USP2-69 (USP2a)、USP2-45 (USP2b)和USP2-41 (USP2c),三个亚型有相同的催化中心。USP2b能够通过去泛素化TNF受体相关因子(TNF receptor-associated factor,TRAF) 家族成员相关的NF-κB活化因子(family member-associated NF-κB activator,TANK)结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)的K63位多聚泛素链负向调节IRF3信号通路。当病毒入侵细胞后,病毒成分被相应受体识别,激活TBK1。活化的TBK1磷酸化IRF3,使IRF3二聚化入核,从而启动I型干扰素基因转录,发生抗病毒免疫反应。USP2b作为一种去泛素化酶与TBK1相互作用,裂解TBK1上K63位的多聚泛素链,从而抑制TBK1的激酶活性,抑制IRF3磷酸化,负向调控β干扰素信号通路和抗病毒免疫应答[11]。
3 USP3与抗病毒感染免疫USP3是与核染色质相关的去泛素化酶,其对于组蛋白2A (histone 2A,H2A)和组蛋白2B(histone 2B,H2B)的单泛素化有很强的去泛素化酶活性,进而维持基因组的完整性[12]。USP3也在抗病毒感染中发挥作用。USP3通过去泛素化维甲酸诱导基因蛋白I(retinoic acid-inducible gene I,RIG-I)负向调控IRF3信号通路,RIG-I的K63位连接的多聚泛素链对于激活I型干扰素信号通路有着重要的作用。RIG-I是重要的模式识别受体(pattern recognition receptor),能够识别多种病毒RNA[13]。RIG-I由三个部分组成:N端的两个半胱天冬氨酸酶募集区域 (caspase recruitment domain,CARD),中间的DExD/H盒解螺旋酶/三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)酶区域,C端的调节区域(C-terminal regulatory domain,CTD)。当病毒入侵机体时,RIG-I能识别病毒RNA,RIG-I寡聚化后通过CARD结构与线粒体抗病毒信号蛋白 (mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)的CARD结构结合诱导MAVS寡聚化,MAVS复合物随后募集干扰素基因刺激因子和TBK1等信号分子,引起IRF3的磷酸化、二聚化、核内转录和β干扰素的产生。RIG-I的CARD结构和CTD结构K63位多聚泛素化可以活化RIG-I信号通路[14],而CARD结构K48位多聚泛素化则可以介导RIG-I的降解,从而负向调节RIG-I信号通路。机体处于正常状态即无刺激或感染时,USP3与RIG-I样受体之间并无相互作用;当病毒侵入机体或RIG-I样受体被配体激活后,USP3与RIG-I样受体结合,裂解RIG-I样受体的多聚泛素链,使其失去激活IRF3的功能,IRF3磷酸化减少,I型干扰素等抗病毒细胞因子生成减少。而用干扰RNA将USP3基因干扰抑制其表达后,RIG-I的K63位泛素链的连接特异性增强,IRF3磷酸化增强,干扰素等细胞因子产生增多,细胞抗病毒感染免疫应答增强[15]。
4 USP4与抗病毒感染免疫早期认为USP4是一种具有致癌性的核酸蛋白,近来研究发现其也可以裂解不同大小的泛素融合蛋白的泛素链[16]。USP4可通过去泛素化RIG-I调控细胞抗病毒固有免疫应答。过表达USP4明显增强RIG-I触发的β干扰素信号通路,并抑制水疱性口炎病毒的复制。用干扰RNA的方法抑制USP4的表达则可明显减少β干扰素的产生,水疱性口炎病毒复制增强。USP4作为一种去泛素化酶,可以与RIG-I相互作用移除RIG-I的K48位多聚泛素链,抑制其蛋白酶体途径的降解,从而稳定RIG-I蛋白,促进β干扰素的产生,发挥抗病毒效应[17]。
5 USP13与抗病毒感染免疫USP13又称为异肽酶T3,有四个泛素结合位点,包括两个羧基末端泛素相关区域(ubiquitin-activating enzyme),一个锌指泛素特异性蛋白酶区域(zinc finger ubiquitin-specific protease)以及一个催化区域。在涉及信号传导及转录激活因子1 (signal transducers and activators of transcription 1,STAT1)的I型干扰素信号通路中,I型干扰素与受体结合,干扰素通过受体相关JAK(Janus kinase)激酶激活信号通路,活化STAT1。磷酸化的STAT1与STAT2二聚化,再与干扰素调节因子9(interferon regulatory factor 9)共同形成干扰素基因因子3(interferon gene factor 3)复合物,此复合物可与干扰素刺激反应元件(interferon-stimulated response element)结合,启动干扰素基因的转录和表达。用干扰RNA筛选去泛素化酶发现USP13可以调控α干扰素抗2型登革病毒(dengue virus serotype 2)的活性。用干扰RNA将USP13干扰阻断USP13蛋白的表达后,α干扰素信号通路及抗2型登革病毒抗体活性均减少。而过表达USP13时,STAT1蛋白水平及稳定性明显增加。结果证实USP13通过去泛素化STAT1可稳定其结构和增加蛋白含量,从而正向调控I型干扰素信号通路,发挥抗病毒作用[18]。
6 USP15与抗病毒感染免疫USP15是由一个N端的双特异性磷酸酶(dual specificity phosphatase)结构、一个串联的泛素样区域(ubiquitin-like)和一个C端的结构域构成的物质。USP15可通过去泛素化三结构蛋白25(tripartite motif protein 25,TRIM25)发挥抗病毒作用。RIG-I的K63位多聚泛素化可引起RIG-I的活化进而刺激I型干扰素等抗病毒细胞因子的产生。催化这个多聚泛素链的E3连接酶是TRIM25,而TRIM25自身被线性泛素装配复合物(linear ubiquitin assembly complex)介导的K48泛素化,引起TRIM25降解,从而抑制RIG-I信号通路。USP15可以去泛素化TRIM25,阻断线性泛素装配复合物依赖的TRIM25降解。用干扰RNA将内源性USP15干扰后,TRIM25的泛素化明显增强。另外,异位表达USP25也能增加TRIM25和RIG-I依赖的I型干扰素的表达,并能抑制RNA病毒的复制[19]。因此,USP25在抗病毒固有免疫应答信号通路中起着精细调节的作用。
7 USP17与抗病毒感染免疫USP17广泛存在于各种组织和细胞的蛋白酶,并且在细胞的增殖和存活中起着重要的作用。USP17也能通过同时去泛素化RIG-I和黑色素瘤分化结合蛋白5(melanoma differentiation-associated protein-5,MDA5)发挥抗病毒作用。当病毒侵袭机体时,RIG-I样受体可识别病毒双链核糖核酸(double-stranded RNA,dsRNA),RIG-I样受体结构改变,招募下游蛋白和激酶,引起转录因子NF-κB和IRF3活化,共同诱导I型干扰素表达[20]。MDA5是RIG-I样受体的一个成员,它可识别病毒RNA,与之结合形成复合物,此复合物可被招募到病毒诱导的信号通路适配子 (virus-induced signaling adaptor)上,病毒诱导的信号通路适配子与干扰素基因刺激因子 (stimulator of interferon genes)和TNF受体相关因子3(TNF receptor associated factor 3,TRAF3)相互作用,后者再与NF-κB激酶抑制因子(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK)复合物反应活化NF-κB。通过cDNA文库筛选发现USP17是病毒诱导的Ⅰ型干扰素信号通路的重要调节因子。过表达USP17可抑制仙台病毒诱导的NF-κB和干扰素刺激反应元件的活化,用干扰RNA特异性干扰USP17的表达则会抑制仙台病毒诱导的β干扰素的产生。研究结果表明USP17可同时去泛素化RIG-I和MDA5,正向调节干扰素信号通路,且对RIG-I的K48位和K63位多聚泛素链均有去泛素化作用。USP17对I型干扰素信号通路的调节具有特异性。将USP17干扰后,其对γ干扰素诱导的IRF1启动子活化及TNF诱导的NF-κB活化并无明显影响。该调节作用特异性作用于RIG-I和MDA5,其对poly(I∶C)诱导的Toll样受体(Toll-like receptor)介导的β干扰素启动子活化无明显影响[21]。
8 USP18与抗病毒感染免疫USP18是一种作用广泛的分子,它参与了包括细胞周期的调控、炎症反应、应激和免疫应答等多种生命过程。有研究表明,USP18能促进猪繁殖和呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的复制和生长[22]。猪感染这种病毒后会引起繁殖障碍和呼吸系统疾病甚至死亡。其中,某去泛素化酶基因编码的蛋白产物能够在猪感染该病毒时特异性增多。经比对发现,该蛋白产物与鼠的USP18蛋白高度同源。USP18启动子存在单核苷酸多态性,其1533位等位基因A替换成G后其转录活性明显下降,致使USP18表达减少,PRRSV感染后症状相比于替换前更重。有趣的是,之前有文献报道USP18在人类细胞中可以负向调节信号转导及转录激活因子途径JAK-STAT信号转导通路,因此USP18也可能是I型干扰素抗病毒信号通路的抑制因子[23, 24],目前对此还没有明确的研究结果。
9 USP25 与抗病毒感染免疫USP25包含一个泛素结合区域(ubiquitin-associated domain)、两个可与泛素相互作用基序(ubiquitin-interaction motif)和两个肽酶区域,肽酶区域具有泛素水解酶活性[25]。USP25通过同时调控NF-κB和IRF3信号通路发挥抗病毒作用。以仙台病毒感染为例,仙台病毒含有病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns)结构,其遗传物质核酸可被模式识别受体所识别。在病原相关分子模式结构存在的情况下,模式识别受体激活信号通路,最终触发I型干扰素等抗病毒细胞因子的产生。RIG-I/MDA5识别胞浆内的病毒RNA后,与β干扰素启动刺激因子1(interferon-beta promoter stimulator 1,IPS1)的CARD结构结合,形成IPS1复合物。该复合物招募下游的TRAF2、TRAF3、TRAF6、TBK1和IKKα/β引起IRF3和NF-κB的活化,形成二聚体入核,诱导I型干扰素等抗病毒细胞因子的产生[26]。在这个过程中,TRAF2、TRAF6等K63位有多聚泛素链对于其活化IRF3和NF-κB是必需的。USP25通过下调IRF3和NF-κB亚基p65的磷酸化来负向调节β干扰素的表达;同时,USP25对RIG-I、TRAF2和TRAF6去泛素化,抑制IRF3和NF-κB的活化[27],从而负向调控该抗病毒过程。
10 病毒编码的USP分子Wang等[28]研究发现某些病毒例如单纯疱疹病毒I型也可编码USP,该USP可作为病毒被膜蛋白的组成部分。单纯疱疹病毒UL36基因编码的USP,即UL36USP,可作为其被膜蛋白UL36N端的一个结构发挥功能。当病毒入侵时,UL36USP可抑制病毒诱导的IRF3的二聚化、启动子的激活和β干扰素基因的转录。UL36USP的去泛素酶活性是抑制β干扰素产生的关键。其可通过去泛素化TRAF3,阻断下游的TBK1等募集,从而阻断β干扰素产生。除了UL36USP,还有一种与I型单纯疱疹病毒相关的USP,即单纯疱疹病毒相关的泛素特异性蛋白酶(herpes viral associated ubiquitin-specific protease,HAUSP)在腺病毒的复制中起着决定性作用。腺病毒感染的过程中,可通过两种蛋白E4ORF6和E1B-55K与细胞因子形成SCF(Skp1-Cul1-Fbox)样E3泛素连接酶复合物,促进p53、Mrell、DNA连接酶Ⅳ等的泛素化及依赖蛋白酶体的降解。HAUSP可与E1B-55K结合,在腺病毒感染时重新定位参与形成病毒复制中心,促进病毒的复制。干扰或抑制HAUSP基因后,腺病毒感染细胞时E1B-55K处于稳定状态的数量明显减少,且腺病毒的复制也减少[29, 30]。
11 结 语泛素化与去泛素化在生命过程中起着非常重要的作用,但人们对去泛素化的过程,特别是许多与去泛素化相关通路的机制及去泛素化在这些通路中的作用尚未确定。近年来,去泛素化酶家族中的USP家族越来越受到重视。USP家族可利用其去泛素化酶活性与多种信号分子相互作用,促进信号分子的去泛素化,调控信号转导通路,进而调控机体抗病毒感染免疫应答;一些病毒基因通过编码USP蛋白,从而躲避细胞的抗病毒免疫应答反应。但USP家族大多数成员作用并不十分明确,有待深入的研究。各种生物技术发展极大地促进了对USP家族的研究,相信研究USP家族在机体各种状态下的作用,尤其是在信号转导通路中的作用,更有利于了解机体正常的生理机制以及在病毒入侵时的病理机制,从而为研究感染性疾病的防治靶点提供新视角。
[1] | COLPITTS C C, LUPBERGER J, DOERIG C, et al. Host cell kinases and the hepatitis C virus life cycle[J]. Biochim Biophys Acta, 2015,1854(10 Pt B):1657-1662. |
[2] | LIU X, WANG Q, PAN Y, et al. Sensing and responding to cytosolic viruses invasions:an orchestra of kaleidoscopic ubiquitinations[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2015,26(3):379-387. |
[3] | REYES-TURCU F E, VENTII K H, WILKINSON K D. Regulation and cellular roles of ubiquitin-specific deubiquitinating enzymes[J]. Annu Rev Biochem, 2009,78:363-397. |
[4] | FRAILE J M, QUESADA V, RODRIGUEZ D, et al. Deubiquitinases in cancer:new functions and therapeutic options[J]. Oncogene, 2012,31(19):2373-2388. |
[5] | WU C J, CONZE D B, LI T, et al. Sensing of Lys 63-linked polyubiquitination by NEMO is a key event in NF-kappaB activation[J]. Nat Cell Biol, 2006,8(4):398-406. |
[6] | MUKHOPADHYAY D, RIEZMAN H. Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling[J]. Science, 2007,315(5809):201-205. |
[7] | WANG G, GAO Y, LI L, et al. K63-linked ubiquitination in kinase activation and cancer[J]. Front Oncol, 2012,2:5. |
[8] | ZHONG B, LIU X, WANG X, et al. Ubiquitin-specific protease 25 regulates TLR4-dependent innate immune responses through deubiquitination of the adaptor protein TRAF3[J]. Sci Signal, 2013,6(275):ra35. |
[9] | COLLERAN A, COLLINS P E, O'CARROLL C, et al. Deubiquitination of NF-kappaB by ubiquitin-specific protease-7 promotes transcription[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110(2):618-623. |
[10] | KAWAI T, AKIRA S. Toll-like receptor and RIG-I-like receptor signaling[J]. Ann N Y Acad Sci, 2008,1143:1-20. |
[11] | ZHANG L, ZHAO X, ZHANG M, et al. Ubiquitin-specific protease 2b negatively regulates IFN-production and antiviral activity by targeting TANK-binding kinase 1[J]. J Immunol, 2014,193(5):2230-2237. |
[12] | LANCINI C, VAN DEN BERK P C, VISSERS J H, et al. Tight regulation of ubiquitin-mediated DNA damage response by USP3 preserves the functional integrity of hematopoietic stem cells[J]. J Exp Med, 2014,211(9):1759-1777. |
[13] | LOO Y M, GALE M J. Immune signaling by RIG-I-like receptors[J]. Immunity, 2011,34(5):680-692. |
[14] | OSHIUMI H, MATSUMOTO M, HATAKEYAMA S, et al. Riplet/RNF135, a RING finger protein, ubiquitinates RIG-I to promote interferon-beta induction during the early phase of viral infection[J]. J Biol Chem, 2009,284(2):807-817. |
[15] | CUI J, SONG Y, LI Y, et al. USP3 inhibits type I interferon signaling by deubiquitinating RIG-I-like receptors[J]. Cell Res, 2014,24(4):400-416. |
[16] | ZHOU F, ZHANG X, VAN D H, et al.Ubiquitin-specific protease 4 mitigates Toll-like/interleukin-1 receptor signaling and regulates innate immune activation[J]. J Biol Chem, 2012,287(14):11002-11010. |
[17] | WANG L, ZHAO W, ZHANG M, et al. USP4 positively regulates RIG-I-mediated antiviral response through deubiquitination and stabilization of RIG-I[J]. J Virol, 2013,87(8):4507-4515. |
[18] | YEH H M, YU C Y, YANG H C, et al.Ubiquitin-specific protease 13 regulates IFN signaling by stabilizing STAT1[J]. J Immunol, 2013,191(6):3328-3336. |
[19] | PAULI E K, CHAN Y K, DAVIS M E, et al. The ubiquitin-specific protease USP15 promotes RIG-I-mediated antiviral signaling by deubiquitylating TRIM25[J]. Sci Signal, 2014,7(307):ra3. |
[20] | KATO H, TAKEUCHI O, SATO S, et al. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses[J]. Nature, 2006,441(7089):101-105. |
[21] | CHEN R, ZHANG L, ZHONG B, et al.The ubiquitin-specific protease 17 is involved in virus-triggered type I IFN signaling[J]. Cell Res, 2010,20(7):802-811. |
[22] | LI Y, SUN Y, XING F, et al. Identification of a single nucleotide promoter polymorphism regulating the transcription of ubiquitin specific protease 18 gene related to the resistance to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2014,162(3-4):65-71. |
[23] | MALAKHOV M P, MALAKHOVA O A, KIM K I, et al.UBP43(USP18) specifically removes ISG15 from conjugated proteins[J]. J Biol Chem, 2002,277(12):9976-9981. |
[24] | MALAKHOV M P, KIM K I, MALAKHOVA O A, et al. High-throughput immunoblotting. Ubiquitiin-like protein ISG15 modifies key regulators of signal transduction[J]. J Biol Chem, 2003,278(19):16608-16613. |
[25] | ZHONG B, LIU X, WANG X, et al. Negative regulation of IL-17-mediated signaling and inflammation by the ubiquitin-specific protease USP25[J]. Nat Immunol, 2012,13(11):1110-1117. |
[26] | REIKINE S, NGUYEN J B, MODIS Y. Pattern recognition and signaling mechanisms of RIG-I and MDA5[J]. Front Immunol, 2014,5:342. |
[27] | ZHONG H, WANG D, FANG L, et al. Ubiquitin-specific proteases 25 negatively regulates virus-induced type I interferon signaling[J]. PLoS One, 2013,8(11):e80976. |
[28] | WANG S, WANG K, LI J, et al.Herpes simplex virus 1 ubiquitin-specific protease UL36 inhibits beta interferon production by deubiquitinating TRAF3[J]. J Virol, 2013,87(21):11851-11860. |
[29] | CHING W, KOYUNCU E, SINGH S, et al. A ubiquitin-specific protease possesses a decisive role for adenovirus replication and oncogene-mediated transformation[J]. PLoS Pathog, 2013,9(3):e1003273. |
[30] | LIAO T L, WU C Y, SU W C, et al. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication[J]. EMBO J, 2010,29(22):3879-3890. |