2. 浙江大学医学院附属第一医院放射科, 浙江杭州 310003;
3. 浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科, 浙江杭州 310003
2. Department of Radiology, the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, China;
3. Division of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, Department of Surgery, the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, China
原发性肝癌(以下简称肝癌)是我国及某些亚非地区常见的癌症。我国每年新增肝癌患者约占全球新增肝癌患者的55%,肝癌诊治的形势仍十分严峻[1]。目前手术切除肝癌仍被认为是首选的治疗方法,但由于80%以上的肝癌患者伴有肝硬化,肝切除术应用受限[2]。系统性化疗可能对机体产生一些毒副作用,经导管肝动脉化疗栓塞(transcatheter hepatic arterial chemoembolization,TACE)成为目前临床上治疗肝癌的主要方法之一。然而,某些化疗栓塞剂混合物不仅对肝癌的抗肿瘤作用有限,而且对部分患者有剂量相关的毒副作用 [3]。三氧化二砷是一种传统的中药成分,其在急性早幼粒细胞性白血病和肝癌等疾病中的抗癌作用得到认可[4, 5]。直接经肝动脉输送三氧化二砷至肝癌病灶有可能最大程度增强抗癌疗效、减少毒副作用。因此,本研究拟建立兔VX2肝癌模型,并经肝动脉灌注三氧化二砷碘油乳化剂,通过观察肿瘤生长率和肿瘤微血管密度来评价TACE抗肿瘤疗效。
1 材料与方法 1.1 实验动物本实验经浙江大学医学院附属第一医院动物实验伦理委员会同意。所有实验兔的饲养和使用均按照动物实验指南进行。30只雄性新西兰大白兔作为实验兔,体质量为2.2~2.5 kg,由浙江省医学科学院实验动物中心提供。大腿携有VX2鳞状细胞癌的荷瘤兔由浙江大学医学院附属第二医院放射科张敏鸣教授惠赠。
1.2 主要设备、试剂及药物PHILIPS Brilliance 64 层螺旋CT(荷兰飞利浦投资有限公司);Medrad Stellant CT 211 高压注射器(美国Medrad公司);SIEMENS平板数字减影血管造影(DSA,德国西门子公司);TBA-200FR自动生化分析仪(日本东芝公司);优维显300 (广州先灵公司);含碘38%的超液化碘油(法国Guerbet 公司);注射用三氧化二砷(商品名纳维雅,北京双鹭药业有限公司);3 F微导管(美国COOK公司);WBZ-3222药物摇匀机(上海实贝仪器设备公司);鼠抗人CD34单克隆抗体(上海拜力生物有限公司)。
两种剂量的三氧化二砷及碘油0.2 mL均加入无菌0.9% 氯化钠溶液2 mL中混合,室温下置于药物摇匀机375×g离心3 min充分摇匀,制备好的乳化剂即刻用于肝动脉灌注。
1.3 实验兔VX2肝癌模型的建立肿瘤移植手术由同一组医师(1名外科副主任医师、1名放射科副主任医师及1名放射科主管技师)协作进行。将大腿携有VX2鳞状细胞癌的荷瘤兔腹腔注射10%水合氯醛2.5 mL/kg和安定2.5 mg/kg,进行全身麻醉,于无菌条件下剥离肿瘤,切取靠近包膜的灰白色鱼肉样肿瘤组织,剔除坏死组织及纤维组织,用眼科剪将肿瘤组织剪碎至体积约1~2 mm3大小的瘤块,置于盛有0.9%氯化钠溶液的无菌培养皿中备用。实验兔采用上述方法全身麻醉后,仰卧固定于手术台上,手术野常规剪毛,消毒铺巾,上腹正中长约2 cm切口,逐层切开腹壁各层,暴露肝脏,肝表面垫湿无菌纱布,用平镊将肝左外叶拉出体外,取肝组织较厚处,以无菌手术刀片作一长约3 mm的小切口,用眼科钳经切口在肝内潜行分离,形成一个3 mm×5 mm大小的腔隙,将一备用的瘤块植入其中,明胶海绵封闭肝脏切口,回纳肝脏至腹腔内,4号丝线逐层缝合腹壁切口各层,关闭腹腔。术后臀部肌肉注射4万U/kg青霉素,1次/d,连续3 d,以预防感染。
1.4 实验兔分组及TACE实施肿瘤种植3 周后在DSA下行TACE,TACE由同一名经验丰富的介入科副主任医师完成。30只肝癌模型兔根据肝动脉注射三氧化二砷的剂量不同分为大剂量组(碘油0.2 mL+三氧化二砷 5 mg/kg)、小剂量组(碘油0.2 mL+三氧化二砷 1 mg/kg )和对照组(碘油0.2 mL+0.9% 氯化钠溶液2 mL)。TACE具体操作步骤如下:肝癌模型兔全身麻醉后,取右侧腹股沟区长约1 cm切口,暴露右股动脉后,插入5F扩张器以代替动脉鞘,引入3F微导管并置管于腹腔干后造影,显示肝动脉的血管解剖结构及肿瘤供血动脉。超选择并置管于左肝动脉行诊断性造影,然后经3F微导管小心注射三氧化二砷碘油乳化剂,注射在DSA下进行以避免碘油乳化剂逆流,注射完毕后再向微导管内推注无菌0.9% 氯化钠溶液3 mL。术毕撤出微导管及扩张器,右侧股动脉结扎。30只肝癌模型兔中5只在TACE术中死亡,其中大剂量组2只,小剂量组1只,对照组2只,死亡原因均为术中操作不当致动脉破裂。25只肝癌模型兔成功完成整个实验过程,包括实施TACE及CT增强扫描。
1.5 CT扫描检测肝脏肿瘤体积和肿瘤生长率TACE术前1 d和术后28 d分别行螺旋CT增强扫描。应用PHILIPS Brilliance 64 层螺旋CT 对肝癌模型兔行全肝CT平扫和双期增强(动脉期及门静脉期)扫描。采用前述方法全身麻醉肝癌模型兔后,将其仰卧固定于木板上,以21 G 静脉穿刺针穿刺兔耳缘静脉,建立静脉通道。扎腹带以减少呼吸运动。先行肝脏CT平扫,再行全肝双期增强扫描。扫描条件:120 kV,50 mAs,矩阵1024×1024,层厚3 mm,螺距1.235,对比剂优维显300注射速度0.5 mL/s,总量5 mL,注射对比剂后10 s 和30 s 分别对应为肝动脉期扫描和门静脉期扫描。见图1。
获得肝肿瘤CT图像后,按如下公式计算肿瘤体积:肿瘤体积=L×S2/2(其中L代表肿瘤的最长径,S代表肿瘤的最短径)。根据肿瘤体积计算肿瘤生长率。肿瘤生长率=(V28/Vb-1)×100%。其中Vb和V28分别代表TACE术前1 d和术后28 d时的肿瘤体积。肿瘤生长率为正值表示肿瘤增大,负值表示肿瘤缩小。
1.6 免疫组织化学染色法检测肿瘤微血管密度TACE术后28 d将完成CT检查后的肝癌模型兔处安乐死,取出整个肝脏。参照CT图像,避开肿瘤内碘油沉积和坏死区域,尽量选取肿瘤内实性部分范围最大且有强化的对应层面取材作为病理标本。后者以10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋备用。以生物素—抗生物素复合技术(ABC法)行CD34肿瘤微血管免疫组织化学染色。在高倍镜(×200)视野下观察,任何被抗体染成棕色的单个细胞或细胞团,无论有否管腔,只要与周围的微血管、肿瘤组织及其他结缔组织有清楚的分界,均作为1条可被计数的肿瘤微血管。排除具有较厚的平滑肌或管腔直径超过8个红细胞直径的血管。200倍视野下记录5个视野内的微血管数作为该研究对象的微血管密度,单位为条/0.74 mm2。若200倍视野下计数困难,可在400倍视野下计数,最后结果加倍。
1.7 自动生化分析仪检测肝、肾功能指标肝癌模型兔分别在术前1 d、术后7 d和28 d采耳缘静脉血,通过自动生化分析仪测量血浆AST、ALT和血尿素氮、血肌酐水平。
1.8 统计学方法采用SPSS 18.0 统计软件作统计分析。实验数据先行正态性及方差齐性检验,偏态分布数据采用非参数秩和检验(Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis检验),结果以中位数和范围[M(Min~Max)]表示;正态分布且方差齐的数据采用单因素方差分析,结果以均数±标准差(x±s)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 三氧化二砷对肝癌模型兔肿瘤体积及肿瘤生长率的影响TACE术前1 d大剂量组、小剂量组和对照组肝癌模型兔的肿瘤体积分别为(4912.4±2704.0)mm3、(5482.5±3033.0)mm3和(4883.2±2936.0)mm3,各组间肿瘤体积差异无统计学意义(F=0.096,P=0.890)。
图1显示肝癌模型兔肿瘤经TACE治疗后,CT显示肿瘤周边富血管区域碘油存积,肿瘤中央坏死。计算术后28 d各组肝癌模型兔肿瘤体积及肿瘤生长率,结果显示共有5只兔的肿瘤生长率为负值,提示肿瘤有缩小,其中大剂量组3只(3/8),小剂量组2只(2/9),剩余20只兔的肿瘤生长率均为正值,提示肿瘤有不同程度增大。大剂量组、小剂量组的肿瘤生长率中位数分别为44.05%(-36.40%~64.60%)和95.20%(-11.60%~159.40%),均小于对照组[145.55%(98.90%~250.30%)],而且大剂量组小于小剂量组(均P<0.05)。见图2。
2.2 三氧化二砷对肝癌模型兔肿瘤微血管密度的影响肝癌模型兔肿瘤组织CD34免疫组织化学染色结果见图3。 大剂量组、小剂量组肿瘤微血管密度(21.4±10.6 与 34.1±12.0)均低于对照组(57.9±16.1),且大剂量组低于小剂量组(均P<0.05)。 提示与对照组比较,TACE后28 d大剂量组肿瘤微血管数量抑制最多,小剂量组次之。
2.3 三氧化二砷对肝癌模型兔肝肾毒性观察25只兔术后7 d、28 d 血ALT、AST及尿素氮、肌酐水平较术前1 d 均升高,但在各个时间点测得的三组间血尿素氮和肌酐的差异无统计学意义(均P>0.05);术前1 d及术后7 d 血ALT、AST水平三组间差异无统计学意义(均P>0.05)。但术后28 d大剂量组和小剂量组血ALT和AST水平均低于对照组( 均P<0.05),而大剂量组与小剂量组组间差别无统计学意义(P>0.05),见表1。
(±s) | |||||||
组 别 | n | ALT (U/L) | AST (U/L) | ||||
术前1 d | 术后7 d | 术后28 d | 术前1 d | 术后7 d | 术后28 d | ||
大剂量组 | 8 | 26.25±13.02 | 27.38±14.47 | 25.50±12.37* | 17.00±8.82 | 22.37±11.31 | 24.25±10.89* |
小剂量组 | 9 | 27.78±14.94 | 40.66±19.53 | 45.00±14.04* | 23.22±13.28 | 39.55±15.17 | 35.22±11.86* |
对照组 | 9 | 24.87±11.25 | 33.50±14.06 | 79.12±30.52 | 20.12±12.46 | 31.62±9.25 | 75.25±25.89 |
组 别 | n | 尿素 (mmol/L) | 肌酐 (μmol/L) | ||||
术前1 d | 术后7 d | 术后28 d | 术前1 d | 术后7 d | 术后28 d | ||
大剂量组 | 8 | 4.95±1.14 | 5.67±3.66 | 5.18±1.35 | 59.00±12.60 | 68.75±26.35 | 55.62±11.71 |
小剂量组 | 9 | 5.08±1.36 | 6.07±2.47 | 8.25±4.43 | 65.89±14.35 | 67.44±15.62 | 67.00±19.58 |
对照组 | 8 | 5.00±0.84 | 5.49±2.70 | 4.91±1.79 | 62.60±13.38 | 67.12±20.31 | 63.20±17.14 |
与对照组比较,*P<0.05. |
VX2肿瘤属于上皮来源的高度恶性的富血管肿瘤,与肝细胞肝癌的生物学行为相似,因此常被国内外学者作为肝癌的研究模型[6]。国内外许多离体和在体的研究已证实三氧化二砷对实体肿瘤具有明确的抑制作用,其机制可能与肿瘤细胞原浆毒性作用、诱导肿瘤细胞凋亡以及抑制肿瘤细胞端粒酶活性等有关[7, 8]。此外,Griffin等[9]发现,在甲基胆蒽诱导的纤维肉瘤中使用单剂量三氧化二砷可以明显诱导肿瘤组织内血管闭塞,导致肿瘤中央部分大面积坏死。 唐印华等[5]在裸鼠肝癌的实验研究中发现,三氧化二砷可以明显抑制肿瘤中血管内皮生长因子(VEGF)、环氧化酶-2(COX-2)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的表达。这些研究表明:三氧化二砷可通过下调VEGF而抑制肿瘤新生血管生成,从而抑制肝癌等富血管肿瘤的生长、转移和复发。本研究结果表明,虽然大剂量组、小剂量组和对照组在TACE术后28 d 肿瘤体积仍有增大,但大剂量组和小剂量组肿瘤生长率和肿瘤血管密度均小于对照组,表明肿瘤有生长速度趋缓的现象。相关研究报道多以血管生成相关基因为研究对象,间接反映肿瘤血管生成,而肿瘤血管测定技术是目前评价肿瘤血管生成的金标准,它直接反映肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移和血管构建水平,反映肿瘤生长的速度和转移的倾向[10],本研究结果证实了三氧化二砷碘油乳化剂对兔VX2肝移植瘤具有抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长的疗效。
在临床工作中,经肝动脉化疗栓塞剂混合物常包括阿霉素、表阿霉素、顺铂及丝裂霉素C等。然而,这些药物对部分患者常会产生剂量相关的副作用,包括心、肾毒性。高砚春等[11]发现三氧化二砷在人乳腺浸润性导管癌裸鼠模型中可抑制与新生血管和新生淋巴管相关的COX-2和VEGF-C基因和蛋白的表达,且COX-2和VEGF-C基因的阳性表达与三氧化二砷剂量呈负相关,表明三氧化二砷不仅具有抑制肿瘤血管和淋巴管生成的抗肿瘤特性,还具有抗肿瘤的时间和剂量依赖性,在一定剂量范围内药物浓度越高,用药时间越长,抗肿瘤效果越好。本研究发现,大剂量组肿瘤生长率和血管密度均小于小剂量组,证实了三氧化二砷抗肿瘤作用的剂量依赖性。但是,高浓度砷剂的系统性化疗可能产生一些副作用如体液潴留、神经损伤导致肌萎缩等,严重者甚至有直接致癌作用,因此它也是抗癌和致癌的双刃剑[12]。而直接经动脉输送三氧化二砷至肝癌组织有可能最大程度避免这些副作用,同时可增强抗癌疗效。本研究采用三氧化二砷碘油乳化剂,可使药物到达靶器官局部后在一定浓度下持续释放,明显增加了药物作用时间。本研究结果表明,经动脉直接灌注适当剂量的三氧化二砷碘油乳化剂在抑制肿瘤的生长、降低肿瘤的新生血管生成的同时,并没有增加荷瘤兔的肝肾毒性。相反,在TACE术后28 d 大剂量组和小剂量组血ALT和AST水平明显低于对照组,这说明肿瘤自身对肝功能损害更为直接和严重。由于三氧化二砷主要通过肾脏排泄,因此容易在肾脏内聚集而产生肾毒性。但在本研究中,TACE术后7 d 和 28 d 血尿素氮和肌酐水平在大剂量组、小剂量组和对照组间差异并无统计学意义,这表明使用5 mg/kg三氧化二砷剂量仍属于安全范围。
总之,本研究建立兔VX2肝癌模型,通过相关生物学参数证实了三氧化二砷能抑制肝癌组织生长、降低肿瘤新生血管的生成。而且,结合动脉插管技术和三氧化二砷碘油乳化剂的传输药物方式,可提高局部药物浓度、增加药物作用时间,在达到抗癌疗效的同时,并没有增加荷瘤兔的肝肾毒性。
[1] | LUK J M, LIU A M. Proteomics of hepatocellular carcinoma in Chinese patients[J]. OMICS, 2011,15(5):261-266. |
[2] | ZHOU Y, LEI X, WU L, et al. Outcomes of hepatectomy for noncirrhotic hepatocellular carcinoma:a systematic review[J]. Surg Oncol, 2014,23(4):236-242. |
[3] | GAO Z H, BAI D S, JIANG G Q, et al. Review of preoperative transarterial chemoembolization for resectable hepatocellular carcinoma[J]. World J Hepatol, 2015, 27,7(1):40-43. |
[4] | LAZO G, KANTARJIAN H, ESTEY E, et al. Use of arsenic trioxide(As2O3) in the treatment of patients with acute promyelocytic leukemia:the M. D. Anderson experience[J]. Cancer, 2003,97(9):2218-2224. |
[5] | 唐印华,梁 桃,尚国印,等. 三氧化二砷抑制裸鼠肝癌侵袭及转移的体内实验研究[J]. 哈尔滨医科大学学报, 2010,44(5):447-449. TANG Yin-hua, LIANG Tao, SHANG Guo-yin, et al. Inhibitory effect of As2O3 on invasion and metastasis of nude mice hepatoma cell in vivo[J]. Journal of Harbin Medical University, 2010,44(5):447-449.(in Chinese) |
[6] | ZHANG L, LIU F Y, FU J X, et al. Hepatic arterial administration of sorafenib and iodized oil effectively attenuates tumor growth and intrahepatic metastasis in rabbit VX2 hepatocellular carcinoma model[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(11):7775-7781. |
[7] | 孙晓娟,岳冬丽,倪渐凤,等. 三氧化二砷对乳癌细胞系MDA-MB-468雌激素受体表达的影响[J]. 郑州大学学报(医学版), 2012,47(2):191-193. SUN Xiao-juan, YUE Dong-li, NI Jian-feng, et al. Influence of estrogen receptor-α expression in breast cancer MDA-MB-468 cells after arsenic trioxide treatment[J]. Journal of Zhengzhou Univeristy(Medical Sciences), 2012,47(2):191-193.(in Chinese) |
[8] | YIN X B, WU L Q, FU H Q, et al. Inhibitory effect of humanized anti-VEGFR-2 ScFv-As2O3-stealth nanoparticles conjugate on growth of human hepatocellular carcinoma:in vitro and in vivo studies[J]. Asian Pac J Trop Med, 2014,7(5):337-343. |
[9] | GRIFFIN R J, LEE S H, ROOD K L, et al. Use of arsenic trioxide as an antivascular and thermosensitizing agent in solid tumors[J]. Neoplasia, 2000,2(6):555-560. |
[10] | IRVIN M W, ZIJLSTRA A, WIKSWO J P, et al. Techniques and assays for the study of angiogenesis[J]. Exp Biol Med(Maywood), 2014,239(11):1476-1488. |
[11] | 高砚春,幸天勇,吴诚义. As2O3抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤淋巴管生成相关基因表达的研究[J]. 现代肿瘤医学, 2010,18(9):1698-1701. GAO Yan-chun,XING Tian-yong,WU Cheng-yi. The role of arsenic trioxide on lymphangiogenesis of transplantation tumor model for humen breast infitrating ductal carcinoma in nude mice[J]. Journal of Modern Oncology, 2010,18(9):1698-1701.(in Chinese) |
[12] | REHMAN K, NARANMANDURA H. Double-edged effects of arsenic compounds:anticancer and carcinogenic effects[J]. Curr Drug Metab,2013,14(10):1029-1041. |