CD69是一种细胞表面活化标记抗原，是C型凝集素受体家族的成员，也是自然杀伤细胞信号传导基因复合体家族的一员。CD69几乎在所有髓系细胞中表达，除了在单核细胞、血小板等细胞中有持续结构性的表达，在大多数细胞中只在活化后的细胞表达。近年来研究显示，CD69的表达与许多免疫细胞的分化成熟均密切相关，它是辅助性T细胞(Th细胞)生发和成熟所必需的，CD69缺陷小鼠的CD4⁺ T细胞无法在骨髓中定位及分化^{[1, 2, 3]}。体外培养的嗜酸细胞加入CD69单克隆抗体可诱导细胞凋亡，并伴有抗凋亡信号Bcl-2表达的下降^[4]。由于CD69可广泛调节细胞活化、增殖与凋亡，因此在感染性疾病、炎症性疾病、肿瘤性疾病和自身免疫性疾病中起了重要作用^{[5, 6, 7]}。研制CD69转基因小鼠，对CD69在这些疾病的体内作用研究有着广泛的用途。本研究通过CD69和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecence protein，EGFP)在细胞内核糖体切入位点(internal ribosome entry site，IRES)构建pLCK-CD69-IRES-EGFP表达载体，采用显微注射方法制备CD69转基因小鼠，以期为CD69在炎症性疾病中作用机制的体内研究奠定基础。

Eco RI、Xho I、Apal I和Nco I限制性内切酶购自美国Promega公司；PCR试剂盒和随机引物试剂盒均购自日本Takara公司；DNA 纯化试剂盒购自德国Qiagen公司；细胞转染试剂Lipofectamin 2000购自美国Invitrogen公司，其他试剂均为国产分析纯；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自日本Takara公司。引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。流式细胞仪FACScan购自美国Blue Biotech公司。

C57BL/6J小鼠购自南京生物医药研究院实验动物中心；pInsulater-LCK-IRES-EGFP质粒由南京生物医药研究院实验动物中心提供；293T细胞株为本实验室保存。

C57BL/6J小鼠肺组织提取RNA，逆转录成为cDNA，经过PubMed搜索设计PCR引物，在上下游引物分别引入Eco RI限制性内切酶和Xho I限制性内切酶酶切位点，具体引物序列如下：上游引物:5′-TTGGCGGAATTCATGGATTCTGAAAACTGTTC-3′，下游引物: 5′-AAATATCTCGAGTCATCTGGAGGGCTTGCTGC-3′。应用高保真PCR法扩增小鼠CD69片断。反应条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，0 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸7 min。将PCR产物克隆到pGEM-Teasy载体并测序验证序列的正确性。上述DNA片段采用限制性内切酶Eco RI和Xho I酶切，并接入pInsulater-LCK-IRES-EGFP质粒中LCK启动子、IRES-EGFP元件间的Eco RI和Xho I位点之间，获得pInsulater-LCK Promoter-CD69-IRES-EGFP转基因质粒，经DNA测序验证其核苷酸的正确性后，再将其转染到293T细胞中，通过荧光显微镜观察其在293T细胞中的表达。

受精卵的获得、假孕鼠的制备和显微注射均按照常规方法^[8]。将转基因质粒通过I-CueI线性化，琼脂糖凝胶电泳回收8081 bp片段，以172 ng/μL片段浓度对受精卵进行显微注射，再将经基因注射的受精卵移入假孕母鼠体内。共移卵385枚，平均移植到 14只假孕母鼠子宫内，平均移卵数为每只受体鼠 27.5枚。

从出生后10～14 d的小鼠剪下约0.5 cm的尾尖置于1.5 mL离心管中，加入400 μL组织裂解缓冲液(0.5%SDS溶液，0.1 mol/L氯化钠溶液，0.05 mmol/L EDTA溶液，0.01 mmol/L Tris-盐酸缓冲液，100 μg/L蛋白酶K，pH值为 8.0)，50 ℃保温过夜，再按“分子克隆实验指南”制备基因组DNA^[9]。PCR检测分为2个反应体系，CD69上游引物1：5′-AGTACAACTACAACAGCCACAACG-3′，CD69下游引物1：5′-TAGGCAGAATCCAGATGCTCAA-3′；CD69上游引物2：5′-ACTAACAAAGATGCCTGTGGC-3′，CD69下游引物2：5′-AGCTATTATTAAGGACGTGATGAG-3′。PCR扩增后进行电泳分析。

取小鼠外周血做血涂片直接在荧光显微镜下观察EGFP阳性细胞；留取外周血0.5 mL，冰蒸馏水溶血破坏红细胞后加入淋巴细胞分离液，450 ×g，离心20 min，沉淀加入100 μL PBS中，并以封闭抗体Fc 2 μL 4 ℃孵育10 min，冲洗2次，再加入100 μL PBS和2 μL罗丹明(rhodamine)标记的CD69抗体4 ℃孵育30 min，然后应用流式细胞仪测定EGFP阳性细胞CD69的荧光表达。

观察转基因小鼠体质量、毛发、生长发育、行为学上的异常，评估体内各脏器功能、组织病理学改变，并检测外周血淋巴细胞数目的改变。

构建的CD69转基因载体含有淋巴细胞特异性的启动子LCK、核糖体切入位点IRES、荧光标签EGFP，载体构建如图1。载体构建完成后以Apal I和Nco I酶切验证载体的构建(图2)，并对其中的不同元件进行测序验证。Apal I酶切图得到4个片段，分别5845 bp、3168 bp、1246 bp和497 bp；Nco I酶切图得到4个片段，分别6531 bp、2424 bp、1144 bp和657 bp。

I-CEU-？(8511/430)：酶切位点；pUC origin:质粒pUC的复制序列(一段DNA序列)，引导双链DNA复制过程；Ampicillin：氨苄抗性基因；Insulator:绝缘子，保护基因片段的完整性；LCK promoter:启动子；Kozak:基因启动转录结合位点；CD69：外源基因；IRES：内部核糖体切入位点，可招募核糖体对mRNA进行翻译，将IRES与外源cDNA融合，能独立地起始反应；EGFP；绿色荧光基因序列，用于标记CD69；polyA是多聚尾巴，终止转录，保护mRNA稳定． 图1 pInsulater-LCK-CD69-IRES-EGFP-polyA转基因表达载体的构建 Fig.1 Construction of transgenic expression vector pInsulater-LCK-CD69-IRES-EGFP-polyA

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M：DNA marker，数据表示每一条标记条带代表的分子量；1：Apal I酶切组；2：Nco I酶切组． 图2 pLCK-CD69-IRES-EGFP酶切琼脂糖凝胶电泳图 Fig.2 Agarose gel electrophoresis of pLCK-CD69-IRES-EGFP amplification products and their restriction enzyme digests

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293T细胞转染重组质粒 pInsulater-LCK-CD69-IRES-EGFP 48 h后，在荧光倒置显微镜下观察可见有大量细胞发射绿色荧光，未转染的293T细胞即空白对照组无绿色荧光，见图3。

293T细胞成功转染EGFP后CD69-EGFP细胞可见大量绿色荧光，而空白对照组没有.标尺=100 μm． 图3 CD69-EGFP转基因载体的荧光表达 Fig.3 Fluorescence expression of transgenic vector CD69-EGFP

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385枚可用受精卵中存活325枚，存活率84.4%。上述受精卵植入至14只假孕母鼠体内，12只受孕，产小鼠105只，存活99只，存活率94.3%。取小鼠尾尖用CD62上游引物2和下游引物2进行PCR鉴定，结果显示16只小鼠为纯合阳性首建鼠(小鼠编号为1、3、6、8、23、25、27、29、32、34、36、43、44、65、66、95)，CD69两个引物反应体系PCR产物电泳后在415 bp处呈现阳性条带，为CD69转基因小鼠。鉴定结果见图4。

琼脂糖凝胶电泳鉴定纯合阳性首建鼠的结果.P:阳性对照；B6：野生型小鼠DNA作为阴性对照；N：生理盐水对照；DL：标记条带，依次标记为2000、1000、750、500、250、100 bp． 图4 仔鼠基因组DNA PCR产物电泳分析 Fig.4 Electrophoretic analysis of the PCR products of the genome DNA in pups

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荧光显微镜观察野生型小鼠外周血及转基因小鼠外周血涂片，野生型小鼠外周血中未见荧光细胞，而转基因小鼠外周血中可见大量EGFP阳性的荧光细胞(图5)。流式细胞术测定可见CD69转基因小鼠外周血中绝大部分EGFP阳性细胞的荧光表达增强，几何平均荧光强度为23.2±0.98，与野生型小鼠差异有统计学意义(P<0.05)。

野生型小鼠未见荧光细胞，CD69转基因小鼠可见大量EGFP阳性荧光细胞.标尺=100 μm． 图5 转基因小鼠和野生型小鼠外周血涂片的荧光表达 Fig.5 Fluorescence expression of peripheral blood of transgenic mice

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CD69转基因小鼠在体质量、毛发、生长发育、行为学上与野生型小鼠无明显差异。外周血细胞计数结果显示，CD69转基因小鼠外周血白细胞计数[2.42±0.30)×10⁶/L]和淋巴细胞计数[(1.51±0.13)×10⁶/L]均少于野生小鼠[(3.72±0.41)×10⁶/L和(2.08±0.18)×10⁶)/L]，差异有统计学意义(均P<0.05)。见图6。

与野生型小鼠比较，*P<0.05． 图6CD69转基因小鼠和野生型小鼠外周血白细胞和淋巴细胞计数比较 Fig.6 White blood cells and lymphocyte counting in peripheral blood of CD69 transgenic mice and wild type mice

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有关CD69转基因的动物模型国内外鲜有研究。仅有的两个研究是将CD69与人CD2启动子和增强子连接或人的生长激素基因连接，这样CD69的表达不可避免地会受这些基因的影响^{[10, 11]}。本研究的载体构建中，减少插入的片段，单纯研究CD69基因的功能，减少其他基因对CD69的影响。其中，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，LCK)是非受体蛋白酪氨酸激酶肉瘤基因(sarcoma gene，Src)家族的成员之一，特异性地在T淋巴细胞中表达，并且在T淋巴细胞的活化及发育过程中发挥着重要作用。人和小鼠LCK蛋白mRNA的转录起始于两个独立的启动子：近端启动子和远端启动子，可产生两种不同的mRNA，实验显示LCK近端启动子胸腺淋巴细胞的发育至关重要^[12]。LCK近端启动子与CD69的连接可以使外源性CD69特异性表达于T细胞中。EGFP是绿色荧光蛋白的突变体，含有一个更适合于在人类细胞中表达的开放阅读框，EGFP mRNA的翻译效率更高，蛋白表达更强，产生的荧光远远强于野生型绿色荧光蛋白，更适合检测细胞中的EGFP和EGFP融合蛋白的表达^[13]。IRES允许核糖体直接在此序列处结合mRNA并起始翻译，但其翻译过程是独立的，在双顺反子载体中，置于IRES下游的外源基因的表达效率是上游帽启动翻译基因的20%～50%^[14]。因此，在我们所构建的双元载体中，我们将报告基因置于IRES的下游，这样有助于保证目的基因的表达效率。

制备CD69转基因小鼠可以更好地研究CD69的生物学功能。CD69基因编码的是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，细胞外区有特征性的钙离子依赖性糖基识别区域。CD69通常以同源二聚体形式存在，每条链细胞外区有一个位于第166个氨基酸位置的N端连接的糖基化位点，提示糖基化链的遗传异质性，但此遗传异质性的结构和功能的重要意义尚不清楚。CD69在细胞表面表达均为磷酸化形式^[15]，这对其与其他细胞表面的蛋白分子连接很重要。已知CD69在细胞生物学功能中起着重要的信号传导作用，生物化学和生物功能试验显示CD69细胞内的尾部可与Jak3/Stat5信号通路相连^[16]；并通过调节组织局部转化生长因子β的水平对免疫反应进行负调节^[17]。本研究制备的CD69转基因小鼠在各个系统的发育上未见异常，行为学上亦无明显改变。可见CD69不会影响机体的生长发育。但CD69转基因小鼠外周血白细胞、淋巴细胞减少，这与国外的研究结果一致^{[18, 19]}，提示CD69在淋巴细胞的发育成熟中有重要作用。

总之，本研究制备的淋巴细胞中特异性表达CD69的转基因小鼠模型可为我们在整体水平研究人类相关的炎症性疾病的发病机制提供可行的动物模型。