类风湿关节炎是一种慢性、多关节性、系统性的自身免疫病，全世界患病率为0.5%～1.0%，我国约为0.5%^{[1, 2]}。类风湿关节炎的发病机制仍然不明确。研究表明成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)激活是类风湿关节炎发生的中心事件，在类风湿关节炎病理机制中起关键作用^[3]。禹州漏芦(Echinps Latifolius Tausch)为华东蓝刺头的干燥根，含蓝刺头碱、噻吩类化合物等成分，小剂量禹州漏芦对动物中枢系统表现出兴奋作用，大剂量则导致痉挛，并且表现为血压下降、血管扩张、心收缩力增强等心血管系统作用^{[4, 5]}。禹州漏芦总黄酮(flavonoids of Echinps Latifolius Tausch，FELT)是禹州漏芦的主要有效成分，本研究采用完全弗氏佐剂制备佐剂性关节炎大鼠作为类风湿关节炎模型，采用大鼠关节炎评分法和足爪肿胀评分法评价FELT对类风湿关节炎模型大鼠的治疗作用，并检测FELT对大鼠滑膜组织中纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP3)表达的影响，及对FLS中促凋亡基因Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3)和Bcl-2基因表达的影响，以探索FELT治疗大鼠类风湿关节炎的分子病理机制。

逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司；QuantiFast^® SYBR^® Green PCR试剂盒购自德国Qiagen公司；Bax、caspase 3、Bcl-2基因、FN、MMP3定量PCR引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司。完全弗氏佐剂购自美国Sigma公司。

FELT由安徽科技学院药学系药物化学实验室研制。取安徽滁州产禹州漏芦干燥根，清洗烘干粉碎，过40目筛，得漏芦粉末。采用3倍量95%乙醇在圆底烧瓶中加热微沸状态下回流提取2 h，然后减压浓缩，水溶解浓缩物后得水溶液，并调pH值至2.0。等量乙醚萃取后有机相精制浓缩，水相经大孔树脂吸附后解吸附，两者混合后浓缩为FELT浸膏粉，以芦丁为对照品，检测FELT含量>80%。FELT浸膏粉经适量蒸馏水溶解后得FELT混悬剂。

SD雄性大鼠(体质量180～200 g)购自安徽医科大学实验动物中心，实验大鼠随机分为正常对照组、空白对照组和FELT 50 mg/kg组、100 mg/kg组、150 mg/kg组，每组10只。适应性饲养7 d后，空白对照组采用完全弗氏佐剂于每只大鼠右后足趾皮内注射0.1 mL致炎的方法制备，正常对照组大鼠右后足趾皮内注射0.1 mL磷酸盐缓冲液。类风湿关节炎大鼠模型制备第6天始各FELT治疗大鼠进行FELT混悬剂灌胃治疗，每日1次，造模后第28天股动脉放血处死大鼠。

类风湿关节炎模型大鼠关节炎评分对象包括大鼠的2只耳朵、1只鼻子、1条尾巴和4只足爪共8个评分对象，每个评分对象出现结节和红肿记1分，无结节和红肿记0分，最高评分8分。类风湿关节炎大鼠足爪肿胀评分对象包括5只指关节或趾关节，一只腕关节或踝关节，共24个评分对象。每个评分对象出现结节和红肿记1分，无结节和红肿记0分，每只大鼠的足爪肿胀评分最高评分是24分^[6]。

大鼠股动脉放血处死后立即分离大鼠膝关节滑膜组织，在超净台内使用无钙离子、镁离子的D-Hanks液漂洗滑膜组织块3次，小剪刀将组织块剪成1～2 mm大小3块。玻璃吸管将组织块均匀铺在细胞培养瓶底壁，瓶底朝上在37℃、5%二氧化碳条件下培养7 h，然后翻正细胞培养瓶继续培养。3 d后待FLS长出组织块后，去除组织块，继续培养至FLS覆盖瓶底约90%，胰酶消化1 min后传代培养。实验用细胞为3～5代FLS。

参照Fermentas试剂盒提供的方法，采用Trizol试剂提取各组关节滑膜组织和FLS中的总RNA，逆转录得到cDNA；采用实时定量PCR检测FN、MMP3 mRNA在各组大鼠关节滑膜组织中表达，并检测Bax、caspase 3、Bcl-2 mRNA在各组大鼠FLS中的表达。定量PCR扩增反应条件为：94 ℃，15 s；60 ℃，30 s，72 ℃，30 s，共40个循环。以内参β-actin mRNA表达量作为参照，采用公式2^-ΔΔCt计算目的基因mRNA的相对表达量，其中ΔCt=Ct_目的基因-Ct_对照基因。定量PCR引物序列见表1。

数据分析采用SPSS 17.0软件，所有数据结果均以 ±s表示。数据服从正态分布，组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

与正常对照组比较，空白对照组大鼠的关节炎评分和足爪肿胀评分均明显增加(均P＜0.05)，提示类风湿关节炎大鼠造模成功；与空白对照相比，各治疗组的关节炎评分和足爪肿胀评分均显著减少(均P＜0.05)，见表2、表3和图1。提示FELT对类风湿关节炎模型大鼠有一定的治疗作用。

表2 各组大鼠关节炎评分比较 Table 2 Rat arthritis score in all groups

(±s，n=10)
组别	第16天	第20天	第24天	第28天	第32天
正常对照组	0.5±0.5	0.6±0.5	0.5±0.6	0.6±0.5	0.7±0.5
空白对照组	3.9±1.0*	4.0±0.9*	4.1±0.7*	4.4±0.8*	4.1±0.7*
FELT 50 mg/kg组	2.7±0.7#	3.0±0.8#	3.0±0.6#	3.1±0.7#	2.8±0.7#
FELT 100 mg/kg组	2.5±0.8#	2.5±0.7#	2.9±0.7#	2.9±0.8#	2.8±0.8#
FELT 150 mg/kg组	2.3±0.9#	2.3±0.5#	2.8±0.4#	2.7±0.6#	2.6±0.4#
与正常对照组比较，*P＜0.05；与空白对照组比较，#P＜0.05．

表选项

表3 各组大鼠足爪肿胀评分比较 Table 3 Rat paw swelling scores in all groups

(±s，n=10)
组别	第16天	第20天	第24天	第28天	第32天
正常对照组	0.3±0.5	0.5±0.4	0.4±0.5	0.4±0.4	0.5±0.4
空白对照组	4.4±0.9*	4.9±0.7*	6.2±0.7*	7.1±0.7*	6.7±0.6*
FELT 50 mg/kg组	3.3±0.7#	3.6±0.7#	4.1±0.7#	5.1±0.8#	4.5±0.6#
FELT 100 mg/kg组	3.0±0.8#	3.2±0.7#	3.8±0.7#	4.6±0.6#	4.1±0.6#
FELT 150 mg/kg组	2.9±0.7#	3.2±0.8#	3.7±0.6#	4.6±0.7#	4.0±0.8#
与正常对照组比较，*P＜0.05；与空白对照组比较，#P＜0.05．

表选项

与正常对照组比较，*P< 0.05；与空白对照组比较，#P< 0.05. n=10． 图1 不同剂量FELT对类风湿关节炎模型大鼠关节炎和足爪肿胀的治疗作用 Fig.1 The therapeutic effects of different dose FELT

图选项

与正常对照组比较，FN、MMP3在类风湿关节炎模型大鼠关节滑膜组织中表达显著升高；与空白对照组相比，FN、MMP3在FELT 50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg 3个剂量治疗组关节滑膜组织中表达均显著降低，见图2。提示FELT对类风湿关节炎大鼠滑膜组织中FN、MMP3的表达具有一定的抑制作用。

与正常对照组比较，*P < 0.05；与空白对照组比较，﹟P < 0.05. n=10． 图2 各组大鼠关节滑膜组织中FN、MMP3 mRNA的表达比较 Fig.2 The expression of FN and MMP3 in each group was detected by real time qPCR

图选项

与正常对照组比较，空白对照组FLS中促凋亡基因Bax、caspase 3表达减弱，抗凋亡基因Bcl-2表达增强；与空白对照组比较，FELT 50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg 3个剂量治疗组FLS中Bax、caspase 3表达均增强，Bcl-2表达均减弱，见图3。提示FELT有促进FLS凋亡的作用。

与正常对照组比较，*P< 0.05；与空白对照组比较，﹟P< 0.05. n=10． 图3 各组大鼠FLS中Bax、caspase 3、Bcl-2 mRNA表达比较 Fig.3 The expression of Bax，caspase 3 and Bcl-2 gene in each group was detected by real time qPCR

图选项

大鼠佐剂性关节炎是一种以细胞免疫功能紊乱为主的免疫性炎症模型，其小关节症状、多关节病变、关节畸形表现及组织形态学变化与人类风湿关节炎非常相似，因此完全弗氏佐剂制备的佐剂性关节炎大鼠是研究类风湿关节炎的理想动物模型^[6]。本文采用佐剂性关节炎大鼠作为类风湿关节炎模型大鼠，采用大鼠关节炎评分和足爪肿胀评分评价FELT对类风湿关节炎模型大鼠的治疗作用。结果表明，各治疗组的关节炎评分和足爪肿胀评分较空白对照组显著降低，即FELT对类风湿关节炎模型大鼠具有一定的治疗作用。FN能促进异常增生滑膜与软骨表面的粘附，促进FLS增殖；MMP3是基质金属蛋白酶，其过表达促进细胞外基质降解，促进关节软骨侵蚀^[7]。选取FELT 50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg 3个剂量灌胃来研究FELT对类风湿关节炎模型大鼠关节滑膜组织中FN和MMP3表达的影响，结果发现3个剂量的FELT都能抑制类风湿关节炎模型大鼠关节滑膜组织中FN和MMP3的表达。

关节滑膜中FLS活化增殖在类风湿关节炎病理机制中起关键作用。激活的FLS可分泌炎症趋化因子，募集中性粒细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞进入病态的滑膜组织，参加类风湿关节炎的发生和发展^{[8, 9, 10]}。因此，本文以FLS为研究对象，探讨FELT灌胃治疗对类风湿关节炎模型大鼠FLS凋亡的影响，探讨FELT对类风湿关节炎病理机制的影响。本研究发现，类风湿关节炎模型大鼠FLS中促凋亡基因Bax和caspase 3表达明显下降，抗凋亡基因Bcl-2表达明显上升，提示在类风湿关节炎模型大鼠发病机制中FLS正常细胞凋亡可能受到了抑制，导致FLS异常增殖，异常增殖的FLS进一步促进了类风湿关节炎病理的发展。本文还研究了FELT对类风湿关节炎模型大鼠FLS凋亡的影响，结果发现，与类风湿关节炎模型大鼠相比，FELT 50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg 3个剂量灌胃类风湿关节炎模型大鼠后FLS中Bax、caspase 3 表达均明显上升，Bcl-2表达明显下降，提示FELT对类风湿关节炎模型大鼠FLS凋亡具有促进作用，通过促进模型大鼠FLS凋亡起到抑制FLS异常增殖、抑制类风湿关节炎病理发展的作用。

本研究提示了FELT对类风湿关节炎的治疗作用，本课题组将进一步分离纯化FELT中的单体，研究各单体成分抗类风湿关节炎的效果，推动FELT及其有效单体进入类风湿关节炎临床治疗阶段，为类风湿关节炎疾病的防治提供新的思路和方法。