猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻、脱水等为主要特征，多发于秋冬季节，主要感染哺乳仔猪，其中7日龄以下的哺乳仔猪死亡率最高^[1]。1978年，英国、比利时首次发现该病^[2]。近年来，PEDV在包括中国、韩国、日本等国家在内的亚洲地区广泛流行^[3-5]，给养猪业带来巨大经济损失。PEDV在浙江省的临床检出率由2010年的42.86%提高到了2013年的70%以上^[6]。

PEDV是套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）的成员，为有囊膜的、不分节段的、单股正链RNA病毒，其基因组全长约28 kb，包括5′端非编码区、3′端非编码区及至少7个开放阅读框（open reading frame, ORF）^[7-8]。其中5个开放阅读框编码主要的结构蛋白，包括纤突（spike, S）蛋白、ORF3、小膜（envelope, E）蛋白、膜（membrane, M）蛋白、核衣壳（nucleocapsid, N）蛋白^[9]。PEDV的S蛋白是主要的结构蛋白，属于Ⅰ型膜蛋白，含有主要的抗原决定簇，约由1 383个氨基酸组成，与其他冠状病毒属成员的S蛋白结构相似，包含3个结构域：较长的胞外结构域、跨膜结构域及较短的胞内结构域。根据其他冠状病毒S蛋白保守的基序，可以将PEDV的S蛋白分为S1区（第1~789位氨基酸）和S2区（第790~1 383位氨基酸）^[10]。研究表明，PEDV的S蛋白对被感染宿主中和抗体的产生、特异性受体的结合及细胞膜融合方面具有重要的生物学意义，S1可识别受体，S2负责病毒囊膜与宿主细胞膜融合^[11]。S蛋白中的4个中和表位区（499~638、748~ 755、764~771和1 368~1 374）均已被鉴别^[12-14]。由于受到宿主免疫选择的压力，S蛋白易发生变异，因此，S蛋白对于了解PEDV的流行现状、分子多样性、基因突变的联系及疫苗的研发也有很重要的作用。

为了解现阶段PEDV流行毒株的分子演化特征，本研究采集了2013年4月到2017年4月间浙江省及周边地区仔猪腹泻样品，对引起腹泻的主要病原进行了检测分析，同时对其中16株临床分离PEDV毒株的S基因进行了克隆和分子特征分析。研究结果丰富了PEDV分子流行病学资料，同时为疫病准确诊断和有效防控提供了基础数据。

1 材料与方法 1.1 病料采集和处理

采集浙江省及周边24个地区共282份病料，对其进行PEDV等病原的检测。在小肠组织及粪便样品中加入适量灭菌的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）并研磨，置于-80 ℃冰箱中反复冻融2次，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，取上清液。将上清液经0.45 μm滤膜过滤后，保存于-80 ℃冰箱中，备用。

1.2 主要试剂

总RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；MMLV购自美国Promega公司；pMD18- T载体、RNA酶抑制剂（HPRI）、dNTP、随机引物、限制性内切酶、DNA分子质量标志物（DL2000、DL5000）等均购自日本TaKaRa公司；琼脂糖购自美国Sigma公司；胶回收试剂盒购自杭州新景生物试剂开发公司。

1.3 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）引物设计

参考GenBank中公布的PEDV、猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV）、猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus, PDCoV）和轮状病毒A型（porcine group A rotavirus, GARV）全基因序列，利用Geneious 7.1.7软件设计病原检测和S基因克隆所用引物（表 1），其中用3个重叠套式PCR扩增S基因全长。引物均由上海华大基因科技股份有限公司合成。

1.4 病毒RNA的抽提和反转录

取-80 ℃保存备用的病料上清液，按总RNA提取试剂盒的操作说明书提取病毒总RNA，核酸经NanoDrop 1000分光光度计检测，质量浓度为1 800~ 2 500 ng/μL，D（260 nm）:D（280 nm）=1.95~2.05，保存于-80 ℃冰箱中。

反转录步骤简述如下：1 μg总RNA与1 μL随机引物混匀，用去核酸酶水定容至10 μL，混匀后适当离心，65 ℃温浴5 min后，立即放入冰水中冰浴5 min，适当离心后，加入8 μL 5×RT缓冲液、4 μL 2.5 mmol/L dNTP、0.5 μL RNA酶抑制剂、0.5 μL MMLV反转录酶，用去核酸酶水定容至40 μL，充分混匀后，在42 ℃条件下作用1 h，95 ℃灭活10 min，获得的cDNA保存于-20 ℃冰箱中，备用。

1.5 检测病原的反应体系和条件

对PEDV、PDCoV和TGEV均采用一步法TaqMan探针检测，按LightCycler^® multiplex RNA virus master试剂盒（购自上海罗氏有限公司）说明书进行反应。反应体系为：RT-PCR反应混合物4.0 μL，PEDV-RTF/RTR或TGEV-F/T或PDCoV-RTF/ RTR各0.4 μ L，PEDV-RTP或TGEV-Probe或PDCoV-RTP 0.1 μL，反转录酶缓冲液0.1 μL，RNA模板5.0 μL，ddH₂O 5.0 μL。反应条件为：50 ℃反转录10 min；95 ℃变性30 s；95 ℃扩增5 s，60 ℃扩增40 s，30个循环。扩增循环阈值（C_T）小于30为阳性，30~35为可疑，大于35为阴性。

对GARV进行RT-PCR检测，反应体系简述如下：2×Easy Taq mix酶10.0 μL，GARV-VP6-F1/R1各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，ddH₂O 7.0 μL。反应条件为：95 ℃变性5 min；95 ℃扩增30 s，55 ℃扩增30 s，72 ℃扩增40 s，30个循环；72 ℃延伸1 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，预期片段大小为309 bp。

1.6 PEDV的S基因PCR扩增

第1轮PCR扩增体系：cDNA模板2.0 μL，10×缓冲液5.0 μL，10 μmol/L PEDV-gp1-F1/R1或PEDV-S-F3/R3或PEDV-S-F5/R5上下游引物各1.0 μL（表 1），10 mmol/L dNTP 2.0 μL，PrimerSTAR DNA聚合酶0.5 μL，ddH₂O 39.5 μL。第2轮PCR扩增体系：模板（第1轮PCR产物）2.0 μL，10 μmol/L PEDV-gp1-F2/R2或PEDV-S-F4/R4或PEDV-SF6/R6上下游引物（表 1）各1.0 μL，其他试剂与剂量同第1轮PCR反应。

2轮反应条件均为：98 ℃变性2 min；98 ℃扩增10 s，58 ℃扩增50 s，72 ℃扩增3 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.7 PEDV的S基因克隆、测序和拼接

对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收获得目的片段，将纯化产物直接送至上海华大基因科技股份有限公司测序。采用DNAStar软件中的SeqMan进行序列拼接。

1.8 序列分析

采用DNAStar软件中的MegAlign及DNAman软件对获得的16份PEDV阳性样品和我国其他地区的分离株、国外分离株及PEDV疫苗株CV777等（附表 1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2017.06.231）的S基因进行核苷酸及氨基酸序列同源性分析；采用MEGA 5.0中的邻接法（neighbor-joining, NJ）进行系统发育分析^[15]。使用SignalP 4.0软件对PEDV的S蛋白信号肽进行预测^[16]。使用在线软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）进行糖基化位点分析，采用DNAStar软件中的Protean分析抗原指数。

2 结果与分析 2.1 浙江省及周边地区生猪腹泻物中主要病原检测

对浙江省及周边24个地区的282份病料进行PEDV、GARV、TGEV及PDCoV等病原的检测，结果（表 2）显示：PEDV、GARV及PDCoV的检出率分别为64.89%（183/282）、0.35%（1/282）和4.25%（12/ 282），而未检出TGEV；PEDV在11月1日至次年4月1日的检出率为74%，其余时间段的检出率为26%（数据未列出）。

2.2 PEDV的S基因克隆和序列分析

选取其中16份PEDV阳性样品（包括2013年的4份、2014年的4份、2015年的3份、2016年的3份和2017年的2份），进行S基因克隆和测序。除ZJ13SX1101和YN170101样本扩增获得的S基因全长为4 158 bp，编码1 386个氨基酸外，其他14株S基因的全长均为4 161 bp，编码1 387个氨基酸（图 1）。与经典毒株CV777（JN599150.1）S蛋白相比，16份PEDV阳性样品的S蛋白存在突变，分别为₂₇QSTI₃₀→SANT、₅₆MN₅₇→GE、₆₂S→N、₆₄S→T、₆₈GGIETD₇₄→AGQHPT、₈₄Y→H、₈₆DS₈₇→RG、₈₉Q→ H、₁₂₀I→T、₁₃₁N→I、₁₂₀I→T、₁₅₀S→F、₁₅₉D→S、₁₆₁KNI₁₆₃→ EHS、₁₇₈A→S、₁₇₈A→S、₁₈₅I→F、₁₉₆R→K、₂₁₀T→E、₂₂₇Y→S、₂₂₉E→Q、₂₃₇S→I、₂₄₆DS₂₄₇→EP、₂₈₇W→L、₃₂₈F→ S、₃₆₇VTE₃₆₉→GAT、₃₈₂K→N、₄₄₂V→I、₆₃₇Q→E、₇₂₈N→S、₇₆₈L→S、₇₇₈M→T、₈₁₀V→A、₉₇₇H→Y、_{1 048}S→A、_{1 055}I→ V、_{1 171}D→A、_{1 177}GD_{1 178}→DE、_{1 204}L→F、_{1 302}R→Q、_{1 363}G→C；插入⁵⁸KQGV⁶¹、¹⁴⁰N（除ZJ13SX1101外）；缺失¹⁶⁰G；这些突变、插入或缺失主要集中在S1蛋白片段（21~790 aa）。在PEDV疫苗株CV777的S蛋白已鉴别的4个中和表位（COE：499~638；SS2：748-755；SS6：764~771和2C10：1 368~1 374）中，所获阳性样品在其中有2个中和表位（SS2：748~ 755和2C10:1 368~1 374）与疫苗株序列完全一致。具体见附图 1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2017.06.231。

2.3 PEDV的S蛋白分子演化分析

与疫苗毒株CV777、SM98和DR13相比，16份阳性样品的核苷酸同源性为93.6%~95.2%，氨基酸的同源性为92.4%~94.9%（表 3）。以PEDV的S蛋白进行分子演化分析表明：PEDV可分成3个群，疫苗株（包括CV777、SM98和DR13）均位于Ⅱa亚群，2012年后的大部分PEDV临床分离株均位于Ⅲ群，但其中分别有1株2014年韩国分离株（KM403158.1）、1株2014年越南分离株（KP455320）和1株2015年比利时分离株（KR003452）位于Ⅱb亚群；分离株也不存在地理分布的差异性（图 2）。

2.4 PEDV的S蛋白糖基化位点分析

16份PEDV阳性样品、CV777（JN599150.1，1994，中国）和CV777（AF353511.1，2001，瑞士）的S基因潜在的“Asn-X-Ser/Thr”（X为除Pro外的任何氨基酸）和Asn的N-连接糖基化位点分析如图 3所示。结果表明：在这18个序列中，糖基化位点的数量分别为28个或29个，其中，ZJ13LY1201、ZJ13XS0401、ZJ14NB0301、ZJ14YY1201、ZJ14SY1201、ZJ15JH0101、ZJ15XS0101、ZJ16XS1201、ZJ16ZJ1201的阳性样品及疫苗株CV777（JN599150.1，1994，中国）含有28个潜在的N-糖基化位点，但是流行株与疫苗株潜在糖基化位点的位置存在一定的差异；其余阳性样品及疫苗株CV777（AF353511.1，2001，瑞士）均存在29个潜在的N-糖基化位点，且存在的潜在N-糖基化位点都一样。16份阳性样品与疫苗株CV777（JN599150.1，1994，中国）相比，形成了3个新的N-糖基化位点，分别为第58位的S→N、第116位的I→ T、第1 193位的T→N；另外，第232位的S→I氨基酸突变则破坏了1个疫苗株原有的N-糖基化位点。

3 讨论

本研究收集了浙江省及周边24个地区共282份病料，并对其进行了PEDV、GARV、PDCoV和TGEV等病原的检测，其中PEDV的检出率达到64.89%（183/282），感染率较高，但大部分猪场都使用了TGEV-PEDV二联疫苗（基于CV777），说明疫苗不能为现有的流行毒株提供有效的免疫保护。因此，对PEDV流行毒株的主要抗原基因的分子流行动态进行监测，在预防和控制猪流行性腹泻中具有重要的意义。

与猪传染性胃肠炎流行的特征类似，猪流行性腹泻的发生也呈现一定的季节性。浙江省及周边地区PEDV检出率在11月到次年4月期间比其余时间段高出48%。这可能是由于浙江省及周边地区在这一时间段内天气比较寒冷、昼夜温差较大。研究表明，冠状病毒在低温条件下比暴露于高热或阳光条件下更稳定^[17]，因此，寒冷的天气可能有利于PEDV的存活。

猪流行性腹泻病毒的S蛋白被认为具有较高的遗传变异性^[18]，不仅免疫原性良好^[19-20]，而且在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中起着重要作用^{[12, 21]}。针对S基因全长进行的遗传变异分析，可将PEDV分为3个群^[5]。对临床分离毒株及疫苗株的S基因进行分析发现，疫苗株均位于Ⅱa亚群，而2012年以后的大部分PEDV分离株均位于Ⅲ群，包括本次获得的16份PEDV阳性样品，这些浙江及周边地区的阳性样品与中国常用疫苗株CV777、2010年韩国疫苗株SM98、2009和2011年韩国疫苗株强弱毒株DR13亲缘关系较远。PEDV新的变异株也无明显的地理分布差异，这也部分解释了基于CV777或SM98等经典毒株的现有疫苗不能很好地控制当前PEDV变异株的流行。至于S基因的变异是否能导致PEDV毒力增强，还有待于进一步研究。S蛋白为Ⅰ型跨膜糖蛋白，富含N-糖基化修饰位点。尽管流行株与中国常用的PEDV CV777疫苗株大部分预测的糖基化位点一致，但流行株由于突变产生了3个新的N-糖基化位点并破坏了1个糖基化位点。流行毒株与CV777（JN599150.1，1994，中国）疫苗毒株之间N-糖基化位点的变化是否会影响病毒本身的致病性及抗原性，值得进一步探究。

4 结论

综上所述，PEDV是当前引起仔猪腹泻的主要病原，且在冬季的发生率远远高于其他季节，呈现一定的季节性。虽然迄今为止PEDV只有1个血清型，但是不同毒株之间基因差异较大^[22-24]。对浙江省及周边地区的16份PEDV阳性样品及参考株S基因的分析表明，目前在我国广泛流行的PEDV毒株与以往的毒株相比已经发生了较为明显的变异，这可能也是免疫失败的重要原因。因此，防控猪流行性腹泻需要注意季节的波动，也需要加快流行株疫苗的开发。