中华蜜蜂（Apis cerana cerana）简称中蜂，是中国境内东方蜜蜂（Apis cerana）的总称，广泛分布于除新疆以外的全国各地，特别是南方的丘陵、山区^[1]。中蜂善于采集零星蜜源，抗逆能力强，适合山区定地饲养，在我国具有悠久的饲养历史，其传粉作用对形成我国独特的植被体系、保证植物繁衍生息和维护生态平衡均起着重要作用。19世纪末西方蜜蜂开始引入我国，中蜂在种间竞争中处于劣势，加之自然生态环境的破坏，我国中蜂数量锐减^[2]。2006年，中蜂被列入《国家级畜禽遗传资源保护名录》。

丽水位于浙江省西南部，以山区为主，森林覆盖率达到80.8%，具有多样性的气候与植被，被誉为“中国生态第一市”。丽水市中蜂养殖历史悠久，各个区县均有分布。近年来，基于生态优势，丽水市政府加大了对中蜂资源的保护与利用，同时将中蜂养殖作为山区农民脱贫增收的重要产业，中蜂数量明显增加，2016年丽水市被授予“中国蜜蜂之乡”。

遗传多样性研究是中蜂有效保护与合理利用的基础。目前，我国中蜂可划分为北方中蜂、华南中蜂、华中中蜂、云贵高原中蜂、长白山中蜂、海南中蜂、阿坝中蜂、滇南中蜂和西藏中蜂等9个类型^[1]。由于蜜蜂是社会性昆虫，同一个蜂群中的所有工蜂具有相同的母系，因而近年来线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）在中蜂的遗传多样性研究中得到了大量应用^[3]。姜玉锁等^[4]利用mtDNA分析发现我国境内不同地理型中蜂存在着较明显的遗传分化。周姝婧等^[5]、YIN等^[6]和谷瑛等^[7]利用mtDNA分别对福建、云南、重庆的中蜂进行了遗传多样性分析，均发现遗传分化不明显。赵东绪等^[8]通过对浙江省中蜂的形态特征进行研究发现其变异丰富。曹联飞等^[9]利用微卫星标记对浙江省中蜂的遗传多样性进行了初步研究，发现其遗传多样性较低。本研究基于目前应用较多的mtDNA tRNA^leu~COⅡ序列对丽水地区中蜂进行遗传多样性分析，旨在为丽水地区中蜂资源的保护和合理开发利用提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 样本采集

2015—2016年在丽水市9个区县各随机选择3个蜂场，每个蜂场采集5群中华蜜蜂。蜂场的蜂群来源主要为野生收捕，饲养方式主要为无框桶养，以尽可能保证采集的蜂群来自于本地群体。每群随机取几十只工蜂，放入无水乙醇中，置于－20 ℃冰箱保存备用。考虑到有的区县采样蜂场距离较近，按照每个乡镇5群左右选取实验样本，最终样本数量为94群。

1.2 实验方法 1.2.1 基因组DNA提取

取无水乙醇浸泡保存的蜜蜂样本，每群取1只，剪取蜜蜂胸部肌肉，按照细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP1201（北京百泰克生物技术有限公司）的说明和步骤提取蜜蜂总DNA。

1.2.2 mtDNA tRNA^leu~COⅡ序列扩增与测序

使用引物E2:5'-GGCAGAATAAGTGCATTG-3'和H2:5'-CAATATCATTGATGACC-3' ^[10]进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增。PCR反应体系（40 μL）：10×缓冲液4 μL，25 mmol/L MgCl₂ 4 μL，10 mmol/L dNTP 4 μL，10 nmol/L引物各1.6 μL，DNA模板3 μL，Taq酶0.5 μL，用ddH₂O补至40 μL。PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。

1.2.3 数据分析

使用DNAStar 5.0和Clustal X 1.81^[11]分别进行序列拼接和比对。利用MEGA 6.0^[12]输出碱基组成、变异位点、简约信息位点以及进行聚类分析等。利用DnaSP 5.0^[13]进行单倍型分析。

2 结果与分析 2.1 序列扩增结果

94个中蜂样本经扩增后均获得长度接近500 bp的条带（图 1），与目的片段大小一致。

2.2 序列碱基组成及变异情况

对94条序列进行比对发现，截除两端引物序列后，绝大部分序列长度为414 bp，另外6条序列由于缺失1个碱基为413 bp，1条序列由于4个碱基重复为418 bp。以414 bp序列为标准，1~18 bp为tRNA^leu基因部分序列，19~107 bp为非编码区序列，108~414 bp为COⅡ部分序列。4个碱基重复和1个碱基缺失均发生在非编码区。所有序列的A+T含量平均为84.5%。

序列分析结果显示共有16个变异位点，其中7个在非编码区，9个在COⅡ编码区。16个变异位点均为碱基转换，其中A/G有9个，T/C有7个。变异位点包括9个简约信息位点和7个单一多态位点。根据序列变异共获得20个单倍型，分别命名为LS1~20，各个单倍型的序列变异位点如表 1所示。

2.3 群体多样性分析

丽水中蜂平均核苷酸差异数k为1.452，平均核苷酸多样度（Pi）为0.003 52，平均单倍型多样度（Hd）为0.772±0.036。

20个单倍型在丽水中蜂中的分布情况如表 2所示。统计发现：单倍型LS1出现在39个样本中，占总样本数的41.5%；单倍型LS2出现在9个样本中，占总样本数的9.6%；单倍型LS3出现在15个样本中，占总样本数的16.0%；单倍型LS4和LS5分别出现在5个样本中，分别占总样本数的5.3%；单倍型LS6和LS20分别出现在3个样本中，分别占总样本数的3.2%；单倍型LS10和LS15分别出现在2个样本中，分别占总样本数的2.1%；其余单倍型的样本数均为1个。

统计各个区县的单倍型分布发现，缙云、松阳、龙泉、景宁、庆元等地的单倍型类型较多且在样本中的分布较为均匀。在缙云11个样本中共发现5个单倍型，大多分布于2~3个样本中。在景宁6个样本中共发现5个单倍型，分布于1~2个样本中。

2.4 单倍型聚类分析

利用邻接法（neighbor-joining, NJ）对20个单倍型进行聚类分析，得到5个支持率较高的分支（图 2）。其中：单倍型LS2和LS4聚为一支，结合单倍型在样本中的分布，主要来源于松阳；单倍型LS5和LS8聚为一支，主要来源于相邻的莲都和青田；单倍型LS10和LS20聚为一支，主要来源于庆元；单倍型LS6和LS15聚为一支，主要来源于缙云和景宁；单倍型LS13和LS17聚为一支，主要来源于相邻的龙泉和松阳。

2.5 与已有报道序列比对

将发现的主要单倍型序列与NCBI数据库中已报道的序列进行比对。结果显示：单倍型LS1序列与姜玉锁等^[4]报道的广州序列以及周姝婧等^[5]报道的福建主体单倍型Acmt01001相同；单倍型LS2序列与周姝婧等^[5]报道的福建单倍型Acmt01002相同；单倍型LS3序列与周姝婧等^[5]报道的福建单倍型Acmt01018相同；单倍型LS4、LS5、LS6、LS10序列在NCBI中也均有报道；而单倍型LS15和LS20尚未见报道（新申请的NCBI登录号分别为KY964596和KY964597）。

3 讨论

中蜂是我国的本土蜂种，在长期的自然选择过程中，各地中蜂对当地的生态环境产生了极强的适应性，形成了许多不同的类型^[1]。近年来，国家非常重视中蜂的遗传资源保护工作，针对不同类型的中蜂建立了多个保种场和保护区。遗传多样性分析是进行中蜂保护和利用的基础，对本地中蜂的选育提高以及新品系培育具有重要的参考意义。本文采用在蜜蜂研究中最为常用的mtDNA tRNA^leu~COⅡ序列对丽水地区中蜂进行遗传多样性分析，对该地区中蜂的保护和利用具有重要意义。

研究结果显示，94群丽水中蜂共存在20个单倍型，平均核苷酸多样度（Pi）为0.003 52，平均单倍型多样度（Hd）为0.772。周姝婧等^[5]利用相同基因序列分析了福建省中蜂的遗传多样性，其中与丽水相邻的福建政和采样点的样本量为50个，得到的平均核苷酸多样度（Pi）为0.001 79，平均单倍型多样度（Hd）为0.509。说明丽水中蜂的遗传多样性高于福建政和。与国内其他地区相比^[6-7]，丽水中蜂的平均核苷酸多样度或平均单倍型多样度也相对较高，这可能与丽水较好的生态条件和多样性的气候及植被有关。

单倍型分析发现，单倍型LS1占总样本数的41.5%，为丽水中蜂的主体单倍型。这一单倍型与姜玉锁等^[4]报道的广州序列以及周姝婧等^[5]报道的福建主体单倍型相同，而福建主体单倍型占福建总样本数的59.9%。目前，以地理分布和形态指标为主要依据，中蜂可分为9大类型，其中广东、福建、浙江（除西部外）均属于华南中蜂类型。本研究结果支持丽水中蜂划为华南中蜂类型。值得注意的是，除了主体单倍型LS1，单倍型LS3占丽水中蜂总样本数的比例最大，为16.0%，且在丽水9个区县中的7个区县均有发现。虽然这个单倍型在周姝婧等^[5]报道的福建中蜂中也有发现，但是它的出现频率却只有0.71%。此外，单倍型LS15和LS20目前尚未见报道，而这2个单倍型在丽水各自采样地的样本中也有较高的比例。因此，综合以上结果，本研究认为丽水中蜂虽然属于华南中蜂类型，但是也具有自己独特的遗传背景。这可能与丽水中蜂在本地的适应性进化有关。

聚类分析结果显示，大部分分支内的单倍型主要来源于一个区县或者相邻的区县，单倍型的划分与地理分布有较大关系，说明丽水多山环境的地理隔离、多样性的气候与植被可能促进了地区间中蜂的分化。此外，另一个分支的单倍型却主要来源于距离较远的缙云和景宁，推测可能与近年来交通便利化带来的远距离蜂群引进有关，同时这也可能是缙云中蜂单倍型较多的一个形成因素。龙泉、景宁等地中蜂的单倍型较多则可能与其地理隔离条件较好有关。

近年来，我国许多地区对本地中蜂的遗传多样性进行了相关研究，为各地中蜂的保护和利用提供了宝贵数据。浙江以山地和丘陵为主，生态环境较好，中蜂饲养历史悠久，近年来浙江丽水等地大力发展中蜂养殖，全省中蜂数量增加迅速。尤其值得注意的是，依据目前中蜂类型的划分标准，浙江大部分地区被划为华南中蜂类型，而浙江西部被划为华中中蜂类型。然而，目前关于浙江中蜂遗传多样性的相关研究却鲜有报道，因此，建议加强相关研究工作。

4 结论

浙江省丽水市中华蜜蜂遗传多样性较高，属于我国中蜂9大类型中的华南中蜂类型。由于较好的生态条件和多样性的气候与植被，丽水市中蜂具有独特的遗传背景。丽水市中蜂单倍型的形成可能与多山环境的地理隔离有较大关系。因此，丽水市中蜂具有较大的保种和育种价值。