蛋鸡具有体温高、代谢旺盛、被覆羽毛及无汗腺等生理特点, 对高温环境的耐受能力较低, 很容易引起热应激。在我国南方地区, 由于夏季长、气温高, 致使蛋鸡呼吸增强, 导致CO₂过量排出使血液pH升高；同时，免疫器官萎缩, 内分泌失调, 造成蛋鸡免疫功能下降, 卵泡发育迟缓, 最终导致蛋鸡在高温下易病、产蛋减少, 鸡蛋品质下降, 严重的甚至造成蛋鸡的死亡^[1]。近年的研究发现, 蛋鸡热应激现象伴随蛋鸡的自由基平衡破坏^[2], 解决蛋鸡热应激问题可以从缓解蛋鸡高温时氧化应激入手。

艾叶 (Artemisia argyi) 是我国传统的中药材, 已有2000多年历史^[3]。一般认为艾叶有特殊香味, 具有驱虫抗菌、解热镇静、安胎止血等功效^[4], 尤以能够驱蚊而为大家熟知。近年来, 艾叶提取物的抗炎^[5]及抗氧化^[6]活性也格外受到关注。艾叶在我国各地均有分布, 在我国大部分农村并不缺乏, 且能够人工栽培, 原料来源较广^[4]。艾叶作为禽类饲料添加剂亦有一些基础研究^[7], 但尚无艾叶用于热应激期间蛋鸡饲料添加剂的报道。艾叶在动物饲料方面的安全性已有实验证实, 我国长期以来的使用历史也为其安全性提供了保障^[7]。因此, 本研究通过分析艾叶的抗氧化成分和测定其体外抗氧化能力, 研究艾叶对热应激条件下海兰褐蛋鸡产蛋性能和蛋品质、血清抗氧化能力的影响, 旨在探讨艾叶作为饲料添加剂缓解蛋鸡热应激的效果及提高鸡蛋品质的可能性, 以降低热应激对蛋鸡的危害。

试验所用艾叶购自江西樟树中药材市场, 为干燥叶片, 经粉碎后过20目筛网, 在干燥环境中保存。

采用38周龄产蛋率为 (91±1)%，体质量接近 (2 148±108) g的健康海兰褐蛋鸡720只, 随机分为6组, 每组6个重复, 每重复20只, 分别为常温对照组, 高温对照组, 常温艾叶组, 高温低艾叶组, 高温中艾叶组, 高温高艾叶组。常温和高温对照组饲喂基础饲粮, 常温艾叶组在基础饲粮中添加3.0%艾叶粉, 高温艾叶组分别在基础饲粮中添加1.0%、2.0%、3.0%艾叶粉。通过湿帘降温、暖风炉升温的方式控制温度。常温对照组饲养在 (25±2) ℃环境中, 高温热应激组采用SONG等^[8]的方法, 将蛋鸡置于循环热应激环境中, 每日9:00—18:00为 (33±2) ℃高温时间, 19:00—8:00为 (22±2) ℃常温时间, 18:00—19:00和8:00—9:00调节温度逐渐改变。采用自然光照辅以早晚人工光照的照明方式, 每日恒定光照时间为16 h。预试期为7 d, 正试期21 d。

基础饲粮参照我国行业标准NY/T33—2004鸡营养需要配制而成, 基础饲粮组成及营养水平见表 1。蛋鸡采取3层阶梯式笼养, 各组随机分层饲养, 自由采食及饮水, 正常打扫及免疫。

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平 (风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

表1 基础饲粮组成及营养水平 (风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) 原料 Ingredient/% 含量 Content 营养水平 Nutrient level2) 含量 Content 玉米 Corn 63.80 代谢能 Metabolizable energy /(MJ/kg) 11.25 豆粕 Soybean meal 21.90 粗蛋白质 Crude protein/% 16.11 氯化钠 NaCl 0.30 蛋氨酸 Methionine/% 0.37 磷酸氢钙 CaHPO4 1.11 赖氨酸 Lysine/% 0.83 石粉 Limestone 9.84 钙 Ca/% 3.93 玉米蛋白粉 Corn gluten meal 1.60 总磷 Total phosphorus/% 0.69 豆油 Soybean oil 0.20 有效磷 Available phosphorus/% 0.40 小麦麸 Wheat bran 0.25 预混料 Premix1) 1.00 合计 Total 100.00 1) 预混料为每千克饲粮提供:VA 1 500 IU, VD3 200 IU, VE 10 IU, VK 0.50 mg, VB12 0.01 mg, 生物素0.15 mg, 胆碱500 mg, 叶酸0.55 mg, 烟酸30 mg, 泛酸10 mg, 吡哆醇3.50 mg, 核黄素3.60 mg, 硫胺素1.80 mg, Cu 8 mg, I 0.35 mg, Fe 80 mg, Mn 60 mg, Se 0.30 mg, Zn 80 mg; 2) 营养水平为计算值。 1) The premix provides the following per kg of diet: VA 1 500 IU, VD3 200 IU, VE 10 IU, VK 0.50 mg, VB12 0.01 mg, biotin 0.15 mg, choline 500 mg, folic acid 0.55 mg, nicotinic acid 30 mg, pantothenic acid 10 mg, pyridoxine 3.50 mg, riboflavin 3.60 mg, thiamine 1.80 mg, Cu 8 mg, I 0.35 mg, Fe 80 mg, Mn 60 mg, Se 0.30 mg, Zn 80 mg。2) Nutrient levels are calculated values.

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分别于试验开始的第0、7、14、21天, 每次重复随机选取3只蛋鸡, 翅静脉采血, 3 000 r/min离心5 min分离血清, -20 ℃保存待测血清抗氧化和应激指标。鸡蛋每日每重复随机抽取1枚, 4 ℃保存, 试验结束后进行蛋品质测定。

艾叶提取物体的制备参考龚珍林等^[9]的方案, 抗氧化成分总黄酮采用硝酸铝比色法测定, 总多酚含量采用福林酚法测定, 维生素C含量采用2, 4-二硝基苯肼法测定^[10]。艾叶提取物的羟基自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力及DPPH自由基清除能力等抗氧化性能均采用CAI等^[11]的方法进行, 所用试剂均为分析纯, 购自阿拉丁试剂公司。

每天8：00定时收蛋, 以重复为单位记录产蛋数及产蛋质量、回收余料并称量。计算全期的平均蛋质量、平均日采食量、产蛋率、料蛋比等生产性能指标。

蛋鸡血清超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 活性采用黄嘌呤氧化酶法, 谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase, GSH-Px) 采用还原型谷胱甘肽消化法, 丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 含量采用硫代巴比妥酸法检测, 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所, 按照说明书提示测定。

蛋鸡血清皮质醇含量采用ELISA方法检测, 试剂盒购自上海源叶生物有限公司, 按照说明书提示测定。

蛋白质高度、哈氏单位、蛋黄色泽采用多功能蛋品测定仪测定; 胆固醇含量采用硫磷铁试剂法测定^[12]。

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，所有数据均采用平均值±标准误。采用One-Way ANOVA进行方差分析, Duncan法进行多重比较, P < 0.05为差异显著。

艾叶中抗氧化成分总黄酮含量为87.78 mg/g, 总多酚含量为126.57 mg/g (以没食子酸计), 维生素C含量为3.12 mg/g。艾叶水提物对羟基自由基，超氧阴离子自由基和DPPH自由基的半数有效量分别为356.86 μg/mL、76.84 μg/mL和293.67 μg/mL, 其清除能力见图 1。

图1(Figure 1)

图1 艾叶提取物对超氧阴离子自由基、DPPH自由基和羟基自由基的清除能力 Fig. 1 Superoxide anion radical, DPPH radical and hydroxyl radical scavenging ability of A. argyi extracts

由表 2可知, 常温对照组产蛋率显著高于热应激组 (P < 0.05), 中、高剂量艾叶添加组的蛋鸡产蛋率显著高于热应激对照组, 但低于常温对照组; 常温对照组的平均蛋质量显著高于热应激对照组 (P < 0.05), 但与各艾叶添加组均无显著差异 (P>0.05);热应激显著降低蛋鸡的采食量 (P < 0.05), 但添加艾叶对热应激蛋鸡采食量没有显著影响 (P>0.05)。本研究中高温对照组料蛋比最高, 中剂量艾叶添加组及常温对照组均显著低于高温对照组 (P < 0.05), 提示艾叶可以降低高温应激下鸡蛋生产的料蛋比。

表2(Table 2)

表2 艾叶对蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of A. argyi on production performance in laying hens

表2 艾叶对蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of A. argyi on production performance in laying hens 组别 Group 产蛋率 Laying rate/% m(蛋) Egg mass/g 平均日采食量 Average daily feed intake/(g/d) 料蛋比 Feed/egg 常温对照组 Normal temperature control 91.03±0.34a 58.34±0.78a 108.23±2.13a 2.03±0.12d 高温对照组 High temperature stress 75.23±1.24d 56.97±0.85b 71.05±2.32b 2.49±0.09a 常温艾叶组 Normal temperature with 3% A. argyi 91.04±0.98a 57.98±0.88ab 108.35±3.14a 2.05±0.15d 高温低艾叶组 High temperature with 1% A. argyi 79.74±0.89c 57.45±0.75ab 70.81±1.89b 2.32±0.18b 高温中艾叶组 High temperature with 2% A. argyi 82.84±1.02b 57.96±0.89ab 70.75±1.78b 2.21±0.04c 高温高艾叶组 High temperature with 3% A. argyi 83.98±1.12b 57.56±1.05ab 70.77±2.41b 2.20±0.11c 同列数据后的不同小写字母表示在P < 0.05水平差异有统计学意义。 Values within a column followed by different lowercase letters show significant differences at the 0.05 probability level.

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由图 2A可知, 高温会导致蛋鸡血清SOD活力降低。添加中、高剂量艾叶能显著升高蛋鸡血清SOD活力 (与高温对照组比较, P < 0.05), 但差异不显著, 而低剂量艾叶对蛋鸡血清SOD活力的影响也不显著。由图 2B可知, 热应激能影响蛋鸡血清GSH-Px活力, 尤其是在热应激14 d后, 蛋鸡血清GSH-Px活力显著下降, 添加中、高剂量艾叶能显著提高蛋鸡血清GSH-Px活力 (P < 0.05), 但在试验第7天和第21天时, 各试验组血清GSH-Px活力差异不显著。图 2C显示高温应激会导致血清MDA含量急剧上升, 在本研究中, 高温处理14 d时蛋鸡血清MDA含量达到最高, 在热应激14 d后, 添加中、高剂量艾叶均能显著降低蛋鸡血清MDA含量 (P < 0.05)。图 4D显示, 高温应激使蛋鸡血清皮质醇浓度显著升高, 在热应激14 d时, 高、中、低剂量艾叶添加组皮质醇含量均显著低于高温对照组, 在第7天和第21天时，高剂量艾叶添加组皮质醇含量均显著低于高温对照组 (P < 0.05)。

图2(Figure 2)

*表示与高温对照组相比在P < 0.05水平差异有统计学意义。 Single asterisk (*) indicate statistically significant difference from the high temperature stress at the 0.05 probability level. 图2 艾叶对热应激条件下蛋鸡血清抗氧化指标及应激指标的影响 Fig. 2 Effect of A. argyi on antioxidant index in laying hens under heat stress

由表 3可知, 热应激及艾叶对蛋鸡蛋白质高度及哈氏单位均无显著影响, 但高温下鸡蛋的哈氏单位略低于常温对照组。添加艾叶会使鸡蛋蛋黄颜色偏深, 且随添加量的增加, 蛋黄颜色加深。添加艾叶能显著降低鸡蛋中蛋黄胆固醇含量 (P < 0.05), 但本试验的高、中、低添加组间无显著差异。高温对鸡蛋蛋黄颜色、胆固醇含量无影响。

表3(Table 3)

表3 艾叶对蛋鸡鸡蛋品质及胆固醇含量的影响 Table 3 Effects of A. argyi on egg quality and cholesterol content in laying hens

表3 艾叶对蛋鸡鸡蛋品质及胆固醇含量的影响 Table 3 Effects of A. argyi on egg quality and cholesterol content in laying hens 组别 Group 蛋白质高度 Albumen height/mm 哈氏单位 Haugh unit 蛋黄颜色 Yolk color w(胆固醇) Cholesterol/(mg/g) 常温对照组 Normal temperature control 7.98±0.08 83.56±0.12 9.02±0.32c 15.91±0.47a 高温对照组 High temperature stress 7.89±0.12 82.01±0.56 9.24±0.46c 16.10±0.08a 常温艾叶组 Normal temperature with 3% A. argyi 7.95±0.06 83.87±0.78 10.87±0.73a 15.03±0.13b 高温低艾叶组 High temperature with 1% A. argyi 7.94±0.10 82.14±0.21 10.18±0.28b 15.31±0.33b 高温中艾叶组 High temperature with 2% A. argyi 8.01±0.06 82.45±0.57 10.50±0.85ab 15.25±0.38b 高温高艾叶组 High temperature with 3% A. argyi 7.98±0.05 83.01±0.78 10.79±0.83a 15.14±0.55b 同列数据后的不同小写字母表示在P < 0.05水平差异有统计学意义。 Values within a column followed by different lowercase letters show significant differences at the 0.05 probability level.

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本研究表明, 与常温对照组相比, 在常温条件下添加艾叶对蛋鸡的采食量无影响, 提示采用艾叶作为鸡饲料添加不会引起适口性问题, 在热应激条件下, 在蛋鸡饲粮中添加艾叶, 对采食量没有改善作用。与常温对照组相比, 常温高剂量艾叶组加深蛋黄颜色、降低胆固醇含量, 而其余检测指标差异均不显著, 提示在蛋鸡日粮中添加艾叶不会对蛋鸡产生不良影响, 并能一定程度改善蛋品质。艾叶中黄酮含量较高, 本研究采用水提法浸提, 测得总黄酮含量为 (87.78±2.32) mg/g, 较袁慧慧等^[13]采用乙醇浸提得到的含量略低, 可能与提取工艺有关, 其黄酮含量与绿茶 (86.11~99.39 mg/g) 相当^[14], 属于较高水平。图 1显示艾叶水提物对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基均有较好的抑制作用, 与LAN等^[15]采用2次热水浸提所得产物的试验结果相似, 但抑制率较LAN等^[15]的略低。本研究显示艾叶抑制超氧阴离子自由基的作用尤为显著。超氧阴离子产自细胞线粒体呼吸链中, 是生物体内自由基最根本的产生形式, 其他自由基通常由超氧阴离子自由基转换而来^[16]。艾叶提取物对超氧阴离子良好的清除作用提示其可能在体内能够较好的抑制自由基产生。

SOD和GSH-Px均是重要的抗氧化酶, 本研究表明, 热应激会导致SOD和GSH-Px活力的下降, 其中对SOD活力的影响尤为显著。抗氧化酶活力的降低会造成机体自由基清除能力的下降, 并造成机体的氧化损伤。MDA是脂质过氧化的中间产物, MDA含量升高表明机体已受到氧化损伤^[17]。皮质醇常常被用作评价应激的重要指标^[16]。本研究证实了蛋鸡热应激中伴随了氧化损伤, 艾叶添加能显著缓解蛋鸡氧化应激效应, 降低蛋鸡应激水平。

蛋鸡的产蛋率和料蛋比是反映生产效益的重要指标, 在高温应激时往往伴随着产蛋率的下降^[18], 下降率因应激方式和蛋鸡品种而有不同：MASHALY等^[19]的研究显示, 高温导致的蛋鸡产蛋率下降甚至可高达28.8%;而料蛋比则反映了蛋鸡的饲料报酬。本研究发现, 海兰褐蛋鸡在持续循环高温的作用下, 产蛋率可降低17.36%, 料蛋比上升0.46, 造成严重经济损失。而饲料中补充艾叶后, 产蛋率较高温对照组提高了5.99%~11.63%, 料蛋比下降了6.83%~11.65%, 低剂量添加与中、高剂量间有显著差异, 但中、高剂量间差异不显著。提示高温应激时, 在蛋鸡饲料中添加2.0%艾叶能够显著提高蛋鸡产蛋率, 降低料蛋比。

蛋黄颜色是衡量禽蛋品质重要的感官指标, 有研究发现, 深色的鸡蛋对人脑血管疾病有一定的预防和辅助治疗作用, 出口鸡蛋则要求蛋黄颜色达到罗氏比色单位八级或以上^[20]。本研究发现, 艾叶组的鸡蛋蛋黄颜色较对照组深, 而与是否受到高温应激无关, 提示艾叶中某些成分可诱使蛋黄色泽加深, 可能与艾叶中类胡萝卜素含量有关^[20], 但尚需进一步实验证实。蛋黄中胆固醇含量与健康息息相关, 高胆固醇膳食是导致动脉粥样硬化的主要因素。齐广海等^[21]的研究表明, 黄酮类成分能够降低鸡蛋胆固醇含量。因此推测艾叶中高含量的黄酮是导致饲喂艾叶组蛋黄胆固醇含量显著低于对照组的原因之一。

艾叶多酚及黄酮含量较高, 其水提取物抑制羟基自由基, 超氧阴离子自由基及DPPH自由基的半数有效剂量分别为356.86 μg/mL、76.84 μg/mL、293.67 μg/mL, 其提取物有良好的体外自由基清除能力。在高温应激条件下蛋鸡饲料中添加艾叶能够显著改善蛋鸡的氧化还原效应, 提高产蛋率, 降低料蛋比, 且能显著加深鸡蛋蛋黄颜色、降低蛋黄胆固醇含量。综合考虑效果和添加成本, 艾叶添加量为2.0%时可获得最佳效益。