孢囊线虫 (cyst-forming nematode) 系一类定居性的植物内寄生线虫, 其中最具经济重要性的种类主要隶属于孢囊线虫属 (Heterodera) 和球孢囊线虫属 (Globodera)。孢囊线虫属描述的种类超过80个种, 其中重要的种类有大豆孢囊线虫 (H. glycines)、甜菜孢囊线虫 (H. schachtii) 和禾谷孢囊线虫 (H. avenae) 等; 球孢囊线虫属主要种类有马铃薯金线虫 (G. rostochiensis)、马铃薯白线虫 (G. pallida) 和烟草孢囊线虫 (G. tabacum) 等^[1-2]。在我国, 造成重要农作物病害的孢囊线虫种类主要有大豆孢囊线虫、禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫 (H. filipjevi) 等。其中, 大豆孢囊线虫发生普遍, 在我国东北、华北和黄淮海等大豆产区都有分布; 禾谷孢囊线虫自1989年首次在湖北天门县发现后, 已在国内16个省市发现有分布, 系小麦上最重要的病原线虫^[3-4]; 菲利普孢囊线虫是2010年首次报道在河南省许昌市等多个地区有发生^[5]。此外, 国内已描述的孢囊线虫新种有中华孢囊线虫 (H. sinensis)、冯氏孢囊线虫 (H. fengi)、海南孢囊线虫 (H. hainanensis) 和广东孢囊线虫 (H. guangdongensis) 等^[6-9]; 描述的记录种有旱稻孢囊线虫 (H. elachjsta)、朝鲜孢囊线虫 (H. koreana) 和艾球孢囊线虫 (G. artemisiae) 等^[10-12]。

迄今, 仅在浙江省的杭州和萧山发现大豆孢囊线虫的分布^[13]。为明确孢囊线虫在浙江省的发生及分布特点, 在2015—2016年间调查了浙江省孢囊线虫的分布, 从临安市板桥镇雷竹 (Phyllostachys praecox) 根围采集到一个孢囊线虫群体。本研究结合形态学和分子生物学方法对该孢囊线虫群体进行了系统的观察和测量, 本文报道有关结果。

1 材料与方法 1.1 线虫样品的采集

该线虫样品于2015年8月, 在浙江省临安市板桥镇, 采用随机采样法, 采集雷竹根围5~15 cm间的土壤和根, 装入采集袋中, 并记录采集的地理位置和GPS信息。

1.2 2龄幼虫和孢囊的分离

采用过筛法分离土样中的孢囊, 取100 mL的土样放入盆中加水淘洗, 静置约20 s后, 将上面的悬浮液顺序通过20目、60目、100目和500目的筛子, 重复上述步骤, 最后用水冲洗100目筛子上的滤渣, 随后在解剖镜下挑取饱满的孢囊和白雌虫。

采用浅盘法, 冲洗500目筛子上的滤渣至浅盘中, 过夜, 收集2龄幼虫。

1.3 线虫的形态学显微观察 1.3.1 2龄幼虫的杀死和固定

将分离得到的2龄幼虫 (J2) 置于试管内, 加入等量体积、煮沸的8%甲醛溶液, 充分混匀, 即可杀死和固定线虫, 样品可长期保存。

1.3.2 临时玻片的制作

滴加适量的蒸馏水于载玻片上, 挑入数条J2, 将载玻片置于酒精灯上加热至虫体恰好变直, 加上盖玻片, 在盖玻片周围均匀涂抹指甲油, 封闭盖玻片的四周。临时玻片可用于光学显微镜下短时间内观察、拍照、测量及鉴定。形态学观察及测量值包括J2的体长、最大体宽、口针长、食道腺长、背食道腺开口到口针基球的距离、尾长及透明尾长等; 孢囊下桥的有无、膜孔及类型、泡状囊泡的有无及阴门裂长度等^[14]。

1.3.3 阴门锥的制作

首先将孢囊放入水中浸泡24 h使其软化, 切取阴门锥, 用挑针清除其上的附着物, 移至45%乳酸中清洗和修正。将修正好的阴门锥依次放入70%、90%和100%的乙醇中脱水, 再移至丁香油中透明, 然后埋入滴加中性树胶的载玻片上, 再在阴门锥附近加入适量的中性树胶, 并加盖玻片^[14]。

1.3.4 扫描电子显微镜下的样品制备

1) 将收集的线虫样品在2.5%的戊二醛溶液中固定过夜;

2) 用0.1 mol/L, pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次后, 用1%的锇酸溶液固定样品1~2 h;

3) 再次用0.1 mol/L, pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次;

4) 用梯度乙醇溶液 (30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%和100%) 对样品进行脱水处理;

5) 用乙醇与醋酸异戊酯的混合液 (V/V=1/1) 处理样品30 min, 再用纯醋酸异戊酯处理样品过夜;

6) 临界点干燥后, 将干燥好的样品在解剖镜下粘在铜台上, 喷金镀膜, 观察。

1.4 线虫的DNA提取

挑取一个成熟的孢囊, 置于预先滴加了12 μL ddH₂O的Eppendorf管中, 于液氮中1 min, 95 ℃水浴锅中2 min, 重复3次; 再分别加入4 μL的蛋白酶K (PTK) 和缓冲液 (Buffer, 不含Mg²⁺), 置于65 ℃的水浴锅中温育2 h, 95 ℃ 10 min, 最后12 000 r/min离心1 min, 取上清DNA悬浮液, 于-20 ℃中保存备用^[15]。

1.5 rDNA中ITS区和28S D2D3区扩增

以AB28(ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT)、TW81(GTTTCCGTAGGTGAACCTGC)^[16]和D2A (ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG)、D3B (TCGG AAGGAACCAGCTACTA)^[17]的2对引物分别扩增内转录间隔区 (internal transcribed spacer, ITS) 和28S D2D3区。分别取上述DNA提取物2.5 μL作为模板, 依次加入2.5 μL 10×PCR缓冲液、2.0 μL dNTP、上下游引物各1 μL、rTaq酶0.25 μL、ddH₂O补足至25 μL。扩增条件为94 ℃, 3 min; 94 ℃, 1.5 min; 56 ℃, 45 s; 72 ℃, 80 s, 35个循环, 72 ℃延伸10 min。扩增产物在1%的琼脂糖凝胶电泳上观察。

1.6 纯化、连接和转化

使用Mini BEST DNA Fragment Purification Kit V4.0试剂盒 (大连宝生物工程有限公司) 纯化ITS区和28S D2D3区获得的PCR产物; 纯化产物连接到pEASY-T1 Simple Cloning Kit试剂盒 (北京全式金生物技术有限公司) 中的载体上, 经转化克隆后, 送上海生工生物有限公司测序。

1.7 序列分析

序列结果经DNAStar SeqMan拼接后, 在NCBI上进行比对。

用MEGA 5.0软件, 依据ITS序列, 用邻接法 (NJ) 构建该线虫与其他孢囊线虫属ITS序列系统进化树, 以马铃薯白线虫 (G. pallida) 作为外群。

2 结果与分析 2.1 田间症状

雷竹地上部无明显症状, 受侵染严重的根部主枝明显变短, 且分支多。白雌虫在根上肉眼可见, 头部侵入根内, 身体膨大呈球形, 乳白色或淡黄色 (图 1A, C); 孢囊近圆形, 浅至深褐色 (图 1B)。孢囊密度为每100 mL的土样中0~36个。

2.2 形态学鉴定 2.2.1 形态测量计值

浙江省雷竹根围孢囊线虫的J2与朝鲜孢囊线虫江西群体相比较, 形态测量值差异不明显; 与朝鲜孢囊线虫朝鲜群体相比较，2龄幼虫在体长 (浙江群体/朝鲜群体，528.5 μm/446.0 μm)、尾长 (浙江群体/朝鲜群体，75.4 μm/66.0 μm) 以及透明尾长 (浙江群体/朝鲜群体，51.6 μm/40.0 μm) 等均略长 (表 1)。

浙江群体的孢囊与朝鲜孢囊线虫江西群体相比, 形态测量值无明显的差异; 而与朝鲜群体相比, 孢囊的形态更偏圆形, 即有较大的体宽 (浙江群体/朝鲜群体，672.0 μm/520.0 μm) 和较小的“体长/体宽”比值 (浙江群体/朝鲜群体，1.19/1.50)(表 2)。

2.2.2 形态特征描述

孢囊：虫体球形或近球形, 有明显的短颈和阴门锥, 角质层厚, 浅至深褐色, 内含卵 (图 1B), 体壁有不规则的“Z”形区域 (图 1D)。

白雌虫：身体膨大近球形, 白色或淡黄色 (图 1C)。

阴门锥 (图 2A~D)：锥部角质层厚, 下桥缺失, 阴门锥无泡囊突、无膜孔。

卵 (图 3A~C)：长椭圆形, 卵壳光滑、透明, 长为 (110.2±5.2) μm, 宽为 (41.4±2.1) μm; J2在卵内折叠3~4次。

2龄幼虫：杀死固定时, 虫体向腹部微弯, 呈线形, 两端渐细 (图 4A); 口针粗壮, 口针基部球近圆形 (图 4B); 头部缢缩不明显, 口为矩形, 头架明显 (图 4D); 尾圆锥形, 尾端尖, 有不规则的环纹, 透明尾长占尾长的55%~75%, 占体宽的22%~25%(图 4C, E); 食道腺发育良好, 占体总长的37%;体表环纹清晰可见, 侧区具3条侧线 (图 4F)。

雄虫：未发现。

综合上述, 2龄幼虫、孢囊等主要形态特征及形态测量值的结果, 结合有关的文献描述发现：雷竹根围孢囊线虫与朝鲜孢囊线虫江西群体的主要特征和测量值等基本吻合, 肯定二者为同一种; 与朝鲜群体相比, 浙江群体2龄幼虫有相对较长的体长、尾长和透明尾长及孢囊相对较宽等特点。

2.3 分子特征鉴定

对获得的雷竹根围孢囊线虫ITS区和28S中的D2D3区进行扩增, 分别得到1 006 bp (GenBank登录号：KX640828)(图 5A) 和786 bp (KX640827) 的片段 (图 5B), 与GenBank收录的朝鲜孢囊线虫序列JX1(JN971093和JN971092) 相似度分别高达99.7%和99.6%。这也支持该孢囊线虫群体为朝鲜孢囊线虫。

从系统发育树中 (图 6) 可以看出, 来自浙江雷竹上的孢囊线虫群体与H. koreana isolate JX1群体处于同一进化分支簇上。

H. koreana与H. hainanensis、H. bifenestra均属于Afenestrata group, 在进化树中处于同一大分支簇。在形态特征上, H. hainanensis J2虫体长较短 (379 μm), 孢囊具有下桥, 阴门裂长为34.6 μm^[8]; H. koreana ZJU J2虫体长较长 (528 μm), 孢囊下桥缺失, 阴门裂长为45.3 μm; H. bifenestra J2体长489 μm, 下桥缺失, 阴门裂长15.3 μm^[2], 其阴门裂的长度明显短于H. koreana与H. hainanensis。即基于J2体长、孢囊下桥的有无及阴门裂的长度可明显区分H. koreana、H. hainanensis和H. bifenestra等3种孢囊线虫。

3 结果与讨论

通过对来自浙江临安寄生雷竹的孢囊线虫群体进行形态特征值的测量和描述, 结合ITS区和28S D2D3区的分子特征、ITS序列系统进化树等, 经与有关的孢囊线虫比较, 将浙江临安雷竹根围的孢囊线虫群体鉴定为朝鲜孢囊线虫 (H. koreana), 系浙江省孢囊线虫的新记录种。

朝鲜孢囊线虫于1992年由VOVALS等^[18]在朝鲜半岛南部的毛竹 (Phyllostachys pubescens) 上首次报道发现, 当时该线虫在分类地位上隶属于无膜孔孢囊线虫属 (Afenestrata), 并命名为朝鲜无膜孔孢囊线虫 (A. koreana); 2008年MUNDO-OCAMPO等^[19]确认了孢囊线虫属和无膜孔孢囊线虫属是同属异名, 该线虫被更名为朝鲜孢囊线虫 (H. koreana), 我们对来自浙江雷竹上的朝鲜孢囊线虫的形态学和分子鉴定的结果也支持该线虫隶属孢囊线虫属。另外，该线虫先后在美国佛罗里达州的人面竹 (phyllostachys aurea)^[20]、伊朗的紫竹 (phyllostachys nigra)^[21]和泰国^[2]等地都有分布报道; 国内王宏洪等^[11]在江西省南昌市的毛竹 (P. pubescens) 根际也发现有该线虫的分布。

本研究发现的朝鲜孢囊线虫浙江群体在形态特征上与江西群体基本吻合; 而浙江群体和江西群体都比朝鲜群体、伊朗群体的虫体大^{[11, 18, 21]}, 这可能是由地域和寄主的差异造成的, 我们认为系种内群体的变异; 浙江群体的ITS区与朝鲜江西群体的相似度高达99.7%, 且在系统发育树中处于同一进化分支簇上。也支持浙江雷竹上孢囊线虫群体与朝鲜孢囊线虫的江西群体为同一个种。

雷竹, 又名旱竹、早园竹, 禾本科, 刚竹属。原产于浙江余杭、安吉等地, 临安是中国集中种植雷竹的地域, 主要分布于低丘缓坡地带和平原^[22]。在我国, 竹林面积大、分布广、经济价值高, 生产潜力大, 是影响林农收入的重要经济竹种。本研究发现的朝鲜孢囊线虫系雷竹潜在的重要植物病原线虫。

目前朝鲜孢囊线虫的寄主有雷竹、毛竹、人面竹和紫竹, 国内在江西省和浙江省内报道发现过该线虫, 其在我国的发生分布范围及危害严重性有待进一步调查研究。