玛咖(Lepidium meyenii Walp.)是十字花科独行菜属多年生草本植物，块根肉质、球形，原产南美秘鲁安第斯山区，海拔4 000~4 500 m，驯化栽培历史约2 000年^[1]。研究发现，玛咖根含有丰富的蛋白质、碳水化合物、脂肪酸、矿物质以及玛咖酰胺、玛咖烯等重要的次生代谢产物，具有较高的营养价值和生物活性，有“南美人参”的美誉^[2-3]。根据块根颜色的不同，玛咖可分为多个品种。研究表明，不同品种玛咖块根的化学成分含量有差异^[1]。我国于2001年开始引种玛咖，已在云南、西藏、新疆、四川等地引种成功^[4]，并于2011年5月18日将其列入《新资源食品目录》^[5]。随着市场需求的激增，在我国西南多地逐渐形成较大规模的栽培，不同地区栽培的品种/种源不尽相同，因此，亟须评价现有的不同栽培品种/种源和产地的玛咖质量差异，并探讨其成因。

目前，对玛咖质量评价多采用氨基酸^[6]、矿质元素^[7-9]、生物碱^[7]、玛咖酰胺含量^[10]等单一或少数指标，评价不够全面。因此，本研究采用上述4类指标，通过多种源同地栽培的同质园试验和同一种源异地栽培的迁地试验，综合评价、剖析种源和环境差异对玛咖块根各评价指标成分含量及化学分化式样的影响，旨在为玛咖质量控制和标准化栽培提供参考。

试验材料采集自四川省金玛咖生物科技有限公司的红原和阿坝生产基地，其中，红原基地采集全部4个种源(编号为H₁、H₂、H₃、H₆)，阿坝基地采集6号种源(编号为A₆)。每类样品随机采集5个生长势、大小一致的块根，于2014年10月采收，块根切片，于50 ℃烘干至恒量，用Restch MM400球磨仪粉碎，备用。

精确称取样品0.2 g，加浓硝酸6 mL，95 ℃水浴1 h，转移消解液，定容至50 mL。用电感耦合离子体质谱仪(inductively coupled plasma mass spectrometer,ICP-MS,PerkinElmer NexION 300)测定矿质元素含量^[11]。

精确称取样品0.2 g，加体积比为1∶1的硝酸/盐酸(分析纯)5 mL，于110 ℃水解24 h，转移水解液，定容至100 mL。吸取定容液2 mL，用氮吹仪于60 ℃下脱干。加0.02 mol/L HCl混匀，过0.22 μm微孔滤膜，用日立L8900全自动氨基酸分析仪测定氨基酸含量^[12]。

精确称取样品0.5 g，加甲醇(分析纯)20 mL，于80 ℃水浴超声提取30 min，过滤，用氮吹仪吹干。分3次、每次加入1 mL盐酸溶解，5 000 r/min离心10 min，取上清液，用10% NaOH调至pH=10，用三氯甲烷萃取3次，合并萃取液，浓缩并定容至10 mL，作为供试液。配制0.1 mg/mL小檗碱标准溶液，依次取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL，加三氯甲烷至1.0 mL，配成系列标准液。各取供试液和标准液1 mL，加 2.0×10^-4 mol/L溴麝香草酚蓝溶液(溶于pH 7.0的磷酸缓冲液)和三氯甲烷各5 mL，密塞振摇2 min，静置2 h。取三氯甲烷层，加0.2 g无水硫酸钠干燥，摇匀，放置10 min，用导津UV-2700紫外可见分光光度计测定在414 nm处的吸光度值^[13]。

参考MCCOLLOM等^[14]和朱财延等^[15]的高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)进行优化：精密称取样品0.5 g，加乙酸乙酯(分析纯)10 mL，250 W超声提取30 min，滤液经50 ℃水浴、氮吹仪吹干，用乙腈(色谱纯)定容至10 mL，经0.22 μm疏水性微孔薄膜过滤，滤液用于HPLC分析。HPLC分析仪(ProStar 210，美国Varian公司)；柱温箱(天津市旗美科技有限公司)；色谱柱：250 mm×4.6 mm，1.8 μm(北京迪马欧泰科技发展中心)。柱温：40 ℃;流速：1 mL/min；流动相A：0.005%三氟乙酸(TFA)，流动相B：乙腈;洗脱梯度：0~30 min(15%A∶85%B)，30~35 min(15%A∶85%B→0%A∶100%B)；检测波长：210和280 nm。

参考YANG等^[16]的方法对样品进行考察：取同一供样液，连续进样5次，进行精密度试验，考察其主要共有峰保留时间和峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。同时，分别于0、2、4、8、12、24和48 h进样，考察样品的稳定性，计算主要共有峰的保留时间和峰面积的RSD；精确称取N-苄基十八碳酰胺标准品1 μg，并用甲醇(分析纯)稀释至150、100、50、25和10 μg/mL，进行标准曲线绘制，考察最低检测限(limit of detection，LOD)(信噪比为3)和最低定量限(limit of quantitation，LOQ)(信噪比为10)。

采用3种分析方法比较不同来源玛咖之间的化学相似性和分化程度。一是含量比较法：采用单因素方差分析的多重比较和双样本t检验，比较不同来源的玛咖之间在氨基酸、矿质元素、总生物碱、玛咖酰胺含量上的差异。通过Shapiro/Wilk方法，检验数据是否符合正态分布。通过方差齐性检验，确定多重比较的方法：若数据符合方差齐性，则使用最小显著差别法；若不符合，则使用Tamhane法。二是整体相似性的图示比较法：分别利用主成分分析(principal component analysis，PCA)和分级聚类分析(hierarchical clustering analysis，HCA)，分析供试样品的聚类和分化式样。供试数据做Z分数标准化，利用PCA提取解释度最大的2个主成分；HCA采用基于欧几里德距离的Ward方法。三是整体相似性的量化比较法：对数据进行0~1标准化处理，计算相似度系数(夹角余弦值)，并做单因素方差分析，检验不同类别的供试样品间是否存在显著的化学分化。上述分析均通过SPSS 22.0(美国IBM公司)软件完成。

本研究检测玛咖酰胺的HPLC法具有良好的精确性(RSD＜3%)、稳定性(RSD＜3%)和灵敏性(LOD≤0.09 μg/mL，LOQ≤0.02 μg/mL)；查阅文献并结合标准品比对，确定玛咖样品中的峰6是N-苄基十八碳酰胺；此外，还检测到5种未知物质(图 1)。

图1(Figure 1)

峰6代表标准品N-苄基十八碳酰胺，1~5对应5种不同未知物质的共有峰。 Peak 6 represents the reference component,N-benzyl-octadecanamide; peaks 1 to 5 represent different unknown shared chemical compounds. 图1 N-苄基十八碳酰胺的HPLC图(A)及玛咖样品代表性物质的HPLC图(B) Fig. 1 N-benzyl-octadecanamide standard chromatographic profile (A) and representative chromatographic profile of Maca (Lepidium meyenii) (B)

从表 1可以看出：红原基地同质园栽培的4个种源玛咖在所检测的全部17种氨基酸、8种矿质元素和总生物碱含量以及6个色谱峰面积(包括N-苄基十八碳酰胺)间在统计学上几乎无显著差异(P>0.05)，仅有4种氨基酸(天冬氨酸Asp、苯丙氨酸Phe、赖氨酸Lys、脯氨酸Pro)含量和色谱峰1的面积在统计学上存在显著差异；此外，2号种源(H₂)的3种氨基酸(天冬氨酸Asp、苏氨酸Thr、丝氨酸Ser)含量总体上高于其他种源，而其色谱峰1面积小于其他种源；相比同地栽培的不同种源，在红原和阿坝异地栽培的相同种源(H₆和A₆)的化学成分含量差异较大，两者在11个分析指标含量上有显著差异，包括5种矿质元素(Fe、Ca、K、Mg、Na)及矿质元素总含量、3种氨基酸(甲硫氨酸Met、苯丙氨酸Phe、脯氨酸Pro)、总生物碱含量、1个色谱峰面积(峰3)，其中，H₆有5个指标成分的含量高于A₆，A₆有6个指标成分的含量高于H₆。可见，种源和产地对玛咖具体化学成分的影响不尽相同。而不同种源和产地对供试材料的玛咖酰胺含量均无显著影响。

表1(Table 1)

表1 不同来源玛咖化学成分含量比较 Table 1 Comparisons of chemical composition contents among Maca samples with different cultivars and cultivation localities

表1 不同来源玛咖化学成分含量比较 Table 1 Comparisons of chemical composition contents among Maca samples with different cultivars and cultivation localities 化学成分Chemical composition H1 H2 H3 H6 A6 w(矿物质元素)Mineral element content/(mg/g) Fe 0.222 0±0.032 8a 0.165 1±0.043 6a 0.197 0±0.035 4a 0.220 3±0.048 4a 0.416 9±0.150 1* Ca 2.463 9±0.264 7a 2.746 7±0.474 9a 2.604 1±0.134 7a 2.249 4±0.228 0a 3.063 4±0.217 6* K 20.027 6±0.792 8a 20.204 8±2.531 2a 18.280 0±2.471 8a 19.910 4±2.112 5a 15.696 5±0.746 5* Mg 0.894 6±0.111 6a 1.021 5±0.145 6a 0.862 5±0.078 8a 0.878 6±0.045 2a 1.214 3±0.133 0* Na 0.023 7±0.002 6a 0.026 0±0.002 4a 0.025 7±0.007 6a 0.026 2±0.004 3a 0.060 9±0.008 1* P 4.222 1±0.413 2a 4.586 1±0.250 4a 4.119 4±0.285 2a 4.427 5±0.255 5a 4.366 6±0.464 6 Zn 0.032 5±0.002 9a 0.036 6±0.006 2a 0.053 4±0.024 0a 0.058 8±0.039 2a 0.029 6±0.004 2 Cu 0.002 1±0.000 6a 0.002 9±0.000 7a 0.002 2±0.000 2a 0.002 3±0.000 2a 0.004 0±0.001 1 TAME 27.889 1±0.536 8a 28.790 5±2.958 3a 26.145 1±2.425 7a 27.774 4±2.583 8a 24.854 1±1.350 6* w(氨基酸)Amino acid content/(mg/g) Asp 0.057 4±0.007 5ab 0.064 1±0.007 3a 0.054 1±0.005 1b 0.056 1±0.004 7ab 0.052 0±0.001 5 Thr 0.040 0±0.004 4a 0.043 3±0.003 4a 0.041 5±0.002 7a 0.042 9±0.002 5a 0.041 7±0.001 6 Ser 0.029 3±0.004 0a 0.031 9±0.002 8a 0.030 7±0.002 4a 0.032 3±0.002 3a 0.032 2±0.002 1 Glu 0.139 8±0.027 2a 0.153 7±0.038 3a 0.127 7±0.005 5a 0.130 4±0.002 9a 0.155 1±0.014 0 Gly 0.025 4±0.004 0a 0.028 2±0.003 0a 0.023 9±0.002 1a 0.026 3±0.003 8a 0.027 1±0.004 7 Ala 0.036 6±0.003 3a 0.039 3±0.002 0a 0.040 6±0.001 4a 0.042 8±0.002 8a 0.035 9±0.003 0 Cys 0.013 8±0.001 4a 0.014 7±0.002 5a 0.014 5±0.002 2a 0.012 4±0.000 7a 0.011 4±0.001 1 Val 0.037 4±0.003 6a 0.037 3±0.004 3a 0.036 4±0.003 8a 0.032 6±0.003 0a 0.035 8±0.002 8 Met 0.006 4±0.001 3a 0.005 7±0.002 6a 0.004 8±0.001 6a 0.004 7±0.000 6a 0.005 7±0.000 5* Ile 0.042 8±0.002 4a 0.040 8±0.011 2a 0.040 0±0.003 2a 0.040 6±0.003 5a 0.042 0±0.002 1 Leu 0.041 3±0.004 0a 0.043 3±0.005 4a 0.041 7±0.005 0a 0.039 6±0.003 8a 0.036 8±0.002 2 Tyr 0.019 3±0.002 2a 0.021 8±0.001 3a 0.019 0±0.001 4a 0.019 3±0.001 1a 0.018 8±0.001 5 Phe 0.023 8±0.004 1b 0.028 1±0.003 3a 0.023 6±0.002 4b 0.023 4±0.000 7b 0.027 2±0.004 5* Lys 0.047 0±0.008 0ab 0.054 7±0.007 2a 0.044 0±0.006 1b 0.049 8±0.004 7ab 0.050 9±0.007 7 His 0.015 6±0.003 6a 0.018 6±0.004 7a 0.017 0±0.003 9a 0.016 9±0.003 6a 0.018 9±0.002 8 Arg 0.117 9±0.009 1a 0.136 2±0.015 5a 0.112 7±0.000 8a 0.119 4±0.008 8a 0.121 5±0.010 9 Pro 0.081 4±0.016 3b 0.093 1±0.022 9ab 0.094 4±0.013 0ab 0.104 1±0.004 3a 0.081 6±0.010 5* TAAA 0.775 2±0.099 9a 0.854 8±0.122 8a 0.766 4±0.023 0a 0.793 6±0.015 5a 0.794 6±0.024 6 w(总生物碱)Total amount of alkaloid/(mg/g) 1.741±0.131a 1.702±0.155a 1.611±0.130a 1.595±0.166a 1.339±0.091* HPLC相对峰面积HPLC relative peak area 1 27.2±4.4a 10.5±10.3b 25.7±11.5a 25.2±5.9a 24.4±7.1 2 24.1±14.6a 16.6±25.0a 22.3±6.2a 21.0±18.3a 11.1±9.9 3 604.7±153.1a 584.9±103.2a 681.4±103.3a 698.2±109.1a 445.7±120.2* 4 44.2±36.2a 32.0±24.8a 31.8±25.3a 58.4±38.9a 44.2±22.6 5 211.1±56.9a 224.1±15.7a 213.9±36.2a 177.7±44.9a 285.0±67.1 6 7.7±8.7a 5.8±4.0a 3.2±4.0a 5.6±4.4a 3.8±3.6 H1、H2、H3、H6表示在红原基地采集的全部4个种源；A6表示在阿坝基地采集的6号种源。TAME：总矿质元素含量；TAAA：总氨基酸含量;在HPLC相对峰面积中“1~6”表示的含义详见图 1注。同行数据后的不同小写字母表示红原同质园试验的4个种源之间在P＜0.05水平差异有统计学意义；*表示红原和阿坝异地栽培的6号种源(H6和A6)在P＜0.05水平差异有统计学意义。 H1,H2,H3,H6 show respectively four Maca cultivars from Hongyuan County of Sichuan Province; A6 shows the Maca cultivar from Aba Autonomous Prefecture of Sichuan Province. TAME: Total amount of mineral elements; TAAA: Total amount of amino acid; please see the footnote of Fig. 1 for details of peaks 1 to 6 in the HPLC analysis. The values within a row followed by different lowercase letters show statistically significant differences at the common garden experiment in Hongyuan at the 0.05 probability level; single asterisk (*) represents statistically significant difference between the same cultivar transplanted in Hongyuan (H6) and Aba (A6) at the 0.05 probability level.

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基于全部化学数据矩阵的PCA散点图(图 2)直观显示了不同产地和种源的玛咖样品的聚类式样和同类样品间的离散程度。从中可以看出：异地栽培的玛咖明显分成了2类，阿坝栽培的A₆位于上半区，而红原栽培的4个种源聚在下半区，后者又大致分化为2个亚类(H₁，H₂；H₃，H₆)；此外，H₁、H₂这2类样品个体之间的离散程度较高。

图2(Figure 2)

H1、H2、H3、H6表示在红原基地采集的全部4个种源；A6表示在阿坝基地采集的6号种源。 H1,H2,H3,H6 show respectively four Maca cultivars from Hongyuan County of Sichuan Province; A6 shows the Maca cultivar from Aba Autonomous Prefecture of Sichuan Province. 图2 不同来源玛咖基于氨基酸、矿质元素、总生物碱、玛咖酰胺数据的主成分分析 Fig. 2 Principal component analysis (PCA) of Maca samples with different cultivars and cultivation localities using chemical data of amino acids,mineral elements,total alkaloids and macamides

HCA分析结果(图 3)与PCA基本一致：全部样品首先按照产地聚成了分化程度较大的2大分支(H₁,H₂,H₃,H₆；A₆)；异地栽培的6号种源(H₆，A₆)分别聚在2个分支中；在同地栽培的4个种源中，H₁、H₆、H₂聚类较近，而与H₃聚类略远。

图3(Figure 3)

H1、H2、H3、H6表示在红原基地采集的全部4个种源；A6表示在阿坝基地采集的6号种源。 H1,H2,H3,H6 show respectively four Maca cultivars from Hongyuan County of Sichuan Province; A6 shows the Maca cultivar from Aba Autonomous Prefecture of Sichuan Province. 图3 不同来源玛咖基于氨基酸、矿质元素、总生物碱、玛咖酰胺数据的分级聚类分析 Fig. 3 Hierarchical clustering analysis (HCA) dendrogram of Maca samples with different cultivars and cultivation localities using chemical data of amino acids,mineral elements,total alkaloids and macamides

对不同来源玛咖化学相似度系数(夹角余弦值)进行统计学分析(表 2)表明：虽然相同产地4个不同种源之间在矿质元素和色谱峰的相似度上有显著差异，但是其总化学矩阵的相似度差异并不显著；相反，不同产地的相同种源虽然单类指标的相似度差异不显著，但其总化学矩阵相似度具显著差异。

表2(Table 2)

表2 不同来源玛咖化学相似度(夹角余弦值)比较 Table 2 Comparisons of chemical similarity using cosine coefficient among Maca samples with different cultivars and cultivation localities

表2 不同来源玛咖化学相似度(夹角余弦值)比较 Table 2 Comparisons of chemical similarity using cosine coefficient among Maca samples with different cultivars and cultivation localities 参量 Parameters H1 H2 H3 H6 A6 ME 0.860 4±0.118 4a 0.931 0±0.016 3a 0.871 4±0.080 4a 0.814 4±0.082 7b 0.865 0±0.053 4 AA 0.885 0±0.164 3a 0.906 8±0.140 6a 0.902 2±0.054 6a 0.926 0±0.008 7a 0.903 0±0.036 0 HPA 0.673 8±0.061 7b 0.666 4±0.119 0b 0.861 2±0.027 1a 0.889 4±0.039 6a 0.862 6±0.033 5 TCM 0.814 0±0.163 9a 0.866 6±0.142 6a 0.888 4±0.528 8a 0.915 4±0.151 1a 0.892 0±0.278 4* H1、H2、H3、H6表示在红原基地采集的全部4个种源；A6表示在阿坝基地采集的6号种源。ME：矿物质元素；AA：氨基酸；HPA：HPLC峰面积；TCM：总的化学矩阵。同行数据后的不同小写字母表示红原同质园试验的4个种源之间在P＜0.05水平差异有统计学意义；*表示红原和阿坝异地栽培的6号种源(H6和A6)在P＜00.05水平差异有统计学意义。 H1,H2,H3,H6 show respectively four Maca cultivars from Hongyuan County of Sichuan Province; A6 shows the Maca cultivar from Aba Autonomous Prefecture of Sichuan Province. ME: Mineral elements; AA: Amino Acids; HPA: HPLC peak area; TCM: Total chemical matrix. The values within a row followed by different lowercase letters show statistically significant differences at the common garden experiment in Hongyuan at the 0.05 probability level; single asterisk (*) represents statistically significant difference between the same cultivar transplanted in Hongyuan (H6) and Aba (A6) at the 0.05 probability level.

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PCA、HCA及夹角余弦值比较均表明，不同产地环境(红原和阿坝)对供试的相同种源玛咖的总体化学相似性有显著影响，并且其作用大于供试的4种不同种源的差异效应：说明对于现有种源而言，产地环境是影响玛咖块根化学品质的主要因素。玛咖的该特性与短莛飞蓬(灯盏花)(Erigeron breviscapus)^[17]、白术(Atractylodes macrocephala)^[18]、狮牙苣(Leontodon autumnalis)^[19]等植物相似。产地环境对不同类别化学成分的影响不尽相同，如对玛咖酰胺含量无显著影响，而对矿质元素有突出效应，测试的8种矿质元素总含量及其中的5种矿质元素含量差异显著：说明不同产地的土壤性质直接影响了玛咖块根中矿质元素的吸收和积累，导致其产地差异性。此外，四川红原栽培的6号种源(H₆)的总生物碱含量显著高于阿坝(A₆)。因此，在现有种源的生产实践中，应更注重产地的选择和环境条件的控制。

本研究显示种源效应不如产地效应明显，其原因可能是种源对玛咖化学品质的影响较小，与灯盏花类似^[17]。但前人研究发现，玛咖不同品种块根的化学成分含量有差异^[1]；因此，本结果也可能仅仅是因为供试的种源之间遗传分化较小，尚不足以产生显著的化学表型分化，或者这种化学差异因品种而异。下阶段需要进一步分析玛咖不同种源之间的遗传距离，研究遗传距离(遗传差异程度)与化学距离(化学差异程度)的相关性；同时，通过分析不同种源在不同化学成分指标上的具体表现，进一步明确品种特性和育种目标，促进玛咖的标准化生产和质量控制。