植物针对干旱、高盐、低温等严重危害其生长发育及繁殖的非生物胁迫，会做出非常复杂的应答反应^[1-2]。研究植物对非生物胁迫的应答机制，是运用育种手段提高植物抗逆性的必要途径。

在植物抗逆反应过程中，干旱应答元件的结合蛋白(dehydration responsive element binding protein，DREB)转录因子不同于单个的功能基因，它通过参与到下游基因的表达和信号传导中而发挥作用。很多DREB类转录因子基因被转入到植物中后提高了转基因植物对逆境胁迫的耐受性。例如：高世庆等^[3]将大豆GmDREB转录因子基因转入鲁麦，获得了耐旱和耐盐的小麦株系；孙啸^[4]采用基因枪轰击洋葱表皮细胞的方法将GmDREB3基因转入到小麦中，同样也能够显著提高受体材料的抗旱性；XU等^[5]从大麦幼苗中分离到了HvDREB1基因，并将其过表达拟南芥，该基因通过激活另一个基因的活性从而提高了转基因拟南芥对盐的耐受性；HSIEH等^[6]将拟南芥的DREB1B基因在番茄中过量表达，转基因番茄出现矮化现象，但施加外源赤霉素(gibberellic acid,GA)可以阻止这种矮化表型的出现；PELLEGRINESCHI等^[7]将DREB1A/CBF3基因转入小麦，提高了小麦的抗旱性；OH等^[8]将DREB1A基因转入水稻，提高了转基因水稻抗干旱和高盐的能力；耿芳等^[9]将烟草的NbDREB2a基因在拟南芥中超量表达，同样也提高了拟南芥的耐旱性和耐盐性。以上这些研究结果表明，DREB类转录因子能够明显提高转基因植物的抗逆性。

牡丹(Paeonia suffruticosa)是中国的传统名花。随着我国园林花卉产业的发展，牡丹的美化价值和药用价值等也日益受到重视。然而，环境因素使其种植和应用具有一定的局限性。为了能够在江南和华南地区种植出雍容华贵的牡丹花，定向培育具有较强抗逆性的牡丹花品种已成为一项非常重要和紧迫的工作。截至目前，尚未见对牡丹DREB转录因子功能进行相关研究的报道。本文在前期研究^[10]的基础上，对已获得的抗逆转录因子基因PsDREB进行酵母单杂交并结合转基因技术分析该基因的生物学功能，旨在为培育转基因高抗牡丹新品种提供重要的基因资源。

1 材料与方法 1.1 材料

以来源于芍药属牡丹品种洛阳红叶片的转录因子基因PsDREB为研究对象。试验所用试剂DH5α、pCAMBIA2300、GV3103等由北京鼎国生物科技有限公司提供，引物合成由上海生工生物工程技术公司完成，生理指标测定试剂盒由苏州科铭生物技术有限公司提供，载体pGADT7及pGBKT7由中国科学院上海植物生理研究所提供。

1.2 酵母单杂交试验 1.2.1 载体构建

分别以拟南芥DREB基因AtDREB(阳性对照)与PsDREB质粒为模板，用含特异性酶切位点的1f/1r和2f/2r为引物进行KOD高保真酶聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增，并将目的片段连入载体pGADT7及pGBKT7上，获得重组质粒AD-AtDREB/AD-PsDREB和BD-AtDREB/BD-PsDREB。同时，用 3f/3r和4f/4r为引物，以合成的DRE和mDRE质粒为模板进行KOD高保真酶PCR扩增，并将目的片段连入载体pLacZi上，分别获得重组质粒AD-AtDREB+pLacZi-DRE/mDRE和AD-PsDREB+pLacZi-DRE/mDRE。试验所用引物序列见表 1。

1.2.2 酵母转化及筛选

将构建好的AD-AtDREB与AD-PsDREB质粒分别与相应的报告质粒共转化酵母EGY48细胞，涂布于SD/-Ura/-Leu平板上筛选阳性克隆；经PCR鉴定后，阳性克隆用氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(chlorophenol red-β-D-galactopyranoside，CPRG)法测定β-半乳糖苷酶活性。将构建好的BD-AtDREB与BD-PsDREB质粒分别与空的pGADT7质粒(AD)共转化酵母AH109细胞，分别用SD/-Trp/-Leu及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板筛选阳性克隆；经PCR鉴定后，按1x(1倍的稀释倍数)、1/10、1/100梯度稀释后点上述2个平板，检测转录激活活性，同时，用CPRG法测定β-半乳糖苷酶活性。

1.2.3 CPRG法测定β-半乳糖苷酶活性

取诱导出的菌液1 mL，先测定其在600 nm处的吸光值，离心去上清液后，加入1 mL缓冲液1(每100 mL溶液中含有2.38 g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0.9 g氯化钠，0.065 g L-天门冬氨酸钠，1.0 g牛血清白蛋白和50.0 μL吐温20)溶解菌体，振荡混匀，离心后留下大约100 μL上清液，振荡混匀，用液氮将其速冻1 min后于37 ℃水浴加热1 min，然后再放回至液氮中1 min，之后继续于37 ℃水浴1 min；水浴完毕后，加入900 μL缓冲液2(含有20 mL缓冲液1和27.1 mg CPRG)(此时开始计时)，振荡混匀，离心1 min，将上清液取出加入到比色杯中，待杯中液体颜色开始变化时，加入0.5 mL ZnCl₂(3 mmol/L)，用移液器吸打均匀，测其在578 nm处的吸光值。β-半乳糖苷酶活性/U=1 000×D(578 nm)/反应时间/min×体积/mL×D(600 nm)。

1.3 牡丹PsDREB基因转化烟草 1.3.1 表达载体的构建

根据PsDREB基因序列及表达载体pCAMBIA2300的酶切位点设计引物及酶切位点，进行PCR扩增，酶切回收目的片段；同样，对pCAMBIA2300载体也进行酶切。将两者酶切获得的目的片段进行连接并转化大肠杆菌DH5α，通过菌落PCR扩增和测序筛选出阳性克隆，将获得的重组质粒命名为pCAMBIA2300-PsDREB。将该重组质粒转化到农杆菌GV3103中，经PCR及测序鉴定，筛选出阳性克隆。

1.3.2 PsDREB转化烟草

采用农杆菌介导法将PsDREB基因转化野生型烟草植株，并采用刘慧春等^[10]报道的扩增PsDREB全长的引物(5′端：5′-GGGAGGGTACGAGCAAGAGGTAA-3′；3′端：5′-AATTAACCCAACTCACAACAGC-3′)进行PCR鉴定，筛选阳性植株，最后进行转基因植株的后代繁殖。

1.4 转基因烟草的抗逆性分析 1.4.4 胁迫处理

将生长1个月后的野生型烟草和转基因烟草(T₄代)播种苗在相同条件下分别进行4 ℃低温、干旱、300 mmol/L NaCl溶液和100 μmol/L脱落酸(abscisic acid，ABA)溶液处理，7 d后取植株地上部洗净并擦干，-80 ℃保存，备用。

1.4.2 抗逆性生理指标测定

采用苏州科铭生物技术有限公司提供的试剂盒，分别测定获得的植物材料的丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde，MDA)和脯氨酸含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和过氧化物酶(peroxidase，POD)活性等抗逆性生理指标。

2 结果与分析 2.1 PsDREB基因的转录激活活性分析 2.1.1 结合活性

将构建好的AD-AtDREB(阳性对照)与AD-PsDREB质粒分别与相应的报告质粒(图 1)共转化酵母EGY48细胞，并涂布于SD/-Ura/-Leu培养基上筛选阳性克隆，用CPRG法检测阳性克隆的β-半乳糖苷酶活性。结果(图 2)显示：AD-AtDREB和AD-PsDREB均能够识别并结合DRE元件，并激活LacZ报告基因在酵母EGY48中的表达，且AtDREB与DRE的结合活性明显高于PsDREB；而作为对照，AD-AtDREB和AD-PsDREB由于不能识别并结合突变的DRE(mDRE)，所以未能激活报告基因的表达。

2.1.2 转录激活活性

将构建好的BD-AtDREB与BD-PsDREB质粒分别与空的pGADT7共转化酵母AH109细胞，转化产物涂布于SD/-Trp/-Leu及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上进行阳性克隆筛选。结果(图 3)显示：在SD/-Trp/-Leu培养基上，酵母均可以生长；在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上，转化质粒BD-AtDREB、BD-PsDREB和阳性对照平板上均有酵母生长，而在阴性对照平板上酵母无法生长(图 3A)。说明AtDREB和PsDREB均能够激活下游报告基因His的表达，从而使酵母细胞在缺失His的培养基上能够正常生长，即AtDREB和PsDREB具有转录激活功能。β-半乳糖苷酶活性定量结果显示，AtDREB的转录激活活性明显高于PsDREB(图 3B)。

2.2 转基因烟草的鉴定及抗逆性分析 2.2.1 PCR鉴定

为了验证外源目的基因PsDREB是否已经成功转入到烟草上，以转化烟草植株幼嫩叶片的基因组DNA作为模板，以pCAMBIA2300-PsDREB载体的质粒DNA作为阳性对照，以野生型植株的基因组DNA作为阴性对照，用扩增PsDREB全长的引物对其进行PCR扩增，然后取5 μL扩增产物进行电泳检测。结果表明，在被检测的8株转基因烟草中有7株呈阳性(图 4)。

2.2.2 在逆境下的表型分析

以野生型烟草作为对照，将转PsDREB基因的烟草T₄代1个月后的幼苗与同样苗龄的对照进行4 ℃低温、干旱、300 mmol/L NaCl和100 μmol/L ABA处理，7 d后观察其形态表现。由图 5可知：转基因烟草植株在低温和NaCl处理下出现轻度生长迟缓现象，但未出现萎蔫，在ABA处理下叶片轻微黄化，而对照在低温、NaCl和ABA处理后，均有不同程度的黄叶现象，尤其是在NaCl和ABA处理后仅剩下2片心叶保持绿色；经干旱处理后，转基因烟草仅有30%植株出现轻度萎蔫，而对照有90%以上的植株出现中度萎蔫。由此可见，PsDREB基因在烟草中过量表达能够提高烟草的抗逆性，尤其是在抗干旱、高盐和ABA方面效果显著。

2.2.3 生理指标测定结果

植物遭受逆境胁迫后会产生一系列的生理生化反应，一些生理指标也会发生相应变化，如植物体内的MDA和脯氨酸含量会大量积累，抗氧化酶SOD和POD活性会随着胁迫程度的不同产生不同的变化，而这些指标的变化与植物抗逆性有着密切的关系。

试验结果(图 6)表明，经过干旱、高盐(300 mmol/L NaCl)和ABA等胁迫处理后，2个株系的烟草植株除脯氨酸外，其他生理指标变化趋势基本一致。烟草体内的MDA含量与对照相比，除低温处理外，其他逆境处理后均有所提高，且超量表达PsDREB基因的烟草植株的MDA积累量不如野生型植株明显。说明转基因烟草抵抗干旱、高盐和ABA的能力得到了提高，但对低温处理不敏感。经逆境胁迫后植株体内的脯氨酸含量都得到了提高，特别是经高盐和ABA处理后脯氨酸大量积累，其中，转PsDREB基因的株系1提升幅度远高于野生型植株，但株系2未表现出明显差异。SOD活性变化幅度不大，但均表现出转基因植株的SOD活性略高于野生型植株，在干旱条件下差异有统计学意义(P＜0.05)，而在其他胁迫处理下差异不明显。POD活性在干旱和ABA处理后大幅上升，且转基因烟草的POD活性上升幅度明显高于野生型植株。

3 讨论

植物在遇到外界环境胁迫时，某些特定的功能基因会被诱导表达，通常在形态及生理生化代谢上进行一些调整，以适应或忍耐环境胁迫，即胁迫诱导了植物体内不同的生物化学和生理学反应。DREB是一类具有保守的AP2/EREBP结构域的转录因子，能够特异性地与DRE顺式作用元件结合，激活下游基因的表达，从而提高植株的抗逆性^[11-13]。

酵母单杂交系统是由酵母双杂交系统衍生出来的、研究DNA与蛋白质之间相互作用的新型系统，是一种确定已知DNA-蛋白质相互作用和验证转录激活作用的有效方法^[14-15]。DREB转录因子能够特异性地与DRE/CRT顺式作用元件结合，并激活GUS报告基因的表达。例如：秦红霞等^[16]通过酵母单杂交试验发现，银心杨PaDREB2基因编码的蛋白质能特异结合DRE元件，并激活下游报告基因的表达；SHUKLA等^[17]通过酵母单杂交试验验证了鹰嘴豆CAP2蛋白可以与C-重复(C-repeat)/DRE元件在体外特异结合，并可以转录激活报告基因的表达。然而，并不是所有的转录因子都具有相应的转录激活功能。如拟南芥的TINY2基因^[18]、烟草的NbDREB2基因^[19]不具有转录激活活性，欧洲油菜中组Ⅰ和组Ⅱ的DREB类基因虽然都能够特异性地与DRE元件结合，但只有组Ⅰ具有转录激活活性，而组Ⅱ的基因不具有^[20]。本研究对获得的牡丹PsDREB基因通过酵母单杂交试验发现，该基因不仅能够特异性地结合DRE顺式作用元件，并具有较强的转录激活活性。这也验证了笔者在前期研究中已得出的PsDREB 基因C端具有酸性氨基酸富集区，其功能可能是作为转录活性中心的结论^[10]。

用DREB类转录因子基因转化植物，能够提高植物的抗逆性。本研究将牡丹的PsDREB基因转化到烟草中，从而使转基因植株对低温、干旱、高盐和ABA等环境胁迫的耐受性有了一定的提高，尤其是抗干旱和高盐的能力表现明显。一方面表现在形态特征上，如转PsDREB基因的烟草植株在低温和高盐胁迫下虽然出现了轻度的生长迟缓，但并未出现萎蔫现象，而野生型植株在逆境胁迫下黄叶现象显著，尤其在干旱胁迫下植株出现了中度萎蔫；另一方面还表现在生理指标的变化上，如MDA和脯氨酸含量、SOD和POD活性等都是与逆境胁迫密切相关的生理指标，通过测定转PsDREB基因烟草和野生型烟草的这些生理指标可以看出：转基因烟草植株的MDA含量在干旱、高盐和ABA胁迫下均低于野生型烟草，而MDA积累越少其受逆境伤害的程度也就越小；转基因烟草的脯氨酸含量在高盐和ABA胁迫下远高于野生型烟草，该渗透调节物质的积累有利于减少逆境对植株的伤害；转基因烟草的SOD活性在干旱胁迫下以及POD活性在干旱和ABA胁迫下均明显高于野生型植株。以上这些指标在转基因烟草和野生型烟草之间的差异，从形态和生理特征上印证了PsDREB基因能够通过调节渗透调节物质的含量和抗氧化酶活性来提高转基因植株的抗逆性。而转PsDREB烟草对耐低温胁迫的能力提高不明显的原因，可能与烟草本身较抗寒有一定关系。

4 结论

本研究通过酵母单杂交和农杆菌介导法，对牡丹抗逆转录因子基因PsDREB进行了功能分析。酵母单杂交试验结果显示，PsDREB基因不仅能够识别并结合DRE元件，激活LacZ报告基因在酵母EGY48中的表达，并且具有很强的转录激活活性。将PsDREB基因超表达烟草，可以促进烟草抵抗干旱、高盐和ABA等非生物胁迫的能力，尤其是在抗干旱和高盐方面得到了显著提高。该结果为进一步研究牡丹PsDREB转录因子的作用模式奠定了基础，也为今后挖掘更多的牡丹抗逆基因及培育转基因抗逆牡丹新品种奠定了理论和材料基础。