经过上千年的经验沉淀, 中药已经发展成治疗、诊断、预防疾病的独特方法。目前, 因中药在生物医学和生物制药理论等方面的局限性, 使得其在国际市场上缺乏竞争力, 无法与具有靶向性的西药抗衡^[1]。而常用的“药物-靶标”测定技术很难对中药的作用机制做综合分析^[2]。Connectivity map (CMap)技术是由美国博德研究所(Broad Institute)开发的基于RNA芯片技术的研究药物作用机制和药物重定位的技术与数据资源^[3]。该技术通过研究药物对全基因组水平基因表达的影响做整体分析, 通过与已知药物以及疾病进程相关的基因表达图谱作比较分析药物的作用机制^[4], 适用于研究多组分、多靶点的中药。因此, 利用CMap技术研究中药对转录组基因表达水平的影响, 能从分子水平上揭示中药的作用机制, 从而为中药研究以及中药走向国际市场等奠定理论基础。

CMap技术以相关图的形式, 提供了一个大型的药物、基因和疾病之间联系的特征基因表达图谱数据库, 揭示药物、基因和疾病三者之间潜在的联系^[5]。

CMap技术利用RNA芯片, 对样本中的RNA表达水平做全基因组测定, 得到不同基因的表达图谱, 比较候选药物处理和疾病条件下细胞或组织的全基因组RNA表达图谱：如果两者存在互补关系, 则说明该候选药物可能对该疾病具有疗效; 另一方面, 候选药物的基因表达图谱可与CMap数据库中的药物或化合物的基因表达图谱做比对, 进而确定候选药物的可能疗效与药理学机制。其主要思路是以某个药物的基因组表达图谱为参照, 将其在CMap数据库中进行“查询”, 正向联系分值(最高接近+1)的候选药物被认为可能与参照药物之间存在下游调控和临床药物反应层面上的潜在关联, 而反向联系分值(最接近-1)的候选药物最终被认为可能与参考药物不存在潜在关联或存在拮抗作用^{[3, 6]}(图 1)。

图1(Figure 1)

图1 CMap技术流程图 Fig. 1 Technical flowchart of CMap technology

CMap数据库^[3](http://www.broadinstitute.org/cmap)是由药物特有的基因组表达图谱组成, 包括1 309种作用机制已知的具有生物活性小分子处理人类细胞系后的基因表达图谱。利用RNA芯片技术平台对细胞中的基因表达进行定量检测, 从而明确检测出每个细胞系在特定药物处理后其基因表达水平的变化情况, 这些信息则构成了该药物特有的基因组表达图谱^[6]。在药物开发领域中, 我们可以快速利用基因表达谱的数据在该数据库中快速比对出与疾病高关联性的药物, 同时也可以比对出药物分子的主要化学结构, 归纳药物分子可能的作用机制^[7-9]。

中药作用机制研究一直是中医药现代化研究的关键问题之一。依据“君臣佐使”的原则, 中药方剂常以多味药材组合入药, 其作用机制复杂, 使得中药研究面临较大的挑战^[10]。一般中药研究主要着眼于以症状群定义的机体状态偏离, 通常把病理状态下机体出现的综合症状群作为参考系, 而这些症状群是机体此时内在形态功能变化的综合反映。若某个药物消除或减轻了疾病的外在表现症状群, 一般可以认为该药物有效地控制了对应的内在形态功能改变^[11-12]。可见, 传统的中药研究方法不能用现代制药理论解释药物的作用机制。传统的药物研发在确定药物分子的化学结构和靶蛋白之后, 还需要通过动物实验进一步检测药物与机体不同组织及细胞之间的相互作用^[13]。另一方面, 动物实验耗时长且成本昂贵, 数据规模有限, 难以对不同药物的作用机制进行横向对比等^[14]。而应用CMap技术分析在体外中药处理癌症细胞后基因表达谱的变化, 结合大规模的微阵列和生物信息学分析方法, 在基因组表达层面上比较不同药物在作用机制上的相似性, 探寻中药复杂的作用机制^[5]。青蒿素是中国首次从中药黄花蒿中提炼出的一种新的抗疟有效成分, 其对鼠疟、猴疟的原虫抑制率达到100%^[15]。许多制药公司对中药的研发非常感兴趣, 并且希望能从中药中发现像青蒿素这样神奇的药物, 应用CMap技术为中药作用机制的研究提供了科学的解释方法, 从而可能挖掘出中药更多的潜在疗效, 使其充分发挥药用价值。

四物汤(Si-Wu-Tang, SWT)在中国广泛用于治疗妇科疾病, 具有补血调经的效果, 其主要成分包括当归、川芎、酒芍、熟地^[16]。为了解桃红四物汤(Tao-Hong-Si-Wu-Tang, THSWT)是否具有抗疲劳作用, LI, 等^[17]给小鼠连续口服THSWT 28 d, 然后对小鼠进行强迫游泳实验, 并检测其血乳酸、血尿素氮、肝糖原和肌糖原含量。相对于动物实验, 利用CMap技术, 能够更快速全面地解释SWT的作用机制。WEN, 等^[18]对SWT的作用机制进行研究, 采用一定浓度的二甲基亚砜、雌二醇和不同浓度的阿魏酸、SWT处理人的乳腺癌MCF-7细胞6 h后, 利用通路分析研究药物处理后基因表达图谱的改变, 发现SWT通过调节Nrf2(NF-E2-related factor 2)基因来调控氧化应激反应。将SWT处理过的MCF-7细胞后的基因表达图谱与CMap数据库中的化合物作对比, 发现雌二醇处理MCF-7细胞后的基因表达图谱与SWT处理过的相似, 其联系分值比较接近“+1”, 这表明SWT可能有类似植物雌激素的药理作用。此外, 醉茄素A和白藜芦醇这2种化学预防药物的基因表达图谱与SWT也相似, 这表明SWT可能可以作为无毒的化学预防制剂^[19]。

片姜黄是治疗胸胁刺痛、风湿痹痛等疾病的中药, 其主要成分是姜黄挥发油、姜黄醇、β-榄香烯和姜黄素^[20]。周中运, 等^[21]应用双向凝胶电泳、质谱技术和蛋白免疫印迹法研究片姜黄对人正常肝细胞蛋白质组的影响, 发现上调角蛋白1和内质网蛋白19可能是姜黄素抗肿瘤、抗氧化作用的机制之一。然而采用质谱技术^[22]用于中药研究, 仅仅局限于中药的某些化学成分以及部分生物靶点分子, 无法全面了解生物体内与疾病相关的生物靶点, 以及中药在体内发挥药理作用的过程^[23]。要全面了解中药在体内发挥药理作用的过程等需要开展更多的实验, 这是一个长期的、系统的、逐渐积累的工程。相对于质谱技术, 利用CMap技术能够在全基因组上研究中药的作用机制, 并且能够高效地、准确地预测中药的可能作用机制^[24]。将CMap技术结合相关的生物信息学方法, 能够同时分析与中药复杂作用机制相关的基因或靶点。MEJA, 等^[25]用浓度为1 μmol的片姜黄处理人类U937单核细胞18 h后, 将得到的基因表达图谱与CMap数据库中的1 309种化合物对比, 发现有19种化合物的基因表达图谱与片姜黄的相似, 其中谷本系数(用于度量2个集合之间的相似程度的方法)大于0.38^[26]。通过查询DrugBank^[27]和ChemBank^[28], 发现七叶苷、氯倍他索、碘克沙醇、舒必利、金刚烷胺、恶奎酸、洛美沙星7种化合物与片姜黄有明显相似的药物作用。据此可以判断片姜黄可能具有抗感染、抗传染和神经调节作用, 但还需要体内实验验证。

葛杜宁是中草药苦楝皮的有效成分之一, 可治疗蛔虫病、蛲虫病、风疹、疥癣等^[29]。PATWARDHAN, 等^[30]应用免疫沉淀反应、蛋白免疫印迹法结合荧光法证明葛杜宁能抑制热休克蛋白90(HSP90)的伴侣分子P23蛋白引起细胞凋亡, 荧光法虽然特异性强、敏感性高、速度快, 但技术程序复杂。相对于荧光法, CMap技术操作更简单, 并且能够更全面地了解其作用机制。MALONEY，等^[31]利用CMap技术分析发现, 葛杜宁抑制格尔德霉素、17-二甲氨基-格尔德霉素以及17-烯丙基氨基-格尔德霉素的药物作用方式与HSP90相似; 此外, 还发现葛杜宁可以阻断前列腺癌细胞一个重要的激素信号通道^[32]。

小檗碱是从小檗属植物中提取的一种天然的异奎啉生物碱衍生物^[33], 它已经被证实具有抗癌活性并诱导各种癌症细胞凋亡^[34-35]。张娟, 等^[36]应用实时定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测小檗碱对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞Bax和Bcl-2基因表达的影响, 发现Bax和Bcl-2基因的表达改变可能是小檗碱诱导A431细胞凋亡的途径之一。相对于实时定量RT-PCR, CMap技术能更高效准确地了解中药的作用机制。WEN, 等^[37]利用CMap技术分析小檗碱处理细胞后的全基因组表达谱, 发现人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中分别有3 397个和2 706个基因受小檗碱调节。为了证实CMap技术分析的结果, 挑选出已经报道的与乳腺癌相关的10个基因进行实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析和基因肿瘤学分析(gene oncology, GO), 其结果表明小檗碱通过抑制乳腺癌细胞的增殖来调节基因的选择性表达, 同时提示了CMap技术可以用来预测中药的潜在疗效^[38]。

药物重定位(drug repositioning, DR), 也称作药物再开发, 即利用相关的技术或方法对已知的药物进行重新筛选、组合或改造, 从而发现其新用途的过程。比如许多药物治疗疾病X所引起的临床不良反应与药物D的治疗作用有关, 则药物D被认为是治疗疾病X的候选药物^[39]。相对于从0开始的新药研发, DR是基于已知药物的重新开发, 不仅能够节省药物研发的时间和成本, 拓展药物的适用范围, 而且能够使撤市药物得以重新利用, 一直是一个不可或缺的药物开发方式^[40-41]。

单纯依靠药物生物信息学分析并不能直接得到新的药物和疗法, 还需要落实到相关生物、化学以及临床医学实验当中。但是仅仅依靠实验而忽略了对信息和数据在计算层面上的深入分析, 亦难以有效地提高研发效率, 降低药物研发成本^[6]。中药作为生物资源的重要组成部分, 具有物种多样性、遗传多样性和生态环境多样性。采用相关的生物技术以及生物信息学方法, 将有助于更好地利用和开发中药资源的生物多样性, 创造出品质优良的中药新品种^[42]。由于中药成分复杂, 种类繁多, 开发中药新品种存在许多困难, 而CMap技术基于基因表达图谱分析药物、基因和疾病之间的关系, 根据疾病与药物之间基因表达模式的负相关, 可以为药物新适应证的发现提供有益的提示; 比较正常/疾病状态和给药/对照状态下样本的基因表达图谱可以发现与疾病表达模式相反的药物, 为药物重定位预测提供重要线索^[43], 该技术在中药重定位研究方面应用越来越广泛^[44]。

乌索酸为枇杷叶的提取物, 是各种治疗糖尿病的中药活性成分, 具有镇静、抗炎、抗菌、抗溃疡、降低血糖等多种生物学效应, 对患有糖尿病及高脂血症的小鼠有良好的治疗作用^[45]。WU, 等^[46]利用小鼠模型发现乌索酸的衍生物能抑制结肠腺癌Caco-2细胞的吸收, 缓解由链脲菌素诱导的2型糖尿病。而利用CMap技术研究发现乌索酸新的作用, 它还可能提高骨骼肌胰岛素和类胰岛素一号增长因子(insulin-like growth factor-1, IGF-1)的表达量, 抑制肌肉萎缩相关骨骼肌mRNA的表达。更重要的是, 它在影响肌肉萎缩的同时伴随着肌肉肥胖以及空腹血糖、血浆胆固醇和甘油三酯减少^[47]。这些研究发现表明乌索酸可能具有治疗肌肉萎缩及其他代谢疾病的潜力。此外, 重楼皂苷D(Polyphyllin D, PD), 是从中药重楼中提取出的一种强有力的细胞毒性皂素。WU, 等^[48]将小鼠肝癌细胞H22注射裸鼠构建荷瘤小鼠体内模型, 结果表明, 重楼总皂苷具有显著抑制肿瘤生长作用, 同时可显著降低肿瘤组织微血管密度, 从而认为重楼皂苷与抑制肿瘤新生血管生成有关。而利用CMap技术将PD处理人类非小细胞肺癌(human nonsmall cell lung cancer, NSCLC)细胞系NCI-H460后所得的基因表达图谱, 并结合生物信息学、蛋白组和转录组分析研究PD的作用机制发现, PD是潜在的雌激素受体诱导物^[49]。

CMap技术用于中药研究不仅使得传统中药的用途扩大化, 达到老药新用的目的, 而且对中药进行重新定位, 其低风险、低成本以及短周期, 使得药物重定位越来越广泛应用于制药产业^[50]。随着转化生物信息学和生物大数据技术的发展, 药物重定位已经涉及临床研究, 从而满足中国特殊的需要, 这将带来巨大的社会经济效益。

中药的成分复杂, 其有效成分不清楚, 限制了中药的推广应用, 也限制了它与当代医学相结合以及充分发挥其应用价值^[51]; 鉴定中药有效成分需要在科学的方法指导下运用多层次的研究设计, 达到阐明中药特定化学成分的药理作用^[52]。采用萃取、膜分离技术等传统的植物化学方法鉴别中药的有效成分可行性程度比较高, 但存在分离率低、自动化程度低、费时、微量物质分离困难等缺点^[53]; 采用色谱结合标准对照品对比的方法, 是中药色谱鉴定的常规方法, 需要从文献中寻找可能存在的化合物和对照品来进行对比分析, 但是该方法通常存在对照品缺乏的问题^[54]; 传统的薄层色谱法(thin-layer chromatography, TLC)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)等色谱技术, 对于成分组成复杂、含有大量的未知化合物, 也存在研究不足的问题。利用CMap技术鉴别中药的成分更加完善, 能够更准确地反映出可能的有效成分, 结合中药特征总提取物的指纹图谱^[55], 可能更加客观地从整体上评价中药的内在质量。

播娘蒿种子提取物用于治疗咳嗽、哮喘和水肿, 但其在分子水平上的生物活性成分不清楚^[56]。ZHOU, 等^[57]利用高效液相色谱和多元统计分析结合的方法鉴别播娘蒿种子提取物的有效成分, 但该实验程序和后续分析比较烦琐。而KIM, 等^[58]用一定浓度的葶苈甙和播娘蒿的种子乙醇提取物(ethanol extract of Descurainia sophia seeds, EEDS)处理人的肺癌细胞系A549后, 其基因表达图谱与CMap数据库比对后发现，用葶苈甙处理A549细胞后的基因表达图谱与EEDS的相似, 并结合生物信息学的方法, 可以确定葶苈甙是播娘蒿种子的主要生物活性成分, 能加速代谢性调节和疾病的发展进程。

三黄泻心汤(San-Huang-Xie-Xin-Tang, SHXXT)的主要功效是清热解毒, 泻火通便, 用于治疗三焦所致的目赤肿痛、口鼻生疮等疾病, 其主要成分包括黄连、大黄和黄芩^[59]。李鹏远, 等^[60]采用高效液相色谱法对SHXXT成分配伍进行特征图谱分析, 并对活血化瘀优势组分配伍成分的含量进行测定, 但这种方法鉴别SHXXT的最主要成分可能存在分离率低, 对照品缺乏等问题。而CHENG, 等^[61]应用CMap技术研究了SHXXT及其主要成分对肝癌HepG2细胞的基因表达情况, 通过基因的富集分析发现, SHXXT及其主要成分参与了p53基因所调节的通路, 并且能引起HepG2细胞的凋亡和DNA损伤, 结合等级聚类分析发现, SHXXT的主要成分与黄连的基因表达图谱相似, 表明黄连可能是SHXXT最主要的活性成分。

CMap技术能够快速准确地研究中药的作用机制、对中药进行重新定位以及鉴别其有效成分。较之传统的药理学方法、低通量的毒理学实验以及色谱技术等, CMap技术以高通量、快速、自动化等特点弥补了药理学与毒理学等实验的缺陷, 为中药走向国际市场搭建起理论的桥梁。需要强调的是, CMap技术在中药研究方面仍存在评价方法的缺陷和局限性, 目前CMap数据库只有1 309种作用已知化合物的基因表达图谱, 不能涵盖全部的药物基因表达图谱与之对比的需求, 存在作用机制“对比丢失”的问题。因此, 今后不仅要丰富CMap数据库中的化合物数量, 还要利用生物信息学分析方法及常规的分子生物学手段, 结合临床疗效及现有研究报道, 对中药作用机制及药物重定位等做深入、全面的探究分析, 推动中药现代化事业的发展。随着CMap等新技术的开发应用, 中药的研究开发将迎来前所未有的契机, 使中药在造福于人的同时, 还将带来巨大的社会经济效益。