白背飞虱细胞色素P450还原酶基因的分子特征与表达模式分析 | [PDF全文] |
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)是细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenases,CYP)的电子供体,在P450介导的诸多催化反应中起着非常重要的作用[1]。对于昆虫而言,大多数P450介导的对杀虫剂和植物次生代谢物的解毒过程中都需要有CPR的参与[2-3]。CPR也会参与昆虫的其他生理途径,例如蜕皮激素和表皮碳氢化合物的合成与代谢等[4-5]。
尽管昆虫CPR的晶体结构目前尚无报道,但是对大鼠和酵母CPR的3维结构研究表明,该酶由3个功能结构域组成:黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)结合域、黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)结合域和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)结合域,它们均参与电子穿梭过程[6-7]。此外,CPR在N端有一较短的疏水性跨膜区,该区域有助于CPR定位于细胞内质网上[2, 6]。结构生物学研究表明,CPR在电子传递中自身结构会发生变化,以促进与NADPH的结合和电子转移[8-9]。
目前,多种模式和非模式昆虫的CPR基因已被鉴定,如黑腹果蝇( Drosophila melanogaster )[5, 10]、冈比亚按蚊( Anopheles gambiae )[11]、床虱( Cimex lectularius )[12]、二化螟( Chilo suppressalis )[13]、棉铃虫( Helicoverpa armigera )[14]和小菜蛾( Plutella xylostella )[15]等,这对深入研究CPR的生理功能和利用CPR来开发新型的害虫无公害管理技术均具有重要意义。由于CPR是P450s的电子供体,所以目前利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)沉默昆虫的CPR基因进而抑制P450s的活性也受到越来越多的关注。例如:当注射双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)沉默冈比亚按蚊和床虱的CPR基因后,试虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性均显著上升[11-12];当黑腹果蝇的CPR基因被沉默后,试虫表皮碳氢化合物合成代谢受阻,试虫的存活率和羽化率均显著下降[10]。
稻飞虱是水稻的一类重大害虫。近10年来,褐飞虱( Nilaparvata lugens )、灰飞虱( Laodelphax striatellus )和白背飞虱( Sogatella furcifera )及其传播的病毒病相继大规模爆发[16-18]。目前,防治这类害虫仍然依赖大量使用化学杀虫剂;而杀虫剂的无节制使用,不仅造成环境污染,而且还诱使飞虱产生抗药性[19]。此前,针对褐飞虱和灰飞虱CPR基因的研究发现,通过RNAi技术沉默该基因后,试虫对杀虫剂敏感性显著上升,因此,可以利用该基因开发新型的无公害防治技术[20-21]。但白背飞虱的CPR基因至今尚无报道。
本研究首先克隆了重要水稻害虫白背飞虱的CPR基因( SfCPR )全长cDNA序列,并对SfCPR 基因的分子特征进行了分析;其次,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测了该基因在白背飞虱不同组织和不同发育阶段的表达模式;最后,检测了 SfCPR 基因在受到3种杀虫剂(溴氰菊酯、吡虫啉和噻嗪酮)胁迫后表达水平的变化。本研究结果可为进一步揭示 SfCPR 的生理功能奠定基础。
1 材料与方法 1.1 供试虫源本试验所用白背飞虱种群采集自浙江大学华家池校区(杭州),用感虫水稻品种TN1(Taichung Native 1)在人工气候室内饲养繁殖35代以上。饲养条件:温度(25±1) °C,相对湿度80%,光周期16 h光照/8 h黑夜。
1.2 RNA提取和第1链cDNA合成取白背飞虱3龄若虫100头,用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA。提取的RNA样本用无RNA酶的DNA酶(大连宝生物工程有限公司)处理,以消除可能的基因组DNA污染。RNA的浓度和质量用Nanodrop 2000微量分光光度计(美国Thermo Scientific公司)测定。取1 μg总RNA,使用PrimeScript试剂盒(大连宝生物工程有限公司)合成第1链cDNA。
1.3 PCR扩增通过搜索已公开的白背飞虱转录组数据库[22],得到一条编码CPR的cDNA序列,命名为SfCPR 。根据SfCPR 的序列信息设计1对基因特异性引物(表 1),扩增其开放阅读框(open reading frame,ORF)区域。使用KOD FX DNA聚合酶(日本东洋纺公司) 进行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,用凝胶回收试剂盒(美国Axygen公司)回收纯化,克隆入pMD18-T载体(大连宝生物工程有限公司),转化大肠杆菌DH5α菌株,并测序验证。
1.4 序列分析使用ExPASy服务器(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)计算蛋白质理论分子质量和等电点。使用NCBI的BLAST服务器(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索序列一致性及同源基因。使用TMHMM程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)预测跨膜区。通过搜索NCBI的保守结构域数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/cdd.shtml)确定 保守结构域及关键催化残基。使用ClustalW 2.0程序(http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/) 连配SfCPR与其他昆虫CPR的氨基酸序列,连配结果导入MEGA 5.05软件[23],以邻接法构建系统发育树,各分支置信度通过自举法进行1 000次重复检验获取。
1.5 实时荧光定量聚合酶链式反应使用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测SfCPR 基因在白背飞虱不同发育阶段(1~5龄若虫和成虫)以及短翅型成虫不同组织(头、胸、腹、足)中的相对表达水平。试验设3个生物学重复,每个重复含试虫50头。提取总RNA的方法同 1.2 节,使用Revertra Ace qPCR 反转录试剂盒(日本东洋纺公司)合成第1链cDNA,并用超纯水稀释至10 ng/μL。qPCR扩增体系为20 μL,包含1 μL (10 ng) cDNA模板,10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂(日本东洋纺公司),上下游引物各0.2 μL (0.2 μmol/L),超纯水8.6 μL。选择白背飞虱的18S rRNA作为内参基因。qPCR所用引物见表 1。qPCR所用仪器为Bio-Rad CFX96型实时定量系统(美国Bio-Rad Laboratories公司)。PCR反应采用2步法,热循环参数:95 ℃,2 min,1个循环;95 ℃,10 s,60 ℃,20 s,40个循环。基因的相对表达水平使用2-ΔΔ CT方法[24]计算。
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溴氰菊酯、吡虫啉和噻嗪酮购自浙江省台州市新农公司,纯度≥95%。使用时先用丙酮配制成储存液,再逐级稀释至亚致死浓度(溴氰菊酯、吡虫啉和噻嗪酮均为0.5 ng/μL)。使用手动微量点滴仪(美国Hamilton公司)对白背飞虱3龄若虫进行杀虫剂处理,每试虫滴定0.1 μL。处理6、12和24 h后,随机选择30头试虫提取RNA,检测SfCPR 基因表达水平的变化。以丙酮处理的试虫作为对照。试验设3个生物学重复。qPCR步骤同 1.5 节。
1.7 数据统计使用DPS V9.50软件[25]对试验数据进行统计分析。原始数据经反正弦转换,用单因素方差分析进行处理,并用最小显著差别法比较多个样本之间是否存在显著差异(显著性水平设为 P<0.05)。
2 结果 2.1 序列分析通过搜索白背飞虱转录组数据库,获得了1条编码SfCPR 的cDNA序列。该序列经PCR扩增和测序予以验证。SfCPR 的ORF区域全长为2 034 bp,编码一个由677个氨基酸残基组成的蛋白质。SfCPR的理论分子质量为76.762 ku,理论等电点为5.48。该蛋白质与半翅目昆虫CPR的氨基酸序列具有非常高的一致性(68%~97%),与非半翅目昆虫CPR的一致性也较高(65%~72%)(表 2)。SfCPR序列已登录至GenBank数据库,登录号为KJ017970。
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为了确定白背飞虱是否还存在其他种类的CPR旁系同源基因,以模式昆虫的CPR氨基酸序列为模板,使用本地BLAST程序在白背飞虱转录组数据库中搜索,结果没有发现新的与CPR同源的蛋白质序列。这说明在白背飞虱体内,在转录水平上只有1种CPR表达形式。为分析SfCPR蛋白质的2级结构特征,将SfCPR与其他几种昆虫的CPR进行连配。结果(图 1)表明,SfCPR具有CPR的典型特征,例如N端有一个由23个氨基酸残基组成的跨膜区,保守的FMN、FAD和NADPH结合区域,以及关键催化残基。
为了探知昆虫CPRs之间的进化关系,从GenBank下载半翅目(Hemiptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Diptera)昆虫已被注释的CPR氨基酸序列,连同SfCPR一起构建系统发育树。 结果(图 2)显示,虽然这些蛋白质的同源性很高,但不同物种的CPR仍被分在不同的进化支上。其中,白背飞虱( S. furcifera )、灰飞虱( L. striatellus )和褐飞虱( N. lugens )的CPRs聚在同一分支上:表明它们之间的亲缘关系最接近。
通过qPCR分析发现:SfCPR 基因在白背飞虱短翅型成虫的各组织(头、胸、腹、足)中均有表达,其中以腹部的表达量最高,显著高于头部和足部( P<0.05),但与胸部表达水平间的差异无统计学意义( P >0.05);SfCPR 基因在足部的表达水平最低(图 3A)。同样,在白背飞虱的各个发育期均能检测到SfCPR 基因的表达,其中成虫期的SfCPR 表达量最高,2龄若虫次之,4龄若虫表达量最低,且4龄若虫SfCPR 的表达水平与2龄若虫和成虫之间差异有统计学意义( P <0.05)(图 3B)。
使用亚致死浓度的溴氰菊酯、吡虫啉和噻嗪酮处理白背飞虱若虫后,SfCPR 基因的表达水平均有不同程度的上调(图 4):SfCPR 对吡虫啉和噻嗪酮的响应较迅速,使用这2种杀虫剂处理6 h后,SfCPR 的表达水平即显著上升,较之丙酮处理组分别提高了16.04倍和5.72倍;但SfCPR 对溴氰菊酯的响应较慢,处理12 h后,该基因的表达水平才显著升高;用3种杀虫剂处理24 h后,sfCPR 基因的表达水平仍然显著高于丙酮对照组。
本研究克隆了白背飞虱SfCPR的cDNA片段,分析了SfCPR的分子特征,使用qPCR检测了 SfCPR 在白背飞虱不同组织、不同发育阶段以及在受到不同杀虫剂胁迫后的表达模式。CPR为细胞色素P450单加氧酶(CYPs)提供电子,在各种内源性和外源性化合物代谢过程中起着重要作用。本试验结果为后续 SfCPR 功能研究以及利用该基因开发白背飞虱的新型防治技术奠定了基础。
大多数昆虫、脊椎动物和真菌基因组中只表达1个CPR基因。而在一些维管植物如水稻( Oryza sativa )和棉花( Gossypium hirsutum )中表达2个以上的CPR基因[26-27]。本研究通过BLAST搜寻转录组数据,发现在白背飞虱转录组中只有1个CPR基因的转录本。这与在其他昆虫上的研究结果[11-12]一致。
SfCPR蛋白质的2级结构具有CPR的典型特征,例如:保守的FMN、FAD和NADPH结合区域,这些区域在电子传递过程中有重要作用;N端的跨膜区,这一区域可将CPR蛋白锚定在细胞内质网上[6]。有研究表明,虽然N端跨膜区与CPR的活性无关,但这一区域若缺失,CPR就不能传递电子给CYP,催化反应也不能进行[2, 28]。
多序列比对结果表明,SfCPR与其他昆虫CPR的氨基酸序列一致性均较高,尤其是3种飞虱的CPR之间一致性超过95%。但同时也发现,在3种飞虱CPR的氨基酸序列中,FAD和NADPH结合区域之间的氨基酸残基差异较大。哺乳动物CPR的晶体结构显示,FMN和FAD结构域之间的连接区域与辅酶的定向有关,并且有助于稳定CPR的3维结构[9]。但FAD和NADPH结构域之间的连接区域是否具有同样的功能,还有待进一步研究。
SfCPR 基因在白背飞虱成虫的不同组织中均能检测到表达,其中以腹部表达量最高,足部最低。这与褐飞虱和灰飞虱中相应CPR基因的表达模式相似[20-21]。同样,SfCPR 在白背飞虱不同发育期也均有表达,其中以成虫表达量最高,4龄若虫最低。这一模式与褐飞虱和灰飞虱略有不同,可能是由于物种之间的差异所致[20-21]。此前针对棉铃虫和小菜蛾CPR的研究发现,该基因在杀虫剂抗性种群中的表达水平显著高于敏感种群,而且当试虫受到杀虫剂胁迫后,CPR基因的表达量均显著上升。本研究使用3种不同作用类型的杀虫剂处理白背飞虱若虫后,SfCPR 基因的表达水平同样有不同程度的上调。其中,SfCPR 对吡虫啉和噻嗪酮的响应较快,处理后6 h表达水平即显著上升;相较而言,SfCPR 对溴氰菊酯的响应较慢,处理后12 h表达水平才显著上调。这是首次发现飞虱科昆虫的CPR基因对杀虫剂胁迫产生响应,也暗示了 SfCPR 基因很可能参与了P450介导的对杀虫剂的解毒过程。此前的报道显示,注射dsRNA沉默褐飞虱和灰飞虱的CPR基因后,试虫对杀虫剂的敏感性显著增加[20-21]。因此,本研究结果也为利用 SfCPR 开发针对白背飞虱的新型防治技术奠定了前期基础。
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