2016, Vol. 42引用本文 |
| 果蝇组织中多不饱和脂肪酸代谢产物——类二十烷酸的高效液相色谱串联质谱法测定 |  [PDF全文] |
Fifteen metabolites of AA and EPA produced by human in COX, LOX and CYP pathway were chosen, and each pathway contained 1 or 2 metabolites as delegates to ensure the representative of the method. These eicosanoids included PGF2α, PGE2, PGF3α, PGE3, 15(S)-HETE, LTB4, 15(S)-HEPE, 11(12)-EET, 20-HETE, 17(18)-EpETE, 17,18-DiHETE, 15(S)-HpEPE, 15(S)-HpETE, PGH2 and 5(S)-HpETE, and PGE2-d4, 15(S)-HETE-d8 and 20-HETE-d6 were used as internal standards. Samples were prepared by solid phase extraction and separated on an EndeavorsilTM C18 column (100 mm × 2.1 mm, 1.8 μm). The analytes were detected by using multiple reaction monitoring (MRM) in a negative electrospray ion mode. The HPLC-MS/MS method to analyze 15 selected eicosanoids in Drosophila qualitatively and quantitatively was established by optimizing the sample pretreatment and the detection conditions.
It was found that the recoveries were significantly influenced by the pH of sample adjusted by 1 mol/L sodium acetate buffer containing 5% methanol, and the optimized pH was at 6. The response values of analytes separated on a mobile phase of ultrapure water with 0.1% formic acid-acetonitrile were higher than these of ultrapure water with 0.1% formic acid-methanol, ultrapure water-acetonitrile or ultrapure water-methanol. To reduce the matrix interference, the blank Drosophila matrix was used to prepare the standard working solution. Obtained results showed that the calibration curves were of good linearity for the 15 metabolites in the range of 2.5-100 ng/mL with the correlation coefficient (r) of 0.991. The limits of detection and quantitation were about 0.1-2.6 ng/g and 0.3-8.7 ng/g, respectively. Spiked recovery experiments showed that both recoveries (89.3%-111.5%) and relative standard deviations (1.0%-15.0%) met the requirements of analytical methods.
In conclusion, our study has established a simple, specific and sensitive method that suitable for the determination of eicosanoids in Drosophila which serves an approach to clarify the metabolic characteristics of Drosophila to C20 PUFAs.
多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)分为n-3 PUFAs和n-6 PUFAs。前者包括α-亚麻酸(18:3n-3，α-linolenic acid，ALA)、二十碳五烯酸(20:5n-3，eicosapentaenoic acid，EPA)、二十四碳六烯酸(22:6n-3，docosahexenoic acid，DHA)；后者包括亚油酸(18:2n-6，linoleic acid，LA)和花生四烯酸(20:4n-6，arachidonic acid，AA)。它们在生物体内具有多种重要的生理功能，如PUFAs能优化细胞膜生物物理特性，PUFAs及其衍生物一起组成了作用广泛的脂质信号分子群。类二十烷酸属于PUFAs最重要的一类衍生物[1]，它由20C PUFAs通过环氧合酶(cyclooxygenase，COX)、脂氧合酶(lipoxidase，LOX)和细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)3种酶路径代谢产生[2]，主要包括前列腺素(prostaglandins，PGs)、白细胞三烯(leucotrienes，LTs)、凝血噁烷(thromboxanes，TXs)过氧化羟基二十碳四烯酸(hydroperoxyeicosatetraenoics，HPETEs)、羟基二十碳四烯酸(hydroxyeicosatetraenoics，HETEs)、羟基二十碳五烯酸(hydroxyeicosapentaenoics，HEPEs)和环氧化三烯二十烷酸(epoxyeicosatrienoics，EETs)等脂氧素类[3]，它们几乎参与了所有人体器官、组织和细胞的生理活动[4]，对稳定细胞膜功能、调控基因表达、维持细胞因子和脂蛋白平衡、抗心血管病、促进生长发育等具有重要作用[5]。
早期对类二十烷酸的了解都通过哺乳动物模型上得到，但由于哺乳动物生理结构复杂，过程多变，且不易控制，还受到成本和伦理学制约，因此给研究带来很多不便。果蝇、线虫和酵母等简单模式生物具有成本低廉、生命周期短、繁殖力强等优势，如能与遗传学、生物信息学和代谢组学方法相结合，可消除以往类二十烷酸研究工作的很多障碍，可为其生理机制研究提供一条简捷有效的新途径。在简单模式生物中，果蝇由于具有类似脂肪的身体组织和脂质运输系统，在生理上更接近人体，最适合作为哺乳动物的替代模型[6, 7]。从理论分析看，通过果蝇了解类二十烷酸的作用机制后，可为在哺乳动物和人体中进一步验证提供明确目标和方向。但由于果蝇与哺乳动物的脂质代谢特性毕竟存在差别[8]，果蝇能否真正替代哺乳动物，首先需通过实验了解其对C20 PUFAs的代谢特性及与哺乳动物的差异程度。 类二十烷酸的提取和检测是研究果蝇对C20 PUFAs代谢特性的基础。但目前关于果蝇组织中类二十烷酸的检测还没有现成的方法，因此解决这一问题是本研究的主要目标。由于C20 PUFAs通过COX、LOX和CYP 3种酶代谢路径产生的衍生物种类很多，为了有效分析果蝇与哺乳动物对C20 PUFAs代谢特性的差异，本研究从3条PUFAs代谢路径各选了1~2种AA和EPA的代表性代谢物共15种类二十烷酸。1)COX路径的代表性代谢产物:PGH2(AA的初级衍生物，是AA产生的所有PGs前体物质)，PGE2和PGF2(AA的代谢物)，PGE3和PGF3(EPA的代谢物)；2)5-LOX路径的代表性代谢产物:5(S)-HpETE和LTB4(AA的初级衍生物和次级代谢产物)；15-LOX路径的代表性代谢产物:15(S)-HpETE和15-HETE(AA的初级衍生物和次级代谢产物)，15(S)-HpEPE和15-HEPE(EPA的初级衍生物和次级代谢产物)；3)CYP路径的代表性代谢产物:11，12-EET和20 HETE(AA代谢产物)，17，18-EpETE和17，18-DiHETE(EPA代谢产物)[2]。根据15种类二十烷酸的性质，通过样品前处理方法优化和液相色谱条件以及质谱检测条件研究，建立了果蝇组织中15种类二十烷酸的液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)定性、定量分析方法。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物野生型Canton-S黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，采用人工气候箱培养，光照条件为12 h/12 h黑白交替，恒温25 ℃，恒湿65%。实验用饲料配制方法:将玉米粉105 g、琼脂7.5 g、蔗糖75 g、酵母粉40 g溶解在1 L水中，加热搅拌均匀，高温灭菌冷却至60 ℃，加5 mL丙酸配制成基础饲料。果蝇培养14 d后，收集样品于-80 ℃保存作为检测样品。
1.1.2 试剂类二十烷酸标准品和内标(PGE2-d4、15(S)-HETE-d8和20-HETE-d6，美国Cayman公司)，购自上海纽雀客生物科技有限公司；2，6-二叔丁基对甲苯酚(butylated hydroxytoluene，BHT，色谱纯，美国Sigma公司)，购自上海通善生物科技有限公司；甲醇、乙腈(色谱纯，美国sigma公司)；Milli-Q 超纯水，其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 仪器与设备EkSpertTMultraLC 100型液相色谱仪(美国Applied Biosystems Sciex公司)； Triple QuadTM 5500型质谱仪(美国Applied Biosystems Sciex公司)；Varian Bond Elute CerifyⅡ固相萃取柱(500 mg/6 mL，美国Agilent公司)；EndeavorsilTM C18色谱柱[(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)北京迪科马科技有限公司]；KA-1000低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；DKS-24电热恒温水浴锅(嘉兴市中新医疗仪器有限公司)；雷磁pHS-3C型pH仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)；MTN-5800W圆形氮吹浓缩装置(杭州汇尔仪器设备有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 样品预处理提取和净化:准确称量100 mg果蝇于1.5-mL 离心管中，液氮研磨成粉，加到1.5 mL含0.1% BHT冰甲醇中，研磨组织样品直至完全均质，加入内标PGE2-d4、15(S)-HETE-d8和20-HETE-d6各5 ng，涡旋0.5 min，超声提取10 min，12 000 r/min离心5 min收集上清液，剩余沉淀用1.5 mL冰甲醇(含0.1% BHT)重新悬浮，12 000 r/min离心5 min后收集，合并2次上清液。添加1 mol/L的醋酸钠缓冲液(含5%甲醇)定容到10 mL调节样品pH，待净化。用25 ng/mL的混合标准品，比较用pH为5、5.5、6、6.5、7的1 mol/L醋酸钠缓冲液(含5%甲醇)调节样品pH时对脂肪酸代谢产物回收率的影响。采用固相萃取法净化[9]。
1.2.2 质谱分析方法采用ESI负离子扫描模式进行多反应监测模式(multi reaction monitoring mode，MRM)，扫描时间为 50 ms，离子喷雾电压为-4 500 V，离子源温度为400 ℃，气帘气压力为30 psi(0.21 MPa)，雾化气压力为35 psi(0.24 MPa)，辅助气压力为35 psi(0.24 MPa)。雾化气、锥孔气为氮气，碰撞气为高纯氮气，通过条件优化得到各标准品的定性离子对、定量离子对、去簇电压、入口电压、碰撞气能量和碰撞室出口电压等质谱参数。
1.2.3 色谱分析方法使用EndeavorsilTM C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，柱温40 ℃，进样量5 μL，流速0.3 mL/min。用适当浓度的标准工作液考察比较甲醇和乙腈作为流动相的有机成分以及水相中加或不加1%的甲酸，对18种代谢产物的分离效果和响应值的影响，最终选择最佳流动相。
1.2.4 基质干扰取不含类二十烷酸的空白果蝇，按样品前处理方法进行，进样检测分析果蝇基质中是否含有干扰峰。同时，向空白果蝇基质样品添加适当浓度的混合标准工作液，检测分析样品基质碎片离子对待测脂肪酸代谢产物和内标定量离子的干扰。
1.2.5 标准曲线的制备样品采用内标标准曲线法[10]进行定量，选用空白果蝇基质来配制所使用的一系列基质标准工作。配制质量浓度为2.5、5、12.5、25、50、100、200 ng/mL混合标准工作液，取200 μL不同浓度的混合标准溶液，分别加入15 μL内标标准工作溶液(1/3 μg/mL)(相当于加内标各5 ng)，在相同的HPLC-MS/MS条件下测定。每一浓度平行3次，以标准品与内标的定量离子峰面积之比的平均值为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标作图，绘制内标标准工作曲线，并计算回归方程及相关系数。
1.2.6 回收率和精密度在空白果蝇样品中添加低(10 ng/g)、中(25 ng/g)、高(50 ng/g)3个质量浓度水平的15种类二十烷酸的混合标准溶液，每个浓度做 3 个平行，进行回收率和精密度实验。
1.2.7 检测限和定量限用低浓度为10 ng/g添加水平的峰高测定值与3倍信噪比(S/N=3)进行比值换算得到检测限，用其峰高与 10 倍的信噪比(S/N=10)进行比值换算得到定量限。
2 结果 2.1 醋酸钠缓冲液(含5%甲醇)pH的优化不同的醋酸钠缓冲液(含5%甲醇)pH对目标提取物回收率的影响分析结果显示，总体趋势相同。从COX、LOX和CYP路径分别选取PGE2、15(S)-HETE和15(S)-HEPE、17(18)-EpETE为代表性目标分析物(图1)可见，当醋酸钠缓冲液的pH为5和5.5时回收率很低，pH为6时最高，pH为6.5时稍降，pH为7时回收率较低，故最终选择pH为6的1 mol/L醋酸钠缓冲液(含5%甲醇)调节样品pH值。
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| 图1 不同pH的醋酸钠缓冲液对代谢产物回收率的影响 Fig. 1 Effect of different pH of sodium acetate buffer on the recovery of metabolites |
代谢产物检测质谱参数见表1。
| 表1 代谢产物检测质谱参数Table 1 Mass-spectrometry conditions for determining of the metabolites |
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流动相组成优化结果(图2)表明，与不加酸的水-甲醇和水-乙腈体系相比，水相加酸的流动相响应值明显更高，且用 0.1%甲酸水-乙腈比用0.1%甲酸水-甲醇作流动相对分析物的响应值更高，原因可能是在负离子模式下加甲酸作为添加剂，有利于类二十烷酸的离子化，且乙腈比甲醇更有利于类二十烷酸丢失H质子。以上所述，本实验选择0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)作为流动相。梯度洗脱程序为0~10 min，80%~5% A；10~12 min，5% A；13~15 min，5%~80% A；16~17 min，80% A。
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| 1: PGF2α; 2: PGE2; 3: PGF3α; 4: PGE3; 5: PGE2-d4; 6: 15(S)-HETE; 7: LTB4; 8: 15(S)-HEPE; 9: 11(12)-EET; 10: 20-HETE; 11: 17(18)-EpETE; 12: 17,18-DiHETE; 13: 15(S)-HETE-d8; 14: 20-HETE-d6; 15: 15(S)-HpEPE; 16: 15(S)-HpETE; 17: PGH2; 18: 5(S)-HpETE. 图2 不同流动相对代谢产物响应值的影响 Fig. 2 Effect of organic mobile phase on the response of metabolites |
由不含类二十烷酸的果蝇基质液相色谱图(图3A)可见，空白样品的响应值很低，响应值(countspersecond，cps)范围为20~200 cps，无特征离子峰的出现，说明空白对照组果蝇体内缺乏待测目标产物。由果蝇基质中的混合标准品液相色谱图(图3B)待测脂肪酸代谢产物和内标定量离子没有受到样品基质碎片离子的干扰，峰形良好，不影响类二十烷酸的检测。果蝇基质样品添加25 ng/g 15种标准品的定量离子对有明显的出峰，峰高响应值范围为6 600~89 000 cps。
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A:果蝇基质;B:含混合标准品的果蝇基质. A: Drosophila matrix; B: Drosophila matrix contained standard mixture. 图3 果蝇基质及含代谢产物混合标准品基质的液相色谱图 Fig.3 Liquid chromatogram of Drosophila matrix and a standard mixture of all measured lipid metabolites in the matrix |
内标标准工作曲线的线性方程及相关系数(表2)表明，15种类二十烷酸在2.5~200 ng/mL的范围内呈良好的线性关系，相关系数(r)均大于0.991，可满足定量分析要求。
| 表2 代谢产物的线性回归方程和相关系数Table 2 Linear regression equation and correlation coefficients (r) of the metabolites |
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表3显示，加标回收率在89.3%~108.9%，日内精密度相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)在1.2%~12.4%，日间精密度RSD在1.0%~15.0%，故本方法的准确度和精密度均满足分析要求。
| 表3 代谢产物的回收率和精密度Table 3 Recoveries and precisions of the metabolites |
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由15种代谢产物在果蝇基质中的检测限和定量限(表4)可见，检测限范围为0.1~2.6 ng/g，定量限范围为0.3~8.7 ng/g。
| 表4 果蝇基质中代谢产物的检测限和定量限Table 4 Limits of detection and the limits of quantitation of metabolites in Drosophila matrix |
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现有的文献中对果蝇对C20 PUFAs的代谢特性一直存在很大争议:一方面，有研究表明果蝇既不需要也不能合成C20及以上的 PUFAs，如RAPPORT等[11]发现果蝇可以在完全无菌且不含外源脂肪酸的合成培养基中连续生存十代以上；酶同源性分析表明，由于果蝇缺乏哺乳动物多不饱和脂肪酸合成和代谢途径的限制性酶—Δ-6/Δ-5去饱和酶的编码基因[8]，可以推测，即使含有外源的C18 PUFAs，果蝇也不能合成C20PUFAs[8, 12, 13]；另一方面，也有报道显示，C20 PUFAs的衍生物类二十烷酸对果蝇的免疫应答[14, 15]和卵泡成熟[16]有着至关重要的作用，但相关报道都未作果蝇组织中是否含有相关类二十烷酸的检测。
根据相关文献系统检索结果，迄今为止，只发现1篇报道检测果蝇组织中类二十烷酸的文献.GUALDE等[17]通过GC-MS检测，发现用AA培养的果蝇匀浆中有AA在LOX路径的代谢产物8-、9-、12-、15-HETE，并通过HPLC-RIA(放射免疫分析)检测到了AA通过COX路径的代谢物PGE2。但该报道中的样品前处理只经过简单的有机提取，有存在带来杂质干扰的可能。另外GC-MS甲酯化过程繁琐且所用试剂毒性很大，HPLC-RIA太过耗时，还涉及放射性物质，不利于环境保护和人体健康。
本研究采用固相萃取法进行了样品前处理，可有效去除基质中的杂质，并保留待测物。同时采用内标法测定，在样品前处理时加入了内标物，减少了检测误差；特别是采用最新检测设备，以及更灵敏、快速HPLC-MS/MS 检测方法，通过MRM扫描模式跟踪待测物的特征离子对，实现了对待测物的特异性扫描，体现出选择性好，可以在较短时间内实现小量样品中微量化合物的定量分析优势，具有精密度和回收率较高，专属性强的特点。
4 结论本研究建立了HPLC-MS/MS方法同时检测果蝇组织中15种类二十烷酸最佳定性、定量分析方法，为研究果蝇对PUFAs的代谢特性提供了方法学基础，更为进一步探究果蝇与哺乳动物对多不饱和脂肪酸代谢的差异性，评价其作为营养基因组学研究的模型适用性提供了技术支撑。
致谢 浙江大学农学院朱国念教授为本研究提供了液相色谱-串联质谱设备，桂文君副教授、李舒盈同学和杨梅博士为本研究提供了指导和帮助，谨致谢意。
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