浙江大学学报(农业与生命科学版)  2016, Vol. 42 Issue (3): 313-320
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陈仁良, 李肖, 龙莹, 张磊, 严俊杰, 黄千慧, 熊宏民, 谢宝贵. 金针菇疏水蛋白Fv-Hyd1及其潜在的转录因子Fv-Rtg3的共表达分析[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2016, 42(3): 313-320. DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2015.10.091
CHEN Renliang, LI Xiao, LONG Ying, ZHANG Lei, YAN Junjie, HUANG Qianhui, XIONG Hongmin, XIE Baogui. Analysis on the co-expression of hydrophobin Fv-Hyd1 and its potential transcription factor Fv-Rtg3 in Flammulina velutipes[J]. Journal of Zhejiang University(Agric. & Life Sci.), 2016, 42(3): 313-320.  DOI: 10.3785/j.issn.1008-9209.2015.10.091.
金针菇疏水蛋白Fv-Hyd1及其潜在的转录因子Fv-Rtg3的共表达分析[PDF全文]
陈仁良1, 李肖1, 龙莹1, 张磊1, 严俊杰1, 黄千慧1,2, 熊宏民1, 谢宝贵1    
1. 福建农林大学生命科学学院菌物研究中心,福州350002;
2. 福建农林大学园艺学院,福州 350002
基金项目: 国家重点基础研究发展计划(973)项目(2014CB138302)；国家现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS24)。
通信作者: 谢宝贵(http://orcid.org/0000-0003-2192-4168),Tel:+8659183789277,E-mail:mrcfafu@163.com
第一作者联系方式: 陈仁良(http://orcid.org/0000-0003-3662-095X),E-mail:crlmiracle@126.com
收稿日期(Received): 2015-10-09; 接受日期(Accepted): 2015-12-07; 网络出版日期(Published online): 2016-05-19
摘要: 疏水蛋白(hydrophobin,Hyd)普遍存在于真菌的气生菌丝、侵染结构或子实体表面,且存在时空性高丰度表达。不同真菌疏水蛋白在其各个发育阶段发挥不同的功能,如气生菌丝的生长、子实体原基的形成及其形态分化等。虽然已有众多报道指出Hyd与生物或非生物环境刺激所产生的抗逆性有关,但是对它与细胞分裂分化等生物学功能及其信号转导调控的关系仍了解甚少。通过培养金针菇(Flammulina velutipes)菌丝以及金针菇出菇实验,结合基因组及转录组数据、蛋白结构预测、系统发育进化树聚类分析等生物信息学分析鉴定金针菇中一个编码疏水蛋白基因Fv-Hyd1,并利用其上游序列预测该疏水蛋白基因潜在的调控转录因子,辅以实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)数据和皮尔森相关系数鉴定它们的表达关系。结果表明,Fv-Hyd1与金针菇菌丝扭结和子实体原基的形成具有一定的相关性,与其潜在的转录因子Fv-Rtg3之间存在较强的共表达规律,并以此结合蛋白磷酸化位点预测,推测基因Fv-Hyd1的表达调控机制。
关键词: 金针菇    扭结    原基    荧光定量PCR    共表达    皮尔森相关系数    
Analysis on the co-expression of hydrophobin Fv-Hyd1 and its potential transcription factor Fv-Rtg3 in Flammulina velutipes
CHEN Renliang1, LI Xiao1, LONG Ying1, ZHANG Lei1, YAN Junjie1, HUANG Qianhui1,2, XIONG Hongmin1, XIE Baogui1    
1. Mycological Research Center, College of Life Science, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, China;
2. College of Horticulture, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, China
Summary: Flammulina velutipes, with high edible and medicinal value, was widely cultivated in China and Southeast Asia. Being worthy to be noted, the fruiting body formation and development of F. velutipes were influenced by many factors, such as the internal factors including transcription factor, protein kinase, sparse water protein and the cell pigment, and environmental factors including light, temperature and carbon dioxide. It is very important to understand the response of genes to the influencing factors in transcription level, translation level and environmental stimuli for studying the regulation of F. velutipes fruiting body growth and development. Among them, the hydrophobins were commonly found in fungal hyphae, infection structure or surface of the fruiting body, and there is a temporal and spatial expression with high abundance. Different fungal hydrophobins perform different functions in various stages, such as aerial hyphae growth, fruiting body formation and morphological differentiation of the primordium. Although there are numerous reports that the hydrophobins result from stress-related biological or non-biological environment, but the biological functions such as cell division, differentiation and its regulation of signal transduction are still poorly understood. For example, the analysis on Schizophyllum commune genome and expression profile showed that in S.commune fruiting body development process, the expression of energy and hydrophobins related genes were higher in knot than the other stages. Besides, we found that the expression of hydrophobins Fv-Hyd1 were upregulated in knot and mycelium. We hypothesized that hydrophobin Fv-Hyd1 played an important role in aggregation in mycelium and primordia formation. Through the F. velutipes genome and transcriptome data, as well as the bioinformatics analysis, a gene coding hydrophobin Fv-Hyd1 encoded 131 amino acids, with 6 exons and 5 introns. Through physical and chemical properties, composition arrangement of cysteine C-X, protein tertiary structure and phylogenetic tree clustering analysis, it was showed that Fv-Hyd1 belongs to the type Ⅰ hydrophobins and is basidiomycetes-specific, which is different from the type Ⅱ hydrophobins (C-X9-C-C-X11-C-X16-C-X9 -C-C-X10-C-X6). By acquiring the upstream sequences of genes, combined with yeast genome database SDG, YEASTRACT database and fungal transcription factors database FTFD, the predicted genes potentially regulated transcription factor. bHLH transcription factor associated with changes in the morphology of the fungus (Rtg3) was selected as the candidate transcription factor. Combined with the real-time fluorescent quantitative PCR and the Pearson correlation coefficient, the results showed that there was a strong co-expression rule between Fv-Hyd1 and its potential transcription factor Fv-Rtg3 with a high expression in F. velutipes mycelium knot and fruiting body primordium formation. In addition, according to NetPhos 2.0 SERVIER phosphorylation sites prediction for Fv-Hyd1 and Fv-Rtg3 and the above expression of co-expression analysis data, we speculated the gene expression regulation mechanism of Fv-Hyd1.
Key words: Flammulina velutipes    knot    primordium    qRT-PCR    co-expression    Pearson correlation coefficient    

金针菇是营养丰富且味道鲜美的食用菌,具有较高的食药用价值,在我国及东南亚地区有着广泛的商业栽培。但是,金针菇的子实体形成和发育受到众多因素的影响,如转录因子、蛋白激酶、疏水蛋白及细胞色素等内部因素，和光照、温度及二氧化碳等环境因素,了解基因对影响因素在转录水平、翻译水平及环境刺激等所做出的反应,对于研究金针菇子实体生长发育的调控机制至关重要。

OHM，等[1]于2010年通过裂褶菌(Schizophyllum commune)的基因组和表达谱分析,发现在裂褶菌子实体生长发育过程中,菌丝扭结阶段与能量和疏水蛋白相关基因的上调表达。我们在分析金针菇不同生长发育阶段的表达谱时,发现疏水蛋白Fv-Hyd1在菌丝扭结阶段和原基期均上调表达,且较其他时期高表达,这与OHM，等[1]在裂褶菌上的研究结果基本一致。我们推测疏水蛋白Fv-Hyd1在金针菇菌丝凝集并促成原基形成中发挥重要的作用,通过金针菇生长发育过程实时荧光定量PCR进一步验证该基因的表达,并应用生物信息学方法和定量PCR筛选控制该基因表达的转录因子,以期为金针菇品种改良提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试菌株

金针菇异核体菌株H1123是由单核菌株W23和L11配对获得。W23的基因组数据、金针菇1123各发育时期的转录组数据均由福建省食用菌种质资源保藏与管理中心提供,W23菌株基因组数据已提交至DDBJ/EMBL/GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),登录号(accession No.)为APHZ00000000,文件编号(BioProject):191864。

1.1.2 总RNA的提取和cDNA合成

通过金针菇菌株H1123栽培瓶培育出菇,采样参照LIU，等[2]的方法,于栽培料面采集菌丝、菌丝扭结、菌皮、子实体原基、伸长期(菌柄、菌盖)和成熟期(菌柄、菌盖)。采用OMEGA E.Z.N.A.Plant RNA试剂盒(美国OMEGA-Tek公司)提取以上材料总RNA,使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Sythesis SuperMix for qRT-PCR试剂盒(北京全式金公司)合成互补DNA(cDNA),以上步骤菌按照说明书进行。

1.2 Fv-Hyd1基因结构及蛋白质生物信息学分析

通过金针菇转录组数据筛选,结合单孢菌株W23全基因组测序的注释数据,抽提该目的基因的DNA序列及编码序列(coding sequence,CDS),在NCBI进行蛋白质同源比对BlastP,将其命名为Fv-Hyd1。应用ZOOM软件[3]将基因组原始测序片段(reads)和转录组原始测序片段(reads)分别比对到Fv-Hyd1基因序列上,分析其基因结构(包括序列全长、内含子、外显子等),软件运行参数设定为:200～600 bp的相邻匹配序列(paired reads)距离、Illumina类型数据格式、碱基错配值为40,其余参数均为默认值,基于所得数据绘制基因图谱。

采用ProtParam(http://www.expasy.org/)分析蛋白质的分子质量大小、等电点等理化性质;蛋白质信号肽预测与分析采用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/);蛋白质跨膜结构分析采用TMHMM程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/);采用PSORT程序(http://psort.hgc.jp/form.html)对蛋白质亚细胞进行定位分析;蛋白质二级结构和三级结构则采用Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)进一步比较分析。在NCBI网站下载有代表性物种的疏水蛋白氨基酸序列,采用InterProtScan5(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan5/)对比其结构域位置及长度差异情况,并利用ClustalX进行同源比对,参数为默认值,以同源比对数据为基础,采用MEGA 5.0软件包(参数为bootstrap values 1000 resamplings)构建相应序列的邻接法(neighbor-joining，NJ)系统进化树。

1.3 Fv-Hyd1基因上游调控序列分析及转录调控因子

从金针菇W23菌株基因组注释数据抽提Fv-Hyd1基因的上游序列,通过酵母转录因子数据库YEASTRACT(http://www.yeastract.com/)获取转录因子结合的元件,采用Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)分析基因上游序列顺式作用元件的分布情况。结合酵母基因组数据库(Saccharomyces Genome Database,SDG)(http://www.yeastgenome.org/)和真菌转录因子数据库FTFD(fungal transcription factor database)(http://ftfd.snu.ac.kr/)获取金针菇同源转录因子。

1.4 Fv-Hyd1基因及其潜在的转录因子定量共表达分析

基于对Fv-Hyd1基因及其转录因子基因生物信息学分析结果,使用软件Premier 5.0进行实时荧光定量PCR引物设计,并选用磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为内参基因进行试验[4],引物(表 1)由上海生物工程有限公司合成。采用TransStart TOP Green qRT-PCR试剂,反应体系及程序严格采用2步法按照定量荧光定量试剂盒的使用说明书进行,退火温度设为59 ℃,循环数设为40,每个反应进行3个平行试验。相对表达量计算采用2-ΔΔCT法处理。

表1 荧光实时定量PCR所使用的引物 Table 1 Primers used for qRT-PCR in this study
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以皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)作为基因共表达关系的衡量指标,相关系数0.8～1.0为极强相关,0.6～0.8为强相关,0.4～0.6为中等程度相关,0.2～0.4弱相关,0.0～0.2极弱相关或无相关[5]。

2 结果与分析 2.1 疏水蛋白Fv-Hyd1基因结构分析

基于金针菇W23基因组注释得到一个编码疏水蛋白的基因Fv-Hyd1,基因全长1 304 bp,其中开放阅读框(ORF)665 bp、上游的5′非编码区(5′ UTR)188 bp和下游3′非编码区(3′ UTR)451 bp(图 1)。利用基因组原始测序片段(reads)对其gDNA序列进行检验,证明了该序列拼接完全正确。以验证后的基因序列作为参照(reference),利用ZOOM软件将转录组原始测序片段(reads)定位到参考序列上,检测到共有5个内含子和6个外显子。金针菇Fv-Hyd1基因的CDS可编码131个氨基酸,通过Interpro搜索鉴别含有Hydrophobin结构域,跨膜结构预测显示第78～93个氨基酸为跨膜肽段(图 2),属于具有跨膜结构的分泌蛋白。

图1 金针菇疏水蛋白Fv-Hyd1基因结构及其保守结构域 Fig. 1 Comparative analysis of gene structure and conserved domain in Flammulina velutipes hydrophobin Fv-Hyd1

图2 推测的Fv-Hyd1基因表达调控机制 Fig. 2 Putative regulation mechanism of Fv-Hyd1 expression
2.2 Fv-Hyd1的理化性质及半胱氨酸C-X组成排布比较分析

通过Fv-Hyd1与云芝(Trametes versicolor )疏水蛋白Tv-Hyd(XP_008037109.1)、密褐褶孔菌(Gloeophyllum trabeum) 疏水蛋白Gt-Hyd(XP_007870554.1)和异担子菌(Heterobasidion irregulare) 疏水蛋白Hi-Hyd(XP_009551529.1)进行理化性质在线分析预测比较,结果(表 2)所示。亚细胞定位预测定位于细胞外,它们均含有信号肽,预示其可能通过内质网-高尔基体途径,且通过信号肽切割位点剪切信号肽形成成熟的蛋白质,InterproScan 5结构域搜索结果显示保守结构域长度基本相同,由80个左右的氨基酸构成(图 1)。

表2 疏水蛋白理化性质比较分析 Table 2 Comparative analysis of physical and chemical properties of hydrophobins
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通过对它们的半胱氨酸组成排布进行分析,结果显示C-X组成排布基本一致,均属于Class Ⅰ型疏水蛋白(表 3),有别于Class Ⅱ型疏水蛋白的半胱氨酸排布C-X9-C-C-X11-C-X16-C-X9-C-C-X10-C-X6,但半胱氨酸间均采用C1-C6、C2-C5、C3-C4、C7-C8的方式形成4个稳固的二硫键。

表3 Class Ⅰ型疏水蛋白半胱氨酸C-X组成排布的比较分析 Table 3 C-X component arrangement analysis of Class Ⅰ hydrophobins
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2.3 疏水蛋白Fv-Hyd1蛋白结构分析

在Fv-Hyd1蛋白三级结构中,主要由2个邻近的β-折叠组成的核心β-桶(图 3,白色箭头),1个α-螺旋通过1个二硫键与β-桶表面相连,而另1个二硫键使得2条链在每个β-折叠内交联,使得二硫键在两端完全被桶结构束缚,因此结构非常稳定,形成结构紧凑的小分子疏水蛋白球状体,这与疏水蛋白基本结构一致。

白色箭头为核心β-桶.Fv:金针菇(F. velutipes);Tv:云芝(T. versicolor);Gt：密褐褶孔菌(G. trabeum)； Hi:异担子菌(H. irregulare);Hyd:疏水蛋白(hydrophobin). White arrow represent core beta barrel. 图3 疏水蛋白三级结构的比较分析 Fig. 3 Comparison of tertiary structure analysis of hydrophobins
2.4 金针菇Fv-Hyd1系统进化分析

通过NCBI、EBI数据库选择功能已明确的真菌小分子疏水蛋白基因进行分析,下载SC1(S. commune;EFJ03889.1)，SC3(S. commune;P16933)，SC4(S. commune;P16934)，SC6(S. commune;EFJ03369.1)，MPG1(Magnaporthe oryzae;P52751)，MPH1(M. grisea;O94196)，HCF1(Cladosporium fulvum;Q00367)，HCF4(Passalora fulva;O94202)，HCF5(P. fulva;O94203)，HCF6(P. fulva;Q9C2X0)，ABH1(Agaricus bisporus;P49072)，ABH2(A. bisporus;P49073)，ABH3(A. bisporus;O13300)，Pri2(Agrocybe aegerita;AAD41222.1)，RODA(Aspergillus fumigatus;P41746)，HFBI(Trichoderma reesei;P52754)，QID3(T. harzianum;P52755)，HFBⅡ(T. reesei;P79073)，CU(Ophiostoma ulmi;Q06153)，CRP(Cryphonectria parasitica;P52753)，MGP(M. grisea;O94196)，HYD4(Gibberella moniliformis;Q6YF29)，SRH1(T. harzianum;P79072)，POH1(Pleurotus ostreatus;O13502)，POH2(P. ostreatus;O13503)，POH3(P. ostreatus;O60048)，FBH1(P. Florida;CAA06192.1)，VMH1(P. ostreatus;DQ34039.1)，VMH2(P. ostreatus;KDQ22759.1)，VMH3(P. ostreatus;KDQ23304.1)，CoH1(Coprinopsis cinerea;CAA71652.1)，CoH2(C. cinerea;CAA71653.1)，CFTH1(Claviceps fusiformis;Q9UVI4)，EAS(Neurospora crassa;Q04571.1)等38个真菌的疏水蛋白氨基酸序列。

疏水蛋白通常是由第一和最后一个半胱氨酸之间的保守氨基酸序列上的比较[6],采用ClustalX和MEGA 5.0软件包的建立相应序列的邻接法(NJ)系统进化树进行聚类分析。结果显示(图 4),尽管疏水蛋白的结构具有很多共同特点,但其在氨基酸序列上的同源性较低,这与已报道文献结果一致[7]。金针菇疏水蛋白Fv-Hyd1与Ⅰ类疏水蛋白聚为同一分支,有别于Ⅱ类疏水蛋白,这与半胱氨酸组成排布分析结果一致。此外,我们不难发现Ⅰ类疏水蛋白同时存在于担子菌和子囊菌,表明丝状真菌的Ⅰ类疏水蛋白早于担子菌和子囊菌的分化就已经存在,且目前为止在担子菌并没有Ⅱ类疏水蛋白的发现。因此我们推测,Ⅱ类疏水蛋白产生于子囊菌和担子菌分离之后,并独立于Ⅰ类蛋白,鉴于Ⅰ类和Ⅱ类疏水蛋白两者之间的低相似性,则可能代表一种趋同进化的现象。迫使丝状真菌分化出子囊菌后,产生功能相同或相似于金针菇疏水蛋白Fv-Hyd1等Ⅰ类疏水蛋白的Ⅱ类疏水蛋白生活，以适应于相同的环境条件。此类趋同进化现象,在其他生物物种进化中同样存在。

红色为子囊菌疏水蛋白;黑色为担子菌疏水蛋白. Red color represents ascomycetes hydrophobins; black color represents basidiomycete hydrophobins. 图4 Fv-Hyd1系统发育进化分析 Fig. 4 Phylogeny analysis of Fv-Hyd1
2.5 金针菇Fv-Hyd1基因及其潜在的转录因子的磷酸化位点分析

在真菌中已经鉴定的37个家族转录因子[8],通过酵母YEASTRACT数据库在线预测分析结果显示,Fv-Hyd1基因上游调控序列共存在26类顺式作用元件,其中bHLH型转录因子(Rtg3)结合的顺式作用元件共5个。我们将酵母菌转录因子Rtg3在金针菇基因组中进行同源比对,将比对到的金针菇同源基因在真菌转录因子库再次进行同源搜索验证后,将其命名为Fv-Rtg3。对转录因子Fv-Rtg3的磷酸化位点进行分析,发现存在7类磷酸化位点(图 2)。

2.6 金针菇Fv-Hyd1基因及其转录调控因子的共表达分析

实时荧光定量PCR的结果(图 5)显示,以菌丝时期基因表达量为对照,Fv-Hyd1基因在菌丝扭结、菌皮和子实体原基形成期的表达量分别是菌丝的149.3倍、72.6倍和110.9倍,显著高于菌丝、伸长期(菌柄、菌盖)和成熟期(菌柄、菌盖)等阶段的Fv-Hyd1表达量,该结果说明Fv-Hyd1基因的表达与原基形成有关。

图5 Fv-Hyd1及其转录因子Fv-Rtg3表达变化规律 Fig. 5 Expression change law of Fv-Hyd1 and its transcription factor Fv-Rtg3

本研究筛选获得能结合在金针菇Fv-Hyd1基因上游调控序列的转录因子Fv-Rtg3,实时荧光定量检测结果显示(图 5),转录因子Fv-Rtg3与Fv-Hyd1基因具有紧密的共表达关系,在正常出菇生长发育过程中表达相关系数为0.816为极强程度相关,这一结果暗示着它们可能存在转录调控关系。

3 讨论

WESSELS，等[9]在研究裂褶菌(S. commune)子实体和气生菌丝形成时发现某些基因可以编码约100个氨基酸的蛋白。这类蛋白疏水性氨基酸含量较高,并且与细胞壁的疏水性有关,因而被命名为疏水蛋白。它的主要生物功能是降低水表面的张力,可以使真菌脱离水相[10],生长在湿润基质上的菌丝细胞壁表面是亲水性的,而气生菌丝表面的细胞壁和空气中传播的孢子是疏水性的,细胞壁表面的基本性质是由其分泌的疏水蛋白决定,可以降低生长基物的表面张力,因此可使真菌打破水-空气的接触面,从而形成气生菌丝[11]。正常细胞的细胞壁始终维持在一种动态平衡的状态下,以确保其能不断改变自身结构来适应细胞的生长或不同阶段的形态变化[12]。

金针菇疏水蛋白Fv-Hyd1的基因结构分析显示,其上游序列存在较多顺式作用元件,表明基因表达可受潜在的转导信号影响,并由通路中的转录因子协同调控,进而影响生物过程如细胞周期、新陈代谢以及对环境变化的应激反应等,如bHLH型转录因子调控着真菌的形态变化过程[13]。Fv-Hyd1属于小分子分泌蛋白,与其他真菌的疏水蛋白的蛋白分子质量差异较小且同源性低,但8个半胱氨酸残基形成的4个二硫键对维持蛋白结构稳定性具有重要作用。疏水蛋白的cys3-cys4环被破坏会削弱疏水蛋白组装小棒的形成,影响其疏水性[14],cys7-cys8形成的疏水性片段氨酸C-X涉及疏水蛋白吸附疏水性表面[15]。此外,二硫键以相反方向跨越整个蛋白分子,以产生有效的交联,有助于保持疏水蛋白的结构,产生高效稳定的蛋白质分子,有研究表明过甲酸可以把半胱氨酸氧化成碘基丙氨酸,从而破坏二硫键,使其丧失蛋白二级结构。

4 结论

根据本研究结果,通过Fv-Hyd1基因和Fv-Rtg3基因的共表达分析,推测Fv-Rtg3作为Fv-Hyd1潜在的转录因子调控Fv-Hyd1的表达,并协同Fv-Hyd1在金针菇在菌丝扭结及子实体分化中起着重要的作用,通过促进菌丝的凝集及异核体菌株核质交流,在原基形成过程中仍有较高的表达量，也表明与原基形成存在一定的相关性。此外，我们分析发现,Fv-Rtg3和Fv-Hyd1共同存在MAPK、PKG、CKI和CDK等4类磷酸化位点,进而我们推测了Fv-Hyd1基因的表达调控机制(图 2),当金针菇菌丝生长受到非生物胁迫刺激,信号受体将接收不同的外界信号,由相应的通路激酶(MAPK、PKG、CKI和CDK等)使Fv-Rtg3磷酸化激活其活性,这些激酶在细胞分化、形态和周期控制等方面发挥着重要作用[16],有助于启动Fv-Hyd1基因的转录和翻译并分泌至菌丝细胞壁减少子实体和孢子水分散失,且可能利于菌丝间紧密黏着参与金针菇菌丝凝集及原基形成的生物学过程,后期将通过基因功能验证加以佐证。

致谢: 此项工作得到国家食用菌品种改良中心福建分中心、福建省食用菌工程技术研究中心给予的大力帮助，谨致谢意。
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