2016, Vol. 42引用本文 |
| HPLC检测枇杷中氯吡脲含量的前处理方法 |  [PDF全文] |
2. 四川省农业厅植物检疫站,成都 610041
2. Plant Quarantine Station of Sichuan Agricultural Department, Chengdu 610041, China
氯吡脲(forchlorfenuron,CPPU),化学名称1-(2-氯-4-吡啶)-3-苯基脲,是一种广谱、多用途的植物生长调节剂,在葡萄、枇杷、西瓜、甜瓜、黄瓜和猕猴桃等作物上登记使用[1-4]。研究表明,氯吡脲属于低毒农药,无致畸、致突变作用,是一种风险低、相对安全的农药[5]。但是，过量接触氯吡脲,也存在安全隐患。美国环保署在《农药毒性确认和管理》中指出,人类过多接触氯吡脲会引起自身蛋白质代谢紊乱、轻度肺气肿及体形消瘦等病变[6]。因此,澳大利亚化学安全局提出,有必要对氯吡脲长期饮食安全性进行研究[7]。
开展氯吡脲在果蔬中的残留检测是研究氯吡脲安全性的重要环节。目前,氯吡脲的残留检测方法主要是高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)和液相色谱串联质谱法(HPLC-mass spectrometry,HPLC-MS)[8-9]。其中,HPLC具有操作简便、运行成本低廉、易于推广应用等特点,常用于氯吡脲的检测。在HPLC法残留检测中,不同样品对氯吡脲的干扰不同,其前处理方法亦差异较大,说明建立合适的样品前处理方法将直接影响到残留检测的准确度。
枇杷幼果期常使用氯吡脲作为果实膨大剂,但目前尚未有利用HPLC法检测枇杷中氯吡脲残留的相关报道。因此,本文以枇杷为对象,研究比较了基质分散固相萃取法和QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)法对枇杷果实中氯吡脲残留检测的影响,并以此为基础,进一步优化前处理方法,以便为建立HPLC法检测枇杷中氯吡脲残留量的分析方法提供依据。
1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 氯吡脲标准品氯吡脲标准溶液(100 mg/L,甲醇溶解):购自北京捷诚科远化工技术研究院。
1.1.2 枇杷样品枇杷(Eriobotrya japonica)空白样品:于2013年5月26日,采自成都温江(四川省农业厅隔离场内),生长过程及周围环境中均未施用氯吡脲。
1.1.3 仪器与试剂Agilent 1100高效液相色谱仪,配UV检测器;C18固相萃取小柱(500 mg/6-mL),购于济南博纳生物技术有限公司;N-丙基乙二胺 (primary secondary amine,PSA,40～60 μm),碳18(C18,40～60 μm),硅胶(silica,40～60 μm),中性氧化铝(alumina-N,40～60 μm),弗罗里硅土(Florisil,40～60 μm),均购于上海迈博瑞生物技术公司;甲醇(色谱纯),天津科密欧化学试剂;乙腈、丙酮、二氯甲烷、氯化钠、无水硫酸镁,均为分析纯，西陇化工试剂。
1.2 试验方法 1.2.1 HPLC色谱分析条件色谱柱Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相V(甲醇)∶V(水)=60∶40;柱温(30±1)℃;流速0.8 mL/min;检测波长262 nm;进样量20 μL。
1.2.2 氯吡脲标准品储备液的配制用甲醇将氯吡脲标准溶液分别稀释为0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.20 μg/mL、1.00 μg/mL和10.0 μg/mL标准储备液,-4 ℃储存,备用。
1.2.3 2种前处理方法对枇杷果实中氯吡脲提取的影响 1.2.3.1 枇杷空白样品加标精确称取2 kg(0.01 g)枇杷(空白)果肉,榨汁机匀浆,取1 kg匀浆于广口瓶中,添加0.5 mg/kg氯吡脲标准品,超声30 min,静置12 h,-4℃储存,备用。
1.2.3.2 基质分散固相萃取法提取枇杷果实中的氯吡脲提取和净化参考陈章玉，等[10]和胡江涛，等[11]的方法进行。精确称取1.50 g枇杷空白加标样品于研钵中,加入3 g无水亚硫酸钠,充分研磨后,移至底部塞有棉花的10-mL注射器中,轻轻压平。向装有样品的注射器中加入10 mL石油醚淋洗,弃去淋洗液,加入8 mL甲醇洗脱,收集洗脱液,在通风橱内吹干,甲醇溶解定容至2 mL,待测。
1.2.3.3 QuEChERS法提取枇杷果实中的氯吡脲1) 提取：参考王楠，等[12]的方法,精确称取4.00 g枇杷匀浆样品于50-mL离心管中,加入8 mL乙腈提取剂,超声振荡20 min。加入1 g无水硫酸镁和1 g氯化钠,摇匀,2 800 r/min漩涡5 min,静置20 min。2) 净化:取4 mL上清液于装有100 mg C18和50 mg无水硫酸镁的50-mL离心管中,摇晃1 min,10 000 r/min离心8 min,取上清液至25-mL烧杯中吹干,2 mL甲醇溶解,0.22 μm有机滤膜过滤,甲醇定容至2 mL,待测。
1.2.4 枇杷果实中氯吡脲回收率计算氯吡脲回收率/%=(加标试样峰面积×稀释倍数)/标样峰面积×100.
1.2.5 QuEChERS前处理方法优化 1.2.5.1 不同提取剂提取枇杷果实中氯吡脲精确称取4份8.00 g枇杷样品于50-mL离心管中,编号a、b、c、d,分别向4支离心管中加入提取剂。编号a为8 mL甲醇;编号b为8 mL丙酮和二氯甲烷体积比为4∶1的混合液;编号c为8 mL丙酮;编号d为8 mL乙腈。
各样品处理后均提取15 min,加入1 g无水MgSO4和1 g NaCl盐析脱水,取上清液,100 mg PSA净化3 min吹干,甲醇定容至2 mL,待测。
1.2.5.2 提取剂的不同用量和时间对氯吡脲的效果精确称取10份8.00 g枇杷样品于50-mL离心管中,编号a、b，…，j。编号a～d分别加入8 mL、16 mL、24 mL、32 mL提取剂,超声振荡15 min,其余操作相同;编号e～j各加入8 mL提取剂,分别超声振荡5 min、10 min、15 min、20 min、30 min和40 min,其余操作相同。每个处理重复3次,DPS软件采用邓肯新复极差法分析差异显著性。
1.2.5.3 盐析和脱水剂对氯吡脲回收率的影响精确称取8份8.00 g枇杷样品于50-mL离心管中,编号a、b、c、d、e、f、g、h提取剂提取后,分别按总量2 g比例为2∶3、1∶1、3∶2、4∶1加入无水硫酸镁和氯化钠,并在无水硫酸镁和氯化钠比例为1∶1基础上,总添加量改为1 g、3 g、4 g和5 g,其余操作均相同。每个处理重复3次,DPS软件采用邓肯新复极差法分析差异显著性。
1.2.5.4 不同净化剂净化效果及净化时间对氯吡脲回收率的影响精确称取8份8.00 g枇杷样品于50-mL离心管中,编号a、b，…，h,提取剂提取后,取上清液,分别加入吸附剂净化。编号a加入100 mg PSA;编号b加入100 mg C18;编号c加入100 mg硅胶；编号d加入100 mg中性氧化铝;编号e加入100 mg弗罗里硅土；编号f～h中各加入100 mg PSA,分别漩涡1 min、2 min、3 min和4 min,其余操作均相同。每个处理重复3次,DPS软件采用邓肯新复极差法分析差异显著性。
2 结果与分析 2.1 2种前处理方法对枇杷样品的净化效果2种前处理方法的净化剂均是C18,对枇杷空白加标样品的净化效果见图1和图2。
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| 图1 QuEChERS法处理枇杷加标样品色谱图 Fig. 1 Chromatography of spiked loquat sample extracted by QuEChERS method |
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| 图2 基质分散固相萃取法处理枇杷加标样品色谱图 Fig. 2 Chromatography of spiked loquat sample extracted by MSPD method |
从净化效果看,2种方法均能提取出氯吡脲,且氯吡脲峰附近杂峰较少,不会干扰氯吡脲的检测及定性和定量,都适合枇杷中氯吡脲的提取。
2.2 2种前处理方法对枇杷果实中氯吡脲回收率的影响2种前处理方法下氯吡脲的回收率见表1.结果表明,基质分散固相萃取法中氯吡脲的回收率为42%较低,变异系数(coefficient of variation，CV)为33%,超出残留检测要求范围。QuEChERS法处理枇杷果实,氯吡脲的回收率为114%,能有效地提取枇杷果实中残留的氯吡脲,且变异系数为10%,重现性较好。因此,选择QuEChERS法作为枇杷中氯吡脲残留分析的前处理方法,并对其进一步优化。
| 表1 2种前处理方法下氯吡脲的回收率 Table 1 Forchlorfenuron recoveries in two pretreatment methods |
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从HPLC图谱可以看出,氯吡脲的保留时间为12.167 min(图3),枇杷空白样品的本底值为0(图4)，由于氯吡脲是强极性化合物,比较了4种极性提取剂乙腈、甲醇、丙酮以及丙酮和二氯甲烷体积比为8∶2的混合液对枇杷果实中氯吡脲的提取效果，其中，甲醇因能溶解氯化钠，会破坏盐析与脱水过程，因此首先舍弃,其余3种提取剂均能提取出氯吡脲(图5),但乙腈的提取效果优于丙酮和丙酮与二氯甲烷的混合液,其对糖、脂肪和蛋白质等的溶解度较小,杂质对氯吡脲的干扰程度相对较小。因此，本实验选择乙腈作为枇杷中氯吡脲的提取剂。
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| 图3 氯吡脲标品液相色谱图(0.5 μg/mL) Fig. 3 Chromatogram of forchlorfenuron standard (0.5 μg/mL) |
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| 图4 枇杷空白样品液相色谱图 Fig. 4 Chromatogram for blank sample of loquat |
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| A:丙酮;B:V(丙酮)∶V(二氯甲烷)=4∶1;C:乙腈. A: acetone; B: V(acetone)∶V(dichloromethane)=4∶1; C: acetonitrile. 图5 不同提取剂提取枇杷加标样品液相色谱图(0.5 mg/kg) Fig. 5 Chromatogram of loquat spiked sample extracted by different extracting agents (0.5 mg/kg) |
研究不同提取剂用量和提取时间对枇杷果实中氯吡脲提取率的影响(图6和图7),结果表明,4个提取剂用量提取枇杷样品,氯吡脲回收率差异不显著,但在8 mL提取剂量下,样品混合物中提取剂量偏少,不利于提取后提取液的回收。故选择2倍(16 mL)提取剂提取枇杷果实中的氯吡脲。在提取时间上,20 min前,氯吡脲的回收率明显偏低,与20 min后氯吡脲回收率相比,差异显著;20 min后各时间段氯吡脲回收率差异均不显著,说明超声20 min即可将枇杷中的氯吡脲提取完全。
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| 图上相同小写字母表示在P>0.05水平差异无统计学意义。 Same lowercase letters above the bar diagram indicate no significant difference at the 0.05 probability level. 图6 不同体积提取剂下氯吡脲的回收率 Fig. 6 Forchlorfenuron recoveries in different volume of extracting agents |
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| 图上不同小写字母表示在P<0.05水平差异有统计学意义. Different lowercase letters above the line graph indicate statistically significant differences at the 0.05 probability level． 图7 不同提取时间下氯吡脲的回收率 Fig. 7 Forchlorfenuron recoveries in different extraction time |
枇杷果实中某些水溶性杂质会随水分被提取出来,干扰氯吡脲的检测。本实验研究了4组无水MgSO4和NaCl添加比例和5组添加总量对氯吡脲回收率的影响。结果(图8)表明,无水MgSO4和NaCl在质量比为3∶2时,氯吡脲的回收率最高。在此比例下,进一步研究添加总量对氯吡脲回收率的影响(表2),结果表明,添加1.0 g无水MgSO4和NaCl,氯吡脲的回收率(125%)过高,不符合残留检测的要求,并且脱水效果不佳,影响样品的风干;添加2.0、3.0、4.0和5.0 g无水MgSO4和NaCl时,氯吡脲的回收率均在95%～110%,但各添加量差异不显著。因此,按照质量比3∶2添加2.0 g无水MgSO4和NaCl,既可以有效除去样品中的水分,又能保证氯吡脲回收率符合残留检测标准。
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| 图8 无水MgSO4与NaCl不同比例下氯吡脲的回收率 Fig. 8 Forchlorfenuron recoveries in different proportions of anhydrous magnesium and sodium chloride |
| 表2 无机盐不同总量下氯吡脲的回收率 Table 2 Forchlorfenuron recoveries in different total inorganic salts |
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枇杷果实中糖、脂肪和维生素含量较高,若不净化,会堵塞色谱柱,降低柱效,同时干扰氯吡脲的检测。PSA用于除去糖类、脂肪酸和亲脂性色素等极性杂质,C18对维生素等非极性组分具有较好的吸附性,因此考察了PSA和C18在质量比为1∶1、2∶1和3∶1的处理条件下对枇杷果实的净化效果,结果见图9。当PSA和C18质量比为1∶1和2∶1时,对枇杷的净化效果较好,基本无杂峰干扰,明显优于质量比为3∶1。在此基础上,研究了吸附时间对氯吡脲回收率的影响。研究结果(表3)表明,吸附时间过长或过短,都会造成氯吡脲回收率偏高或偏低,当PSA与C18质量比为1∶1,净化3 min时,氯吡脲的平均回收率为102%,且与其他处理差异显著,符合残留检测要求。
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| A： m(PSA)∶m(C18)=1∶1； B： m(PSA)∶m(C18)=2∶1; C： m(PSA)∶m(C18)=3∶1. 图9 不同比例PSA和C18的净化效果 Fig. 9 Fig. 9 Purifying effect of different proportions of PSA and C18 |
| 表3 不同净化时间对回收率的影响 Table 3 Effects of different purification time for recovery |
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通过对QuECHERS方法的优化,得到QuECHERS的最佳条件:精确称取8.00 g枇杷样品至50-mL离心管中,加16 mL乙腈,超声20 min,加1.2 g无水MgSO4和0.8 g NaCl,旋涡5 min,静置30 min。取12 mL上清液,转入装有100 mg无水MgSO4、75 mg PSA和75 mg C18的离心管中,漩涡3 min,10 000 r/min离心8 min,上清液吹干,甲醇溶解,0.22 μm微孔滤膜过滤,甲醇定容至2 mL。在此条件下,进一步对该方法的线性范围及检出限、准确度和精密度进行验证。
2.4.1 方法的线性范围及检出限以氯吡脲的峰面积y为纵坐标,质量浓度x为横坐标,得到线性回归方程为y=192.307 6x-2.927 9(r=0.999 99),表明氯吡脲在质量浓度0.02～10.0 μg/mL的时候具有良好的线性关系。本试验条件下,根据信噪比(S/N)=3的峰响应值和样品前处理的稀释倍数,得出方法的检出限(LOD)为0.007 mg/kg。
2.4.2 方法的准确度和精密度在枇杷空白样品中添加3个不同质量分数氯吡脲标准品(低、中、高3个),进行准确度和精密度实验,结果见表4。从表4可以看出,本方法在3个添加水平下,氯吡脲的平均回收率在81%～92%之间,变异系数在3.1%～4.8%之间,表明本方法符合痕量分析的准确度和精密度要求,且分析误差与氯吡脲的残留水平无明显相关性。
| 表4 氯吡脲添加回收率 Table 4 Spiked recoveries of forchlorfenuron |
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高效液相色谱法具有操作简便、运行成本低、容易推广应用等特点,是农药残留检测中常用的检测方法。但在高效液相法检测中,对样品前处理要求较高,多数植物样品都需要净化,以免杂峰干扰检测。目前对于植物样品中氯吡脲的提取净化方法,因植物样品不同,其方法也不尽相同,其中以基质分散固相萃取法和QuEChERS法较为常用。如毛建霏，等[13]以分散固相萃取-高效液相色谱法(DSPE-HPLC)快速测定了豆芽中氯吡脲的残留,缩短前处理时间,降低了检测成本,适合大批量样品的快速处理。BANERJEE，等[14]用QuEChERS法处理了葡萄样品中包括氯吡脲在内的82种农药,大部分药剂的回收率达70%～120%。SHI，等[15]以QuEChERS法提取净化了柑橘、苹果和葡萄中的5种植调剂,氯吡脲的回收率均在80%～110%,且变异系数均小于5%。本文比较了基质分散固相萃取法和QuEChERS法2种前处理方法对枇杷果实中氯吡脲提取效果和回收率的影响,发现基质分散固相萃取法虽能达到较好的净化效果,但氯吡脲回收率较低。QuEChERS法对枇杷样品净化效果较好,氯吡脲的回收率符合残留分析要求,同时操作简单,节约溶剂,耗时少。因此,可将QuEChERS法作为枇杷中氯吡脲残留分析的前处理方法。
在样品的提取净化中,不同的提取净化条件也因样品的不同而有明显的区别。如HU，等[16]在进行西瓜中氯吡脲的残留量测定时,采用酸化乙腈提取,氨基柱净化;KOBAYASHI，等[17]在测定农产品中氯吡脲残留量时,采用丙酮提取,ChemElut柱、Oasis HLB和Bond Elut PSA双柱净化。本文通过比较QuECHERS前处理中各条件对枇杷果实中氯吡脲回收率的影响及提取效果,进一步优化了枇杷果实中氯吡脲残留分析的前处理方法,该方法经验证氯吡脲回收率稳定在80%～100%之间,变异系数为3.1%～4.8%。说明构建的前处理方法能够达到残留检测的要求。研究结果将为枇杷中氯吡脲的残留检测提供一条新的途径。
4 结论研究了枇杷中氯吡脲残留分析的前处理方法。结果表明QuEChERS法可有效净化枇杷中的杂质对氯吡脲检测的影响,氯吡脲回收率稳定可靠。进一步优化了QuEChERS法,优化条件为:16 mL乙腈提取8 g枇杷果实20 min,无水硫酸镁和氯化钠比例为3∶2的盐析脱水,PSA和C18比例为1∶1净化3 min。
致谢: 此项工作得到四川省农业厅植物检疫站隔离场为本实验提供枇杷空白样品,特此致谢。| [1] |
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