病原物对自然界中的各种生物都会产生威胁，而每种生物都拥有自己的免疫系统，可以抵御病原物的侵害。在长期进化过程中，昆虫发展出了一套独特的免疫系统，即细胞免疫和体液免疫，通过它们的协同作用对入侵体内的病原物做出相应的免疫防御反应^[1]。血细胞是细胞免疫的主要执行者，在昆虫防御外来病原物侵袭的过程中起着重要作用，其免疫防御机制一直为学者们所关注^[2]。已有研究表明，当病原物侵入昆虫体内，血细胞通过血淋巴循环接触病原物，对它们进行吞噬，形成小结，凝集成瘤或包被^{[3, 4]}。然而在免疫反应中，病原物会产生一些毒素伤害血细胞，引起血细胞形态、数量及比例等发生一定的变化，如苏云金杆菌感染印度谷螟幼虫后，其血淋巴中血细胞受到破坏，多数血细胞出现空泡和变形，珠血细胞珠粒之间互相脱离，细胞膜破裂，细胞质外流，囊血细胞则有细胞外溢现象^[5]；感染大链壶菌后，致倦库蚊幼虫浆血细胞和粒血细胞比例明显增加，原血细胞比例下降，在感染后96和120 h，原血细胞比例相对增加，珠血细胞和类绛血细胞所占比例越来越大，浆血细胞与粒血细胞比例相对减少，并且浆血细胞发生空泡、细胞变形等病理变化^[6]。深入研究昆虫血细胞免疫反应可以为开发微生物杀虫剂提供科学依据，虽然这方面的研究已有一些报道，但是昆虫种类繁多，不同种类的昆虫参与免疫的血细胞种类可能不同，对外来入侵生物的细胞免疫反应也不尽相同^[2]。因此，还需深入研究更多种类昆虫的血细胞免疫反应，探讨其血细胞免疫功能和作用机制，从而为害虫生物防治提供理论指导。

金银花尺蠖(Heterolocha jinyinhuaphaga Chu)是近年来新发现的在金银花上的主要食叶害虫之一，该虫为鳞翅目尺蛾科昆虫，别名拱腰虫，常造成金银花大面积减产，甚至成片死亡，给金银花生产带来严重损失。目前，国内对金银花尺蠖的研究主要集中于其生物学特性及防治上^{[7, 8]}，而对其血细胞免疫反应的研究尚未见报道。笔者在前期研究中已对金银花尺蠖幼虫血细胞的形态进行了观察，发现金银花尺蠖幼虫血淋巴中有原血细胞、浆血细胞、粒血细胞、珠血细胞、类绛血细胞和囊血细胞6 种类型的血细胞^[9]。在此基础上，本研究对大肠埃希菌感染后金银花尺蠖血细胞变化进行观察，以明确参与免疫反应的细胞类型，为探讨其血细胞免疫功能和作用机制，开发微生物杀虫剂防治该虫提供科学依据。

供试虫源：金银花尺蠖幼虫采集于安徽省明光市三界镇野生金银花上，带回后在人工气候箱(RXZ-288A型，浙江宁波江南仪器制造厂)中用新鲜的金银花叶片饲养，光周期为昼夜比14 h/10 h，温度(25±1) ℃、相对湿度(70±7)%。选取大小一致的健康5龄幼虫作为试验材料。

供试菌种：大肠埃希菌(Escherichia coli)ATCC25922由滁州学院微生物学实验室提供。

主要试剂：胰蛋白胨(山东青岛高科园海博生物技术有限公司)、酵母抽提物(湖北安琪酵母股份有限公司)、Wright染料(Sigma公司，美国)、Giemsa染料(AppliChem公司，德国)。

大肠埃希菌ATCC25922用LB(Luria-Bertani)培养基在37 ℃下扩大培养至对数期，收集培养物，以2 000 r/min离心10 min，去上清液，取沉淀用无菌水制成1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷和1×10⁸个/mL菌悬液待用。

用微量注射器吸取不同浓度的大肠埃希菌菌悬液3 μL，从幼虫腹部注入后，重新放入人工气候箱中用金银花叶片饲养。参考晏容等^[3]的方法，分别于感染后3、6、12和24 h收集血淋巴，采用血球计数板于显微镜下观察血细胞总数的变化。取各时间段的血淋巴制成涂片，经Wright-Giemsa 染色，置于光学显微镜(XSG-109L型双目生物显微镜，上海精密仪器公司)下观察10个视野的血细胞并分类计数，了解各种血细胞数量及形态变化。以15只幼虫为1组，同时以注射无菌水的幼虫作为对照组，实验重复3次。

采用SPSS 11.5软件进行数据处理和统计学分析。

大肠埃希菌感染后，金银花尺蠖幼虫血细胞聚集成堆(图 1A)，形成集结和包囊，以浆血细胞和粒血细胞为主。6 h后参与反应的部分血细胞发生变形、破裂、核移位以及胞质出现空泡等变化，如浆血细胞失去其光滑完整的轮廓，形成皱褶或扭曲的外缘，细胞核偏向一侧，胞内出现大小和数目不等的空泡(图 1B)；粒血细胞也出现变形和不同程度的空泡(图 1C)；囊血细胞表面失去光滑完整的外部轮廓，外缘扭曲，凹凸不平，细胞表面破裂，细胞物质外流，细胞核向外溢出，细胞质疏密不均(图 1D)。

图1(Figure 1)

A:血细胞聚集成堆(100×); B:浆血细胞(640×); C:粒血细胞( 640×); D:囊血细胞(400×). A: Aggregation of hemocytes (100×); B: Plasmatocytes (640×); C: Granulocytes (640×); D: Cystocytes (400×). 图1 大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫的血细胞形态变化 Fig. 1 Morphological variation of hemocytes of H. jinyinhuaphaga Chu larva infected by E. coli

从表 1中可以看出：分别感染1×10³~1×10⁸个/mL大肠埃希菌菌悬液后，金银花尺蠖幼虫血细胞总数较对照组均有显著增加，并且随着浓度的增大而不断增加，各浓度间的差异达统计学上的显著水平(P < 0.05)；在感染后3、6和12 h范围内，随着时间延长血细胞总数不断增加，12 h时达最高水平，分别比对照增加17 478.52、20 330.77、23 189.48、25 888.51、29 434.62和34 044.06个/μL，各时间段的差异达统计学上的显著水平(P < 0.05)，感染24 h之后血细胞总数开始下降。

表1(Table 1)

表1 大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫血细胞总数的变化 Table 1 Total number variation of hemocytes of H. jinyinhuaphaga Chu larva infected by E. coli indiv./μL

表1 大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫血细胞总数的变化 Table 1 Total number variation of hemocytes of H. jinyinhuaphaga Chu larva infected by E. coli indiv./μL 大肠埃希菌浓度Dosages of E. coli/(indiv./mL) 3 h 6 h 12 h 24 h 1×10 3 21 057.67±939.33eC 25 454.53±875.13fB 28 562.39±983.05fA 27 582.65±1 023.89fA 1×10 4 23 127.75±709.20dD 27 876.61±513.16eC 31 477.64±757.77eA 29 092.55±535.62eB 1×10 5 24 646.43±762.73cdC 30 583.81±840.34dB 34 336.35±1 066.86dA 32 074.31±868.14dB 1×10 6 25 824.39±570.57cC 34 984.25±787.50cB 37 035.38±1 167.23cA 34 989.42±399.12cB 1×10 7 27 772.42±901.98bC 37 958.47±817.02bB 40 581.49±781.06bA 38 632.77±458.72bB 1×10 8 29 807.63±504.09aC 42 688.28±410.15aB 45 190.93±696.02aA 43 413.88±655.66aB CK 10 339.33±288.20fB 10 745.44±226.81gAB 11 146.87±457.58gA 11 027.48±177.69gAB 表中数据为平均值±标准差；同列数据后的不同小写字母和同行数据后的不同大写字母均表示在 P < 0.05水平差异有统计学意义。 Data shown are means ± standard deviation. The values followed by different lowercase letters in the same column and ones followed by different capital letters in the same row both represent statistically significant differences at the 0.05 probability level.

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大肠埃希菌感染后不同时间金银花尺蠖幼虫各类血细胞比例呈现不同的变化(表 2)。3 h时原血细胞的比例明显减少，并且随着浓度的增加明显减少，显著低于对照；随着时间的延长，原血细胞的比例不断下降，12 h时最低，分别比对照下降了14.51%、16.38%、18.05%、19.66%、21.38%和22.82%，各时间段之间的差异达统计学上的显著水平(P < 0.05)；24 h时原血细胞数量又开始回升。感染后3 h，浆血细胞、粒血细胞、珠血细胞、类绛血细胞、囊血细胞的比例相对增加，其中，浆血细胞、粒血细胞和珠血细胞的比例显著高于对照(P < 0.05)，而类绛血细胞和囊血细胞的比例与对照差异无统计学意义(P>0.05)；随着时间的延长，这5种血细胞的比例不断上升，6 h时与对照的差异均达统计学上的显著水平(P < 0.05)；在12 h时达到最高，与对照相比，浆血细胞的比例增加了4.28%、4.77%、5.11%、5.25%、5.41%和6.64%，粒血细胞的比例增加了4.34%、4.62%、4.94%、5.20%、5.43%和5.78%，珠血细胞的比例增加了1.72%、1.24%、2.63%、3.14%、3.92%和4.30%，类绛血细胞的比例增加了2.00%、2.29%、2.55%、3.00%、3.26%和4.44%，囊血细胞的比例增加了2.17%、2.56%、2.82%、3.07%、3.36%和3.66%；浆血细胞、粒血细胞、囊血细胞在各时间段的比例差异有统计学意义(P < 0.05)，而珠血细胞和类绛血细胞差异无统计学意义(P>0.05)；这5种血细胞的比例在24 h时又开始下降。

表2(Table 2)

表2 大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫各类血细胞的比例变化 Table 2 Proportion variation of each hemocyte of H. jinyinhuaphaga Chu larva infected by E. coli%

表2 大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫各类血细胞的比例变化 Table 2 Proportion variation of each hemocyte of H. jinyinhuaphaga Chu larva infected by E. coli% 血细胞Hemocytes 大肠埃希菌浓度Dosages of E. coli/(indiv./mL) 3 h 6 h 12 h 24 h 原血细胞Prohemocyte 1×10 3 38.29±1.76abA 31.09±1.74bB 22.74±1.12bC 24.24±0.68bC 1×10 4 35.90±2.23bcA 29.15±0.84bcB 20.87±0.55bcC 22.85±0.62bC 1×10 5 33.74±3.23cdA 27.18±1.54cB 19.20±0.86cdC 21.13±1.46cC 1×10 6 31.50±1.50deA 25.01±1.14dB 17.59±0.75deC 19.21±0.65dC 1×10 7 29.37±2.86efA 23.37±0.72dB 15.87±0.93efC 17.31±0.78eC 1×10 8 26.78±2.96fA 21.32±0.83eB 14.43±1.65fC 16.35±1.04eC CK 40.56±2.67aA 39.19±0.94aA 37.25±1.80aA 38.68±0.83aA 浆血细胞Plasmatocyte 1×10 3 17.12±1.29aB 19.21±0.84bB 21.85±0.69aA 21.54±1.52bA 1×10 4 17.34±1.36aC 19.55±1.32abB 22.34±0.56aA 21.85±0.71abA 1×10 5 17.88±1.52aC 19.98±1.27abBC 22.68±1.23aA 22.32±0.46abAB 1×10 6 18.45±2.07aB 20.47±0.83abAB 22.82±1.28aA 22.54±0.49abA 1×10 7 19.32±1.11aB 20.84±0.89abB 22.98±0.85aA 22.71±0.59abA 1×10 8 20.36±2.12aB 21.19±1.04aAB 23.21±1.23aA 22.87±0.75aAB CK 16.87±3.49bA 17.24±0.62cA 17.57±0.92bA 17.18±0.61cA 粒血细胞Granulocyte 1×10 3 15.31±1.16abC 16.93±0.72cB 19.87±0.66aA 19.58±0.46aA 1×10 4 16.18±1.86abC 17.54±1.22bcBC 20.15±0.86aA 19.71±0.63aAB 1×10 5 16.63±1.31abBC 17.89±0.77abcB 20.47±1.24aA 19.97±0.82aAB 1×10 6 17.15±1.37abC 18.52±1.15abcB 20.73±0.89aA 20.42±0.81aA 1×10 7 17.56±2.22abB 19.07±0.81abAB 20.96±0.83aA 20.71±1.06aA 1×10 8 18.27±1.62aB 19.68±1.12aAB 21.31±1.19aA 20.83±0.79aA CK 14.73±2.10bA 15.15±0.94dA 15.53±0.77bA 15.14±1.03bA 珠血细胞Spherulocyte 1×10 3 13.49±1.14bcA 14.33±1.77bcA 15.14±0.82cA 14.86±0.73dA 1×10 4 14.17±0.50bcA 14.87±0.75abcA 15.56±1.25cA 15.41±1.20cdA 1×10 5 14.68±1.25bcA 15.64±1.32abcA 16.05±0.84bcA 15.77±0.65bcdA 1×10 6 15.23±0.56bcA 16.23±1.56abA 16.56±1.15abcA 16.33±0.46abcA 1×10 7 15.73±0.83abA 16.74±0.59abA 17.34±0.58abA 17.11±1.13abA 1×10 8 16.21±2.23aA 17.35±1.88aA 17.72±0.86aA 17.33±0.85aA CK 12.65±2.08cA 13.04±1.89cA 13.42±0.75dA 13.16±0.58eA 类绛血细胞Oenocytoid 1×10 3 5.92±1.19aA 7.13±1.57abA 7.68±1.12abA 7.33±0.88abA 1×10 4 6.17±0.88aA 7.46±1.25aA 7.97±0.85abA 7.63±0.51abA 1×10 5 6.53±1.11aA 7.69±0.82aA 8.23±1.11abA 7.85±0.76aA 1×10 6 6.85±0.60aA 7.96±0.71aA 8.68±0.79abA 8.35±0.46aA 1×10 7 7.01±0.66aA 8.04±1.20aA 8.94±0.71aA 8.61±1.16aA 1×10 8 7.22±1.91aA 8.37±0.81aA 9.12±0.89aA 8.86±1.21aA CK 5.63±1.01aA 5.17±0.54bA 5.68±0.79bA 5.49±0.91bA 囊血细胞Cystocyte 1×10 3 9.87±1.22aB 11.31±1.04abAB 12.72±0.66abA 12.45±0.58aA 1×10 4 10.24±0.93aB 11.43±0.54abAB 13.11±0.87abA 12.55±1.32aA 1×10 5 10.54±0.91aB 11.62±1.39abAB 13.37±1.16abA 12.96±0.83aA 1×10 6 10.82±0.66aC 11.81±0.59abBC 13.62±1.17abA 13.15±0.37aAB 1×10 7 11.01±0.78aB 11.97±0.74abB 13.91±0.86aA 13.55±0.88aA 1×10 8 11.16±1.63aB 12.09±0.88aAB 14.21±0.90aA 13.76±0.73aA CK 9.56±2.29aA 10.21±1.05bA 10.55±0.72bA 10.35±0.48bA 表中数据为平均值±标准差；同列数据后的不同小写字母和同行数据后的不同大写字母均表示在 P < 0.05水平差异有统计学意义。 Data shown are means ± standard deviation. The values followed by different lowercase letters in the same column and ones followed by different capital letters in the same row both represent statistically significant differences at the 0.05 probability level.

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昆虫血细胞是其细胞免疫的主要执行者，当病原性物质进入昆虫体内可引起血细胞数量、形态等发生一定的变化。笔者用大肠埃希菌感染金银花尺蠖幼虫后，观察到血细胞聚集成堆，形成集结和包囊，部分血细胞发生变形、破裂、核移位以及胞质出现空泡等变化。这与已有的研究结果^{[3, 5]}一致。

本实验还发现大肠埃希菌感染后不同时间金银花尺蠖幼虫血细胞总数较对照组均有显著增加，在感染后3、6和12 h范围内，随着时间延长血细胞总数不断增加，12 h时达最高水平，24 h之后血细胞总数开始下降。这与其他昆虫不太一致，如晏容等^[3]报道，感染大肠埃希菌8 h后家蝇血淋巴细胞总数升高至最高水平，之后呈下降趋势；莫非等^[6]报道，感染大链壶菌后致倦库蚊幼虫血淋巴细胞的总数在72 h升高至最高水平，之后呈下降趋势。这可能是由于不同种类的昆虫血细胞免疫反应速度不一致所引起的。研究表明，造血器官的制造、血细胞的分裂增殖及固着血细胞的释放都可以引起昆虫血细胞总数的增加^[4]，但造血器官制造血细胞和血细胞分裂增殖的速度都比较慢，难以在短时间内产生大量的血细胞。因此，推测大肠埃希菌感染后幼虫血细胞总数的增加，可能是由于幼虫在受到免疫刺激后很快释放出固着的血细胞参与免疫反应，而后期血细胞数量的增加可能是造血器官的制造及血细胞分裂增殖的结果。随着感染时间的延长，大量的血细胞参与免疫反应而被消耗掉，使得所消耗的血细胞数量多于所产生的血细胞数量，从而引起血细胞总数下降^[4]。

大肠埃希菌感染后金银花尺蠖幼虫各类血细胞比例呈现不同的变化。3 h时原血细胞的比例明显减少，随着时间的延长，比例不断下降，12 h时降至最低水平，24 h之后开始回升；而浆血细胞、粒血细胞、珠血细胞、类绛血细胞、囊血细胞的比例相对增加，12 h时升至最高水平，24 h之后开始下降，浆血细胞、粒血细胞、囊血细胞在各时间段的比例差异显著，而珠血细胞和类绛血细胞差异不显著。这说明浆血细胞、粒血细胞、囊血细胞是免疫反应的主要参与者，在抵御病原物感染过程中发挥了重要作用。在感染早、中期，金银花尺蠖幼虫体内诱发了明显的免疫反应，诱导这3类血细胞大量地增殖和释放，比例明显增加，到了感染晚期，原血细胞的分化和增殖功能减弱，浆血细胞、粒血细胞、珠血细胞、类绛血细胞、囊血细胞比例则相对减少。晏容等^[3]的研究表明，浆血细胞和粒血细胞是家蝇体内免疫反应的主要参与者，大肠埃希菌感染后4、8和16 h，家蝇浆血细胞和粒血细胞比例明显增加，而珠血细胞在感染后各时间段的比例均明显减少，原血细胞和类绛血细胞比例则无明显变化。这进一步说明不同种类的昆虫体内参与免疫反应的血细胞种类及数量变化不尽一致。

总之，大肠埃希菌感染金银花尺蠖幼虫后引起幼虫血细胞的形态、数量及各类细胞的比例都发生了相应的变化，显示幼虫体内发生了一定程度的免疫防御反应。血细胞既是细胞免疫反应的执行者，又是体液免疫因子的提供者。体液因子可以在血细胞中合成并释放，参与异物的杀灭、清除。关于血细胞与体液因子在免疫中的关系有待进一步深入研究。