镉能经食物链的生物富集和生物放大作用毒害高等动物^{[1, 2]}，因而受到广泛关注。近年来的研究表明，植物非必需营养元素镉也具有植物毒性。镉能抑制光合作用^[3]、破坏呼吸系统和造成营养代谢紊乱^{[2, 4, 5, 6, 7]}，从而影响植物生长，导致植物死亡。水稻是我国主要粮食之一，在稻田生态系统中，不仅土壤重金属镉会对水稻产生毒害作用，有时植物必需微量元素铁也可能威胁水稻生长^{[8, 9, 10, 11]}。长期淹水的稻田土壤因处于厌氧状态而积累大量亚铁，植物吸收过多亚铁将会出现代谢失调、营养紊乱^[8]、光合作用能力降低^{[9, 10]}等一系列中毒现象，致使作物减产甚至死亡。铁和镉具有重叠的生理功能影响区^[12]，它们均在植物光合作用系统、氧化还原系统、营养代谢系统发挥作用，因而在现实条件下它们对水稻生长的影响可能存在交互作用^[13]。有研究表明，植株对镉的吸收与环境中铁的状态和含量有关^[6,14]。

镉及过量亚铁造成的植物毒害主要是产生活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)^{[6, 8, 11]}。活性氧会造成植物氧化性损伤，破坏脂质、蛋白质、核酸等生物大分子^[15]。植物自身的抗氧化酶系统，可以清除活性氧自由基(ROS)^[2]，从而减少氧化性损伤。其中，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)可以将超氧阴离子(·O₂^-)歧化成H₂O₂和O₂^[2,16];过氧化物酶(peroxidase，POD)以愈创木酚为电子受体，利用H₂O₂氧化植物体内有机物或无机物^[2]。丙二醛(malondialdehyde，MDA)是植物膜脂质过氧化的产物^[15]，可代表生物膜的损伤程度，是检验氧化胁迫重要指标之一^[2]。研究表明，植株通过增加SOD、POD活性来抵御亚铁毒害^[10,17]，但长期或过量亚铁胁迫也会使SOD、POD活性受到抑制^{[17, 18]}。镉也会对水稻抗氧化酶系统产生影响，但文献所述的影响并不一致^{[2, 7, 19, 20]}。如SHAH等^[2]认为镉会造成水稻脂质过氧化，刺激SOD和POD活性；CHIEN等^[7]研究表明镉刺激水稻叶片中POD活性，但抑制了SOD活性；邵国胜等^[15]则认为镉能增加MDA含量，却抑制了SOD和POD活性。镉对植株抗氧化酶系统的影响可能与不同品系植株本身、生长时期及处理条件相关。

土壤在厌氧环境下，水稻根际释放的氧气和氧化剂可以将Fe²⁺氧化成Fe³⁺，铁的氧化物或氢氧化物将附着于根表，形成根膜^[5,21]。根膜可以吸附、共沉淀多种元素^{[21, 22]}，进而影响这些元素在根际的含量和植物可用性，改变植株对它们的吸收迁移能力^{[23, 24]}。研究表明，水稻根际膜能影响镉的吸收迁移，可以减少^[5,23]或增加^[1,24]植株对镉的吸收，这可能与植株品系、根际膜厚度和植株生长时期等因素相关^[5,23]。

《全国土壤污染状况调查公报》显示我国土壤镉污染较为严重，镉米仍有可能成为粮食安全的隐患^{[25, 26]}。调查表明我国南方水稻土中有大量亚铁累积^[27]，在实际水稻种植条件下，土壤亚铁会对镉的毒害作用产生影响。以往研究多集中于2种金属的单独作用，虽然也有通过水培试验分析其交互作用^{[15, 16, 17, 18, 19, 20, 26]}，但水培条件与实际土壤状况差异较大。因此，本试验将通过盆栽模拟水稻实际生长环境，研究在南方土壤中亚铁含量较高的条件下，以对金属有一定富集量且抗氧化酶系统受植株衰老影响较小的孕穗期的水稻为研究对象，探讨含大量亚铁的南方潜育型土壤中铁、镉对水稻部分抗氧化酶活性，及铁、镉吸收的影响。从而为探索实际生产过程中水稻重金属胁迫的机制提供一定的理论基础。

盆栽试验在浙江大学农业试验站网室内进行。供试水稻品种为杭43(单季稻)，水稻秧苗来自杭州市农业科学研究院。供试土壤采自杭州市华家池稻田(长期种植的水稻田)，为0~20 cm耕层土壤，土壤基本理化性质如表1。

表1(Table 1)

表1 供试土壤基本理化性质及重金属含量Table 1 Characteristics of the paddy soil used in pot experiment

表1 供试土壤基本理化性质及重金属含量Table 1 Characteristics of the paddy soil used in pot experiment pHH2O w(有机质)Organic matter/ (g/kg) w(有效态磷)Effective P/(mg/kg) w(总氮)Total N/(g/kg) w( 总铁)Total Fe/(g/kg) w(亚铁)Fe2+/(g/kg) w(全镉)Total Cd/(mg/kg) 6.09 5.85 52.44 0.78 2.146 0.577 0.413

点击放大

将自然风干并过2 mm筛的稻田土壤，按每桶7.5 kg干土装入桶中。试验采用随机分组的方式，设置4个土壤Fe²⁺水平F₁、F₂、F₃和F₄(外源加入亚铁量分别为0 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg和400 mg/kg);2个Cd²⁺水平C₀，C₁(外源加入总镉量分别为0 mg/kg，5 mg/kg)，共8个处理，每个处理3个重复(共24个桶)。根据每种处理所要求的亚铁及镉含量，以硫酸亚铁和硫酸镉溶液的形式拌入土壤，混合均匀。将处理过的土重新装入桶中，淹水(水面超过土面约1 cm) 钝化培养1个月。土壤添加亚铁和镉处理后每种处理土壤总亚铁和镉含量见表2。水稻种植为每桶3穴，每穴2株水稻(144株水稻)。

表2(Table 2)

表2 盆栽试验中土壤金属含量Table 2 Metal contents in different treatments of soil in experimentw/(mg/kg)

表2 盆栽试验中土壤金属含量Table 2 Metal contents in different treatments of soil in experimentw/(mg/kg) w/(mg/kg) 镉处理Cd treatment 亚铁处理Ferrous treatment Fe2+ Cd2+ C0 F1 577 0.413 F2 677 0.413 F3 777 0.413 F4 977 0.413 C1 F1 577 5.413 F2 677 5.413 F3 777 5.413 F4 977 5.413

点击放大

每盆水稻施入尿素225 kg/hm²(以纯氮计)并分别以225 kg/hm²和75 kg/hm²的量施入磷肥(过磷酸钙)，钾肥(氯化钾)。每盆土表面积为0.049 m²，土深为25 cm。每盆施入尿素、过磷酸钙和氯化钾的量分别为1.103 g、1.102 g和0.367 g。

在水稻孕穗期(移栽后51 d)采集水稻顶部3片完全展开叶片，在液氮环境下研磨，并用pH 7.8的磷酸缓冲液提取叶片中所需测定生化物质。SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)还原法^[28];POD活性采用愈创木酚比色法^[29];MDA含量用硫代巴比妥酸(TBA)比色反应测定^[28]。

用SPAD-502微型叶绿素计对孕穗期水稻顶部3片完全展开叶片进行测量，每片叶子取3个点位(距叶片基部1/2处及其上下各约3 cm的位置)进行测量并取平均值作为该张叶片的SPAD值。

用DCB(dithionite citrate bicarbonate)法提取水稻根膜中的铁和镉^{[30, 31]}。采集孕穗期水稻根，用自来水冲去泥土后用去离子水冲洗3次。将根放入150-mL锥形瓶中加入60 mL提取液(摩尔浓度0.3 mol/L柠檬酸钠和0.1 mol/L碳酸氢钠)和1.2 g硫代硫酸钠，在27 ℃条件下振荡2 h。将提取液转移至100 mL容量瓶定容，用火焰原子吸收分光光度法(FAAS)测定其含铁和镉量。

采用微波消解-火焰原子吸收法测定，用万分之一天平准确称取105 ℃杀青2 h并在80 ℃烘干至恒量的水稻叶片及提取过根膜的根0.2 g于聚四氟乙烯消解管中，加入5 mL HNO₃、1 mL HF和1 mL H₂O₂。先在120 ℃下预消解20 min后进行微波消解，之后在150 ℃下赶酸，剩余消解液定容至100-mL的容量瓶中，用火焰原子吸收分光光度法(FAAS)测定其含铁和镉量。

利用SPSS 20.0进行双因素方差分析，用邓肯(Duncan)检验分析各处理间差异性(显著性水平α=0.05)。

在铁、镉共同处理下，表征水稻叶片叶绿素水平的SPAD值没有显著变化(图1)。通过双因素方差分析，外源亚铁和镉对水稻叶片MDA含量存在交互作用。在无镉处理(C₀)下，水稻叶片中MDA含量随着土壤亚铁量的增加而呈减少的趋势，特别是在F₃和F₄处理下有显著降低(图1)，大约是F₁处理下MDA含量的45%。相关性分析表明MDA与叶片中含铁量呈显著负相关(表3)。在F₁处理下，有镉处理(C₁)显著降低了叶片MDA含量，是无镉处理(C₀)下MDA含量的68.9%。这表明在一定亚铁含量下(F₁)镉的存在会加剧植株营养代谢失调。从整体来看，在有镉处理(C₁)下，水稻叶片中MDA含量在试验所设所有亚铁含量条件下保持稳定水平。

图1(Figure 1)

柱状图上不同小写字母表示不同处理间在P<0.05水平差异有统计学意义.Different lowercase letters above the bar indicate statistically significant differences among different treatments at the 0.05 probability level． 图1 孕穗期各处理下水稻叶片SPAD值、MDA含量 Fig. 1 Effects of Fe2+ and Cd2+ on chlorophyll content (SPAD value) and MDA content in rice leaves at the booting stage

表3(Table 3)

表3 孕穗期水稻叶片各生化指标及叶片中铁、镉含量之间的相关性Table 3 Correlations between biochemical index and Fe/Cd contents in rice leaves at the booting stage

表3 孕穗期水稻叶片各生化指标及叶片中铁、镉含量之间的相关性Table 3 Correlations between biochemical index and Fe/Cd contents in rice leaves at the booting stage MDA POD SOD 叶中含铁量Fe content in shoots 叶中含镉量Cd content in shoots MDA 1.000 POD 0.385 1.000 SOD 0.193 0.543** 1.000 叶中含铁量Fe content in shoots -0.455* 0.269 0.616** 1.000 叶中含镉量Cd content in shoots 0.056 -0.615** -0.694** -0.603** 1.000 *相关性显著(P<0.05)；**相关性极显著(P<0.01). Single asterisk (*) and double asterisks (**) indicate significant correlations at the 0.05 and 0.01 probability levels，respectively.

点击放大

SOD与POD是植物减少活性氧(ROS)损伤的抗氧化酶系统^[1]。图2所示，在F₁和F₂条件下，SOD活性在土壤高镉处理(C₁)时明显低于无外源添加镉(C₀)的处理，镉在这2个亚铁处理下大约抑制了60%的SOD活性。随着外源亚铁处理量的增加，在C₁处理下SOD活性在不断增强，并逐渐与在C₀处理下SOD活性水平相近似。这表明亚铁量的提高能减少镉对植株的影响。相关性分析也表明，SOD活性与叶片中含镉量呈显著负相关，而与叶片中的含铁量呈正相关(表3)。在镉污染的土壤中，亚铁量的增加将会刺激SOD活性。在试验所设亚铁条件下，镉抑制了POD活性。在不同处理下，POD活性变化与SOD活性变化有着相似的趋势。相关性分析表明，两者之间存在显著正相关。然而，POD活性变化幅度比SOD活性变化幅度小，表明在本试验的镉和亚铁条件下，SOD发挥了主要的保护作用，而POD处于较为次要的地位。在无外源添加镉时，F₃、F₄处理使得SOD、POD活性相对于F₁、F₂处理下均有所下降，这是由于亚铁胁迫超过水稻自身抵御能力，产生过量的活性氧(ROS)消耗了这2种抗氧化酶^[17,31]。

图2(Figure 2)

柱状图上不同小写字母表示不同处理间在P<0.05水平差异有统计学意义.Different lowercase letters above the bar indicate statistically significant differences among different treatments at the 0.05 probability level． 图2 孕穗期各处理下水稻叶片中SOD、POD活性 Fig. 2 Effects of Fe2+ and Cd2+ on activities of SOD and POD in rice leaves at the booting stage

在本试验条件下，根膜中铁元素含量不因土壤中亚铁或镉量的变化而呈显著性差异，其质量分数基本维持在1~2 g/kg(图3)。对于根膜中的含镉量而言，在无镉处理(C₀)下， 根膜中镉的含量随土壤亚铁浓度呈现先降低后增加的趋势，在F3处理时达到最低，但整体而言变化幅度较小。土壤在高镉(C₁)条件下，根膜中含镉量随着土壤中亚铁量的增加呈明显减少的趋势，且在F₄处理下其含量与F₀处理下的含量接近。这可能是由于亚铁离子的竞争作用使得镉向根际微区转移能力降低，从而表现出随着土壤亚铁浓度的增加，土壤中的镉会更少地吸附沉积在根膜中。

图3(Figure 3)

柱状图上不同小写字母表示不同处理间在P<0.05水平差异有统计学意义. Different lowercase letters above the bar indicate statistically significant differences among different treatments at the 0.05 probability level． 图3 孕穗期各处理下水稻根际膜中铁、镉含量 Fig. 3 Effects of Fe2+ and Cd2+ on Fe/Cd contents in rice root plaques at the booting stage

本试验所设土壤亚铁水平(577~977 mg/kg)对根的含铁量影响不显著(图4)，根中含铁量范围维持在2.25~3.75 g/kg。这可能是在较高亚铁条件下，根通过限制吸收，减少亚铁积累的一种自我保护机制。土壤在低镉(C₀，外源加镉0 mg/kg)条件下，根中所积累的镉含量维持在一个稳定较低的水平(约11.5 mg/kg)，且不随外源铁变化而有所改变，这与根膜中镉始终维持在一定水平有关。但是，土壤在高镉(C₁，外源加镉5 mg/kg)条件下，根对镉的积累会随土壤亚铁量的变化而有波动，呈先增加后减少的趋势，在F₂处理(土壤含Fe²⁺量为677 mg/kg)时镉达到最高值(102.4 mg/kg)。这表明一定量的土壤亚铁能刺激根对镉的富集，但随着土壤中亚铁的升高又会阻碍根对镉的吸收。

图4(Figure 4)

柱状图上不同小写字母表示不同处理间在P<0.05水平差异有统计学意义. Different lowercase letters above the bar indicate statistically significant differences among different treatments at the 0.05 probability level． 图4 孕穗期各处理下水稻根中铁、镉含量 Fig. 4 Effects of Fe2+ and Cd2+ on Fe/Cd contents in rice roots at the booting stage

对水稻叶片中含铁量分析发现，叶片中含铁量随土壤亚铁量的增加而增加，而外源土壤镉的添加减少了铁在叶片中的积累(图5)。叶片中的含镉量与根中的含镉量有着一致的变化趋势，即随着含亚铁量的增加呈先增加后减少的趋势，在F₂处理(土壤含Fe²⁺量为677 mg/kg)时镉达峰值(12.1 mg/kg)。相关性分析(表4)显示，叶片中的含镉量与根及根膜中含镉量呈显著正相关，这反映了根膜中的镉是植株吸收、累积镉的主要来源。此外，正是由于亚铁在根膜与镉的竞争减少了根膜的含镉量，从而抑制了植株对镉的积累，减缓了镉对植株的影响。刘文菊等^[32]的研究也表明，根际膜的存在可以抑制植株对镉的吸收。同时，本试验还发现，根对镉的富集远大于叶片，这与CHIEN等^[7]的研究结果一致。

图5(Figure 5)

柱状图上不同小写字母表示不同处理间在P<0.05水平差异有统计学意义. Different lowercase letters above the bar indicate statistically significant differences among different treatments at the 0.05 probability level． 图5 孕穗期各处理下水稻叶片中铁、镉含量 Fig. 5 Effects of Fe2+ and Cd2+ on Fe/Cd contents in rice leaves at the booting stage

表4(Table 4)

表4 孕穗期水稻植株中铁、镉含量及其相关性Table 4 Correlations between Fe/Cd contents in rice at booting stage

表4 孕穗期水稻植株中铁、镉含量及其相关性Table 4 Correlations between Fe/Cd contents in rice at booting stage 叶中含铁量Fe content in shoots 叶中含镉量Cd content in shoots 根中含铁量Fe content in roots 根中含镉量Cd content in roots 根膜中含铁量Fe content in root plaques 根膜中含镉量Cd content in root plaques 叶中含铁量Fe content in shoots 1.000 叶中含镉量Cd content in shoots -0.603** 1.000 根中含铁量Fe content in roots -0.343 0.346 1.000 根中含镉量Cd content in roots -0.502* 0.970** 0.342 1.000 根膜中含铁量Fe content in root plaques 0.198 -0.413 0.108 -0.390 1.000 根膜中含镉量Cd content in root plaques -0.644** 0.613** -0.176 0.505* -0.350 1.000  *相关性显著(P<0.05)；**相关性极显著(P<0.01).  Single asterisk (*) and double asterisks (**) indicate significant correlations at the 0.05 and 0.01 probability levels，respectively.

点击放大

前人研究表明，铁是植物必需营养元素，也是叶绿素形成的基础元素，缺铁会使水稻黄化^[33]，过量的亚铁会使水稻积累大量氧自由基，氧化叶绿素^[10]，同样导致叶绿素水平下降^[9]。此外，有报道称镉会使植物叶绿素水平减少^[15,34]。但本试验未能验证以上结果，这可能是因为SPAD值作为间接指标受到诸如氮素等营养水平及植株自身条件等因素的综合影响，所以并不能敏感的反映较高含量下外源亚铁变化对植株的影响。同时，在高亚铁环境下，试验所设的含镉量不足以影响叶绿素水平。有研究表明只有在高镉处理下，水稻叶片SPAD值才会有所降低^[15]。

孕穗期是水稻由营养生长转变为生殖生长过渡期^[35]。研究表明水稻叶片对镉的富集呈现分蘖期＜孕穗期＜抽穗期的趋势^[36]。水稻抗氧化酶系统受到逆境胁迫和植株衰老2种作用的影响，在生育晚期，植株衰老将成为主导因素^[36]，使得抗氧化酶系统对金属胁迫将不再敏感。丙二醛(MDA)是植物膜脂质过氧化的产物^[15]。多数实验研究表明，在过量亚铁和镉的胁迫下，诱发的活性氧自由基将会攻击膜脂，使得水稻MDA含量增加^{[37, 38]}。然而本实验结果显示，水稻叶片中MDA含量随亚铁量增加呈下降趋势，这可能是在高亚铁胁迫下植株机体本身出现了失调现象^[39]。在F₁处理下，镉使得MDA含量大幅减少，这可能是由于外源镉的施入加剧了植株代谢失调。随着外源亚铁量增加，镉的施入对MDA量不再有显著影响，这可能是高亚铁减少了实验所设土壤含镉量对水稻叶片MDA的不利影响。相关性分析表明，MDA含量与SOD和POD活性不相关。在实验条件下，镉抑制了SOD和POD活性，尽管这与邵胜国等^[15]的研究结果相一致，但本实验表明土壤在不同亚铁量下镉对SOD、POD活性的抑制能力并不相同。这说明镉对植株的氧化胁迫会受到土壤中亚铁的影响，在相对较高的亚铁量下(777~977 mg/kg)镉对SOD、POD活性的抑制能力减弱。在不同处理下，POD比SOD活性变化幅度小，这表明本实验在镉和亚铁条件下，SOD发挥了主要的保护作用，这与王贵民等^[17]的研究结果一致。值得注意的是，在无外源添加镉时，F₃、F₄处理使得SOD、POD活性有所下降，这可能是由于亚铁胁迫超过水稻自身抵御能力，产生过量的活性氧(ROS)消耗了这2种抗氧化酶^[17,31]。

史锟等^[40]研究表明受到根表铁的富集点位所限，在土壤较高亚铁量下，根表所能富集的铁胶膜量趋于稳定，这与本实验根膜中的含铁量并不因土壤中亚铁量变化而有显著改变的结论一致。然而，根膜中的含镉量却随着土壤中亚铁量的增加而降低，这可能是由于亚铁离子的竞争作用使得镉向根际微区转移的能力降低，从而表现出随着土壤亚铁量的增加，土壤中的镉会更少地吸附沉积在根膜中，这与史锟等^[40]研究的水培下孕穗期水稻根膜中铁、镉含量结果相似。

本实验根中含镉量随亚铁量增加呈先增加后减少的趋势，表明土壤在高镉条件下，土壤亚铁量增加在一定程度上刺激了镉向根的富集，但随着土壤亚铁的进一步提高，又会阻碍根对镉的吸收富集。前人研究表明，水稻可以通过Fe²⁺跨膜运输蛋白(Ⅰ)或借助Fe³⁺载体(Ⅱ)吸收铁。Ⅱ方式是缺铁条件下水稻吸收铁的主要方式。本试验土壤在所设亚铁条件下，水稻主要通过Ⅰ方式吸收铁元素。Ⅰ方式所涉及的铁载体蛋白也可以有效地运输镉^{[6, 14, 33]}，外源亚铁量从F₁(577 mg/kg)增加到F₂(677 mg/kg)时，可能刺激水稻更多地通过Ⅰ方式吸收铁，产生了更多亲附镉的铁载体，从而使根富集了更多镉。但是，随着亚铁量的升高，其与镉的竞争加强，使得根对镉的富集能力逐渐降低。同时高外源亚铁也会抑制铁载体的表达^[6]，从而减少植株对铁和镉的吸收。此外，根膜中镉量的降低也可能是根中镉量减少的原因之一。叶片对镉的富集受到根和根膜富集镉量的影响，随着土壤亚铁量的增加呈下降趋势，这也可能是随着亚铁量增加，镉对植株MDA含量以及POD和SOD活性的影响变得不显著的原因之一。

在本试验条件下的土壤中亚铁和镉含量的增加对水稻叶片SPAD值没有显著的影响。

在577 mg/kg的亚铁条件下，镉显著降低了叶片中MDA含量，加剧了水稻营养代谢失调。但是随着土壤亚铁量的升高，镉所产生的不利影响变得不再显著。土壤亚铁的增加减少了植株对镉的吸收和富集，这也是高亚铁能够减少镉对水稻叶片MDA含量以及SOD和POD活性的影响的部分原因。

镉的存在抑制了SOD和POD活性，但其抑制能力与土壤中含铁量有关。在试验所设较低亚铁条件下镉对2种抗氧化酶活性的抑制能力要高于试验所设较高亚铁条件下的抑制能力。镉也抑制了铁在水稻叶片的富集，这表明铁和镉在水稻吸收和富集金属过程中存在竞争关系。

试验表明水稻根及叶片积累富集镉的量与根膜中含镉量呈正相关。控制镉在植株根膜的积累可以作为减少植株吸收富集镉的一个方式。随着土壤含铁量增加，镉在根膜中含量减少。由于土壤高铁量所产生根膜的屏蔽作用使得镉向植株迁移的可能性降低。此外，土壤中含铁量较高会阻碍高亲和性铁载体的表达，从而减少了植物对镉的吸收和积累。