黏菌(myxomycete，plasmodial slime molds)是主要在土表和杂草中取食原生生物、细菌和真菌的土壤变形虫。它们广泛存在，已描述的分类单元超过1 000个^[1]。黏菌以复杂的生活史为特征，可分为二倍体和单倍体阶段。2个单倍体变形虫鞭毛体融合形成一个二倍体原生质团，在某个时候，隐藏的原生质团从土壤里重浮出表面，扩展到碎石或下部分枝或其他植被，在植物表面形成子实体；原生质体能达到明显的大小，产生子实体位点的表面可能被覆盖半透明到奶油色或淡黄色黏液^[2]；子实体变干，释放孢子不是通过机械机制，就是通过风、雨、昆虫等被动机制。

黏菌子实体能覆盖在大部分植物的下部。白柄菌(Diachea leucopodia)和法网黏菌科(Stemonitaceae)的种发生在波兰草莓新叶和老叶上；煤绒菌(Fuligo septica)、复囊钙皮菌(Mucilago spongiosa)和灰绒泡菌(Physarum cinereum)在北美草坪上均有发现^{[3, 4]}。最近，在亚热带草本植物的花序上也发现了一些黏菌。ZHANG等^[5]发现在浙江绍兴铁皮石斛(Dendrobium Candidum)种植田中有淡黄绒泡菌(Physarum melleum)发生。虽然黏菌不会像真菌病原菌侵染寄主，但是其覆盖在活的植物表面或整个植物上显然会影响植株的生长；因此，我们仍把这种危害称为“黏菌病”。

铁皮石斛为兰科石斛属多年生附生草本植物，为我国传统的名贵中药材，2010年版《中国药典》专门列为单一品种的中药材，它在浙江广泛种植。2011年，我们在浙江乐清市雁荡山地区铁皮石斛栽培田中发现了另外2种黏菌，它们生长或覆盖铁皮石斛植株，其中一种子实体小型、具柄，而另外一种大型，呈垫状复囊体。本文主要描述了这2个黏菌引起的“病害”症状，并依据细胞学、超微结构特征和分子数据鉴定这2个黏菌，这将为我国黏菌地理分布、多样性及其资源调查和研究提供基础信息。

黏菌的观察和标本采集在浙江省乐清市雁荡山地区铁皮石斛种植基地。雁荡山为国家重点风景名胜区，地理坐标为121°10′ E，28°36′ N，海拔1 000 m，处于海洋季风气候生态环境中。田间黏菌观察于2011年7—9月进行。将具有黏菌的铁皮石斛植株或黏菌子实体带回实验室，进一步用于观察和分析。

形态学观察和摄影。黏菌子实体观察、大小测量和摄影在SMZ1500解剖镜(尼康公司，日本)下进行。该解剖镜具有数字化视野的DS-fil摄像头和NIS-Elements 3.22数字成像软件。至少测量100个子实体，包括柄、囊轴和孢囊的大小等。孢子、弹丝等形态观察和摄影在具有Axiocam CCD摄像头和Axiovision 3.1数字成像软件的Axiophot 2显微镜(ZESS公司，德国)下进行，至少测量100个孢子。

原生质团的观察。挑取子实体中的孢子配制成孢子悬浮液(1×10⁶个/mL)，取50 μL孢子悬浮液于灭过菌的凹玻片上，然后放入垫有湿润滤纸的培养皿中，在黑暗条件下于25 ℃恒温箱中培养，定期观察孢子产生原生质体的状态。

用刀片切取有黏菌的组织，放入4%戊二醛磷酸缓冲液中，在4 ℃冰箱中固定24 h，用磷酸缓冲液(pH 7.0)冲洗后，将样品用滤纸隔开进行临界点干燥。干燥后的样品用胶纸粘在铜台上，进行铂金喷镀，然后在Philips XL30扫描电镜(FEI公司，美国)下观察，拍照。

分别把具柄的黏菌子实体或垫状复囊体放置在干净的载玻片上，用镊子破碎子实体，移掉碎片，获得大量孢子。将孢子(约0.2 mg)转移到离心管中，加入溴化十六烷基三甲铵(cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)缓冲液^[6]，用玻璃研磨杵研磨。在显微镜下检查孢子破裂程度，然后提取DNA^[6]。设计多个18S小亚基(small subunit,SSU) rDNA引物^[7]，由上海生工生物工程有限公司合成。扩增循环^[8]，退火温度依据引物不同，温度范围从50到53 ℃，延伸时间1~2 min。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测和比较，最大的片段用于测序。产物连接根据说明书(pGEM-T-Easy Vector System 1,Promega公司，美国)进行。测序由上海桑尼生物科技有限公司完成。

测序后的序列用Bio-Edit软件^[9]进行编辑和比较分析，然后在GenBank数据库中用Blast工具进行高度相似的序列搜索，并用ClustalX 1.81软件^[10]进一步进行序列比较分析。

用人工繁育的铁皮石斛苗进行盆栽，培养3个月后用于人工接种。用灭菌水分别制备2个黏菌的孢子悬浮液(1×10⁶个/mL)，通过喷雾接种到铁皮石斛植株上，然后用塑料袋保湿，将花盆移到25~28 ℃的温室中，于不同时间观察黏菌子实体的产生情况。

在铁皮石斛栽培田中有2种黏菌发生：一种黏菌的子实体是有柄的圆柱形孢囊(图 1A，B)；另外一种黏菌具有大的子实体，是垫状复囊体(图 2A~C)。

图1(Figure 1)

A：在铁皮石斛叶和茎表面的白色有柄的幼孢子囊；B：在铁皮石斛茎表面的褐色有柄的成熟孢子囊；(C~D)：解剖镜下单个或成群的孢子囊；E：孢子囊扫描电镜图；F：产生于囊轴上的、具有形成内网孢丝端分枝的孢丝；G：萌发孢子产生的无色的黏变形体；H：在扫描电镜下显示为钝的疣突的孢子纹饰。 A: Young white stalked sporangia on leaves and stems of Dendrobium candidum; B: Mature brown stalked sporangia on stems of D. candidum; (C-D): Single or groups of sporangium under dissecting microscope; E: Scanning electron microscopy of sporangia; F: Branched capillitia arising from the columella, and the capillitial heads forming an interior network; G: A white myxamoeba produced from a germinated spore; H: Spore ornamentation with blunt warts observed under the scanning electron microscope. 图1 美发菌的光学和扫描电镜图 Fig. 1 Light microscopy and scanning electron microscopy of Comatricha pulchella

图2(Figure 2)

(A~B)：不同大小和形状的白色复囊体；C：覆盖在一簇铁皮石斛植株上的复囊体；D：复囊体皮层脱落后形成的黑褐色的孢子堆；E：萌发孢子产生的透明的黏变形体。 (A-B): Aethalia of different sizes and shapes; C: Aethalia covered on clusters of D. candidum plants; D: A black brown sorus formed after white thickened cortex of aethalia peeling off; E: A transparent myxamoeba produced from a germinated spore. 图2 煤绒菌的光学显微图 Fig. 2 Light microscopy of Fuligo septica

前者子实体很小，生长在活体植物的茎、叶上。子实体初为白色，散布在寄主表面呈粒状小点(图 1A)，随后呈乳白色。成熟的子实体呈暗褐色，肉眼观察如同覆盖了一层黑褐色霉层(图 1B)。由于栽培铁皮石斛常将3~5个植株作为1穴，一些穴中个别植株上有黏菌子实体的分布，偶尔个别穴中所有植株上都覆盖着黏菌子实体。

后者子实体很大，腐生在栽培田中的基质上，或覆盖在整穴铁皮石斛植株上。如果子实体发育很大，1穴植株仅有几个叶片外露(图 2A)，或整穴植株被完全覆盖(图 2B)。由于黏菌子实体遮蔽了植物生长需要的光照(图 2C)，阻碍了植株的光合作用，导致植株矮化。

在小型黏菌中，成熟的子实体具柄，孢囊群生，有时密集。早期呈卵形至倒棒形(图 1A)，成熟至圆柱形，暗褐色(图 1B)，长1.2~2.0 mm(平均1.6 mm)，宽0.3~0.4 mm(平均0.33 mm)，整个高度1.8~2.6 mm(平均2.2 mm)。囊被早期为白色，并逐渐脱落(图 1C，D)。柄呈紫黑色，长0.6~0.7 mm(平均0.65 mm)，不超过全高的1/2(图 1D)。囊轴向上渐细，延伸至孢囊顶端，最终融合成孢丝(图 1E)。孢丝密集，分枝并联结形成内网，初级分枝与囊轴成直角，尖端色淡，游离末梢较少(图 1F)。孢子球形，直径为7.2~8.0 μm(平均7.5 μm)，成堆时呈褐色，在光学显微镜下呈浅紫褐色，表面有均匀小疣(图 1H)。孢子萌发后产生乳白色的黏变形体(图 1G)。依据这些形态学特征，该种被鉴定为美发菌[Comatricha pulchella (C. Bab.) Rostaf.]，正如其他学者对该分类单元的描述^{[11, 12]}。

在大型黏菌中，子实体是大型的复囊体。复囊体呈枕状，乳白色，通常较大，宽2~4 cm，厚2.4~2.8 cm，长达15 cm，有时在乳白色中含有微红色区域(图 2A~C)。其皮层具石灰质，厚而脆，易脱落。复囊体内含有大量的孢子，孢子成堆时呈黑褐色(图 2D)，在光学显微镜下呈紫褐色，孢子球形，直径6.3~7.2 μm(平均6.8 μm)，表面具细刺。孢丝分散在孢子堆中，孢丝具有石灰结，呈白色，连接线无色。孢子萌发后产生白色的黏变形体。依据这些形态学特征，该种被鉴定为煤绒菌[Fuligo septica(L.)Wigg.]，与其他学者^{[11, 12]}对该种的描述相符。

从小型黏菌中扩增到500~600 bp的片段，最长的片段经测序后获得610 bp的18S rDNA序列。用Blast在GenBank数据库中搜索显示，该序列与一个未培养的发菌属(Comatricha sp.)中的种同源性达到98%(GenBank登录号：JQ900836)^[13]。结合形态学特征，进一步确定该种为美发菌[Comatricha pulchella (C. Bab.) Rostaf.]。

从大型黏菌中扩增到450~560 bp的片段，最长的片段经测序后获得567 bp的18S rDNA序列。Blast搜索结果显示，该序列与煤绒菌黄色变种(Fuligo septica var. flava)同源性达到99%(GenBank登录号：KP323378)。序列分析结果进一步确定该种为煤绒菌[Fuligo septica (L.) Wigg.]。

人工接种美发菌10 d后，在铁皮石斛茎、叶上产生白色有柄的幼孢子囊(图 3)。20 d后，有成熟的孢子囊产生，正如前文所述。用水冲洗或移掉子实体后，在产生子实体位点处的植物组织仍然是健康的。

图3(Figure 3)

图3 接种10 d后在铁皮石斛茎、叶上产生的白色有柄的美发菌幼孢子囊 Fig. 3 Young white stalked sporangia of C. pulchella produced on stems and leaves of D. candidum after 10 d of inoculation

接种煤绒菌孢子悬浮液15 d后，在铁皮石斛的茎、叶上没有观察到黏菌子实体的形成，但在铁皮石斛根周围的基质上产生了淡黄色的子实体。随着发育，相邻的小子实体聚合成更大的子实体。30 d后，随着体积增大，子实体逐渐变成苍白色到乳白色。大的子实体覆盖茎基部，但与植物接触的部位植物组织仍然是健康的。人工接种结果表明，2个黏菌都不能侵染植物。

黏菌属于腐生菌，不是致病菌。但黏菌确实能影响植物的生长。本文提供了黏菌影响植物生长的实例。美发菌是腐生菌，罕见发生在活树的树皮上^[11]，而我们首次观察到了该种生长在活的植物茎、叶上的证据。煤绒菌是最普通的黏菌，子实体除发生在活的树和藤上外，几乎能在任何东西上发现，而巨大的子实体覆盖整个植物，显然影响植物生长。COUCH^[2]对覆盖在植物叶片的黏菌称为“病害”，我们这里称“黏菌病”，是指黏菌对植物生长造成的不利影响。

黏菌半透明或透明的原生质覆盖在植物上，很有可能干扰植物光合作用、蒸腾作用和呼吸作用；通过改变植物正常生理机制，从而影响叶绿体含量，妨碍自由气体交换，改变气孔关闭程序等^[2]。黏菌影响植物的正常生长，不及时清除，孢子还会随着风、雨等的传播附着在其他健康的植株上。“黏菌病”的发生与特定环境密切相关。模拟自然环境栽培铁皮石斛，基质通常由树皮、泥炭、刨花和石块混合构成。黏菌以吞噬有机物、细菌或小的原生生物作为营养。由于基质主要成分是树皮，在潮湿环境条件下含有大量腐烂的有机物和微生物，有利于黏菌的生长，易于“黏菌病”的发生。因此，在铁皮石斛生产上控制基质的湿度，是防治“黏菌病”发生的重要措施之一。

对黏菌种的分类目前仍然仅依据形态学特征^[13]。但仅依据形态学建立的种存在明显的缺陷，如分类可用的分类特征较少，种的建立基于少量的标本，采用不稳定的特征等，这些将造成分类单元含有隐蔽种或复合种存在。随着黏菌分子系统学的发展，主要基于SSU rRNA和延长因子α1序列^{[14, 15]}进行分类，这2类基因能在不同水平上很好地反映黏菌的系统发育关系。然而，延长因子α1基因太保守而不能提供充分的位点信息^{[16, 17]}，主要用于较高分类序级。因此，SSU rRNA基因被广泛应用于相对较低的黏菌类群分类^{[8, 16, 17, 18]}上。黏菌18S rDNA基因具有多个大的内含子，有时具有强的次生结构，需要用引物步移法(primer walking method)进行扩增^[8]。在设计的多个引物^[7]中，几个引物仅匹配1个序列，且常在内含子中。本研究结果显示，18S rDNA序列在黏菌属水平上是非常有用的，对分类单元的鉴定可达到种的水平，如文中的煤绒菌。然而，由于数据库中测序黏菌种类的限制，如美发菌还没有相应序列可以参考，还有待大量数据进一步比较证实，我们的结果可为其提供有用的信息。