2016, Vol. 42引用本文 |
| 马铃薯Y病毒单克隆抗体的制备及其检测应用 |  [PDF全文] |
2. 贵州省烟草科学研究院, 贵阳 550081
2. Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, China
马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)于1931年由SMITH[1]在马铃薯中首次发现, 是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的代表成员, 该病毒是危害农作物的重要病毒之一, 在全球广泛传播并造成了严重的经济损失。自1953年起PVY在欧洲马铃薯种植区广泛流行, 20世纪70年代该病毒扩展到美洲, 到20世纪90年代初该病毒在亚洲开始发生流行, 目前该病毒在世界各地均有发生危害[2-4]。PVY寄主广泛, 可侵染至少34个属的163种植物, 对茄科、藜科和豆科植物危害最为严重, 机械接种可感染120种植物[5]。马铃薯Y病毒存在明显的株系分化, 不同株系间无交叉保护作用, 造成的损失也不一样, 所以PVY的株系划分一直是研究的热点之一。后来BOKX, 等[6]的株系划分结果普遍被人们接受, 即把PVY株系划分为烟草脉坏死株系PVYN、普通株系PVYO、点刻条纹株系PVYC这3个株系。PVY引起的症状因寄主品种和病毒株系的不同而有所差异, 典型的症状包括重型花叶、叶脉坏死、垂叶条斑坏死等, 可引起马铃薯产量损失高达80%[7-8]。PVY的初侵染源主要是带毒种薯, 病原通过种薯调运可作远距离扩散。PVY在马铃薯田块通过病汁液和携毒蚜虫传播。在自然条件下, 蚜虫以非持久性的方式高效传毒[9-10]。研究发现PVY的衣壳蛋白(coat protein, CP)和HC-Pro蛋白(helper component-protease)参与蚜虫传毒过程[11]。
PVY病毒粒子呈弯曲线状, 无包膜, 大小为730 nm×11 nm。该病毒基因组为1条大小约10 kb的正义单链RNA。基因组只包含1个ORF, 编码1个约360 ku的多聚蛋白, 多聚蛋白通过自身编码的蛋白酶裂解成11个成熟的功能蛋白, 即32.4 ku的P1蛋白、51.9 ku的HC-Pro蛋白、41.5 ku的P3蛋白、6 ku的6K1蛋白、71.4 ku的CI蛋白、5.5 ku的6K2蛋白、21.7 ku的NIa-VPg蛋白、27.7 ku的NIa-Pro、59.8 ku的NIb蛋白、29.8 ku的CP和24 ku的P3N-PIPO蛋白。P3N-PIPO蛋白可能是由P3顺反子内部+2移码形成的PIPO ORF 5′末端高度保守区通过核糖体移码或转录滑动产生的[12]。病毒编码蛋白的功能极其复杂, 均是多功能的[7, 13-15]。
防治PVY主要采用抗病毒育种和生产无毒种苗等方法, 而快速、准确、灵敏、特异的病毒检测技术是抗病毒育种和生产无毒种苗的关键。与常规的指示植物检测、电镜检测、分子生物学检测等方法相比, 血清学方法具有简单、经济、易操作、可大规模检测等优点, 该方法在植物病毒的田间检测和调查等方面得到了广泛的应用[16]。目前已有关于PVY抗体制备和血清学方法的报道[17-19], 但报道的PVY抗体和血清学方法的检测灵敏度欠佳, 为此, 本研究制备了特异性强、灵敏度高的PVY单克隆抗体, 并以制备单抗为核心建立了检测PVY的血清学方法, 从而为我国作物上PVY的检测和诊断、脱毒种薯生产、抗病育种和该病毒病的科学防控，提供了物质和技术支撑。
1 材料与方法 1.1 材料马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)从贵州田间的普通烟植物中分离, 经RT-PCR和核酸测序鉴定后繁殖于普通烟植株上。马铃薯的健康植株、感染马铃薯S病毒(Potato virus S, PVS)、马铃薯A病毒(Potato virus A, PVA)和马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus, PLRV)的马铃薯植株由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所丁铭老师提供。健康的普通烟以及感染马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)的普通烟隔离种植于本实验室的玻璃温室中。疑似感病的马铃薯样品于2015年采自云南田间。RT Enzyme Mix购自TOYOBO公司(日本); T4 DNA聚合酶及pMD 18-T Vector购自TaKaRa公司(日本); PCR产物回收试剂盒购自AxyGEN公司(中国); BALB/c小鼠(Mu smusculus)购自中科院上海实验动物中心; 24孔和96孔酶标板购自Corning公司(美国); Master Mix、聚乙二醇、HAT、HT、AP标记的羊抗鼠二抗、抗体类型和亚类鉴定试剂盒均购自Sigma公司(美国); Protein A-Agarose购自GE Healthcare公司(美国); 硝酸纤维素膜购自Amersham Pharmacia公司(美国); NBT/BCIP底物及TMB显色底物购自Promege公司(美国)。
1.2 方法 1.2.1 PVY的鉴定根据GenBank中已报道的PVY基因组的保守序列设计特异性引物, 上游引物(PVY-F):5′-ATTAACATTAGTGAGGAAGATG-3′, 下游引物(PVY-R):5′-AAGCAGTTTCAGCGCTGCCG-3′, 扩增片段大小为406 bp, 引物由上海英骏生物技术有限公司合成。采用TRIzol试剂法提取感染PVY植物的总RNA, 然后反转录得cDNA, 利用设计的PVY特异性引物进行PCR反应。PCR反应体系:2×Master Mix 12.5 μL、PVY cDNA模板1 μL, 上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL, 灭菌的去离子水10.5 μL。PCR反应程序:94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 53 ℃退火30 s, 72 ℃延伸25 s, 循环30次; 循环结束后72 ℃继续延伸10 min。取10 μL PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳分析后, 送擎科公司进行核酸序列测定。
1.2.2 PVY的提纯PVY的提纯参照周雪平, 等[20]方法并稍作修改, 即称取感病组织按1:2比例(g/mL)加入含0.01 mol/L Na-EDTA和0.1%巯基乙醇的0.5 mol/L磷酸盐缓冲液(PB, pH7.5), 在匀浆器中匀浆5~10 min, 匀浆经双层棉纱布过滤, 滤液6 000 r/min离心20 min去除植物残渣; 在上清液中加至最终为2.5% Triton X-100、4% PEG(相对分子质量为6 000)和0.1 mol/L NaCl, 4 ℃搅拌4 h以上; 11 000 r/min离心15 min去上清液, 用含0.01 mol/L MgCl2和0.5 mol/L脲的0.5 mol/L PB(pH7.5)将沉淀充分悬浮; 6 000 r/min离心15 min后将上清液收集于烧杯中于4 ℃放置, 沉淀再悬浮、离心, 重复3次; 将上述离心上清液合并, 33 000 r/min超速离心100 min; 所得沉淀用PB悬浮后8 000 r/min离心15 min, 收集上清液, 沉淀再悬浮、离心, 重复3次; 离心上清液合并后铺于30%蔗糖垫层上, 33 000 r/min超速离心100 min; 所得沉淀用适量pH 7.5的0.01 mol/L PB (含0.01 mol/L MgCl2)悬浮, 33 000 r/min超速离心100 min去蔗糖; 所得沉淀用0.01 mol/L PBS悬浮, 所得悬浮液即为病毒提纯液; 病毒提纯液经3%磷钨酸(pH6.7)负染后, 置于JEOL JEM-1200EX电镜下观察病毒粒子的形态和病毒的浓度。
1.2.3 小鼠免疫、细胞融合、筛选与克隆参照刘欢, 等[21]的免疫方法用PVY提纯病毒免疫8周龄的BALB/c小鼠。根据刘秀梵[22]报道的单克隆抗体制备方法进行细胞融合、筛选与克隆。待融合细胞生长至占孔底面积1/5以上时, 以提纯的PVY、感染PVY的病叶粗提液和健康叶片粗提液包被96孔板, 用间接ELISA方法进行抗体检测。挑取特异性好、阳性强的杂交瘤细胞孔再经过连续3次细胞克隆, 便可得到分泌特异性抗PVY单克隆抗体的杂交瘤细胞。
1.2.4 腹水制备和抗体纯化腹水单抗的制备参照尚海丽, 等[16]的方法, 腹水的亲和纯化采用GE Healthcare公司的Protein A-Agarose亲和柱根据产品说明书进行, 纯化后的单抗于-80 ℃冰箱中保存待用。
1.2.5 抗体类型、亚类鉴定以效价测定采用Sigma公司抗体类型和亚类鉴定试剂盒鉴定抗体类型及亚类, 具体方法参照试剂盒说明书。以提纯PVY病毒为包被抗原, 经倍比稀释的单抗作为一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG作为二抗进行间接ELISA方法测定腹水单抗效价。
1.2.6 单抗的特异性分析感染PVY的烟草和马铃薯病叶及健康的烟草和马铃薯叶片粗提液总蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)而分离, 凝胶中分离的蛋白条带电半干转移至硝酸纤维素膜上, 以制备的适当稀释的单抗为一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG为二抗, 参照吴建祥, 等[23]的方法用Western blot分析单抗的特异性。
1.2.7 ACP-ELISA检测方法的建立及其应用根据LI, 等[24]的方法, 即感染PVY以及健康的烟草叶片研磨匀浆, 离心上清液1:20倍稀释(g/mL)后分别取100 μL包被酶标板, 以制备的PVY单抗为一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG为二抗建立检测PVY的ACP-ELISA方法。用常规方阵试验确定抗体的工作浓度, 并分析建立ACP-ELISA方法的检测灵敏度和特异性。此外, 还用建立的ACP-ELISA方法对田间马铃薯样品进行检测, 并用1.2.1节的RT-PCR方法和核酸测序验证检测结果的准确性。
1.2.8 dot-ELISA和tissue blot-ELISA检测方法的建立及其应用dot-ELISA方法参照尚海丽, 等[16]的方法, 即感染PVY烟草叶片以及健康的烟草、马铃薯叶片研磨匀浆, 离心上清液1:20倍稀释(g/mL)后分别取2.5 μL点样于硝酸纤维素膜上, 以制备的PVY单抗为一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG为二抗建立检测PVY的dot-ELISA方法。用常规方阵试验确定抗体的工作浓度, 并分析建立的dot-ELISA方法的检测灵敏度和特异性。在tissue blot-ELISA中不用研磨组织, 将硝酸纤维素膜剪成适当大小, 铺垫在干净的吸水纸上, 感病组织的茎或叶片(叶片需卷成紧实的筒状)用刀片迅速横切, 将横切面轻轻地压印在膜上3~5 s, 其余步骤与dot-ELISA方法相同。此外, 用建立的dot-ELISA和tissue blot-ELISA方法对田间马铃薯样品进行检测, 并用1.2.1节的RT-PCR方法和核酸测序验证检测结果的准确性。
1.2.9 IC-RT-PCR检测方法的建立及其应用参考WU, 等[25]的方法建立检测PVY的IC-RT-PCR方法。即将腹水单抗稀释200倍取50 μL包被PCR管, 4 ℃孵育过夜; 弃抗体包被液用PBST洗涤3次后加入100 μL从1:10至1:10 485 760倍比稀释(g/mL)的感染PVY烟草病叶研磨液, 并设置阳性、阴性对照, 37 ℃反应2 h; PBST洗涤3次, 再用无菌去离子水洗1次, 短暂离心后吸干管底余液; 直接进行反转录, 40 μL反转录体系:19 μL ddH2O、8 μL 5×RT缓冲液、4 μL 10 mmol/L dNTP、4 μL 100 mmol/L DTT、2 μL下游引物, 混匀稍离心后置94 ℃变性4 min, 然后迅速置冰上3 min; 再往管中加入2 μL AMV (200 U/μL, Promega)、1 μL RNasin(20 U/μL, Promega)后混匀, 稍离心后置42 ℃水浴锅中反转录1 h; 置98 ℃ 5 min灭活反转录酶后取2 μL反转录产物作模板, 用设计的上下游引物参照1.2.1节的方法进行常规PCR, PCR产物进行核酸测序和序列分析。
2 结果 2.1 毒源的鉴定从PVY感病的烟草叶片中提取总RNA, RT-PCR扩增出长度约为400 bp的基因片段, 与预期的PVY基因片段大小相符。PCR产物经核酸测序后显示该片段长度为406 bp, 经BLAST序列比对结果表明, 该序列与GenBank数据库收录的PVYN株系同源性为98%。
2.2 PVY病毒的提纯采用差速离心法提纯PVY病毒粒子, 提纯物负染后置于电镜观察发现, 病毒提纯液中有较高浓度大小约为730 nm×11 nm弯曲线状病毒粒子, 其具有PVY粒子的典型形态和大小。
2.3 分泌PVY单抗的杂交瘤细胞株获得取免疫小鼠脾脏细胞和对数生长期的SP2/0鼠骨髓瘤细胞, 通过聚乙二醇融合获得杂交瘤细胞, 杂交瘤细胞经HAT培养基筛选和培养12 d, 22块96孔板的融合率为96%。以感病的烟草组织粗提液为包被抗原用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清液中的抗体, 共筛选到298个阳性克隆孔, 阳性率为14%。经特异性分析以及3次细胞有限稀释法克隆, 最终获得3B2、3E4、20B2和25C24株能稳定分泌PVY单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2.4 单抗腹水制备、亚类鉴定和效价测定取5×105~10×105个培养的杂交瘤细胞注入已用降植烷处理的8周龄BALB/c小鼠腹腔内, 7~10 d后收集腹水, 4株杂交瘤细胞分别获得10~15 mL单抗腹水, 腹水单抗纯化后的IgG含量在5.84~7.95 mg/mL之间。采用美国Sigma公司的抗体类型和亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的抗体类型及亚类。抗体类型及亚类鉴定结果表明, 3B2、3E4和20B2的抗体类型为IgG1, 25C2的抗体类型为IgG2a, 且4个单抗的轻链均为κ链, 间接ELISA方法测得4株单抗腹水效价均在10-6~10-7之间(表 1)。
| 表1 PVY单克隆抗体的特性 Table 1 Properties of monoclonal antibodies against PVY |
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Western blot分析结果表明, 3B2、3E4和20B2单克隆抗体，与健康烟草、马铃薯叶片组织没有反应, 仅与感染PVY的叶片提取液中1条分子质量约为30 ku的蛋白有特异性反应。该蛋白的分子质量与PVY的外壳蛋白亚基大小相符, 推测所制备的这3个单抗能特异性地识别PVY的外壳蛋白亚基。而25C2单抗与感染PVY的烟草病叶组织中1条约55 ku的条带有特异性反应, 而与健康的烟草和马铃薯组织没有任何反应信号, 根据分子质量推测25C2单抗针对的抗原可能是PVY的HC-Pro蛋白(图 1)。
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| M为蛋白质分子质量标准, 1和2分别为感染PVY的烟草和马铃薯叶片组织，3和4分别为健康的马铃薯和烟草叶片组织. Lane M was the protein marker. Lanes 1 and 2 were PVY-infected tobacco and potato leaf tissues, respectively. Lanes 3 and 4 were healthy potato and tobacco leaf tissues, respectively. 图1 Western blot分析PVY单抗的特异性 Fig. 1 Specificity analyses of MAbs against PVY by Western blot |
方阵试验分析表明, ACP-ELISA方法中PVY单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为25C2单抗1:5 000倍稀释, 3E4、3B2和20B2单抗1:6 000倍稀释, 而AP标记的羊抗鼠IgG二抗均以1:8 000倍稀释。基于上述抗体的最适工作浓度建立检测PVY的ACP-ELISA方法。特异性分析表明, 4个PVY单抗为核心建立的ACP-ELISA方法检测感染PVY的普通烟组织呈很强的阳性反应, 而检测健康的烟草(CK1-)和马铃薯(CK2-)植物组织以及分别感染PVS、PLRV、PVA和PVX的马铃薯植物组织呈阴性反应, 且阳性和阴性的D(405 nm)差异极显著(图 2A)。感染PVY的烟草叶片粗提液经倍比稀释后进行灵敏度分析, 用3E4单抗为核心建立的ACP-ELISA方法检测1:81 920倍稀释病叶粗提液的D(405 nm)与健康对照之比仍>3, 即呈阳性反应。因此, 3E4单抗对病叶的检测灵敏度为1:81 920, 而3B2、20B2、25C2检测灵敏度也达到1:40 960(图 2B)。同时说明建立的ACP-ELISA方法检测病叶的灵敏度最高为1:81 920倍稀释。
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| PVS和PLRV分别为感染PVS、PLRV的马铃薯植物组织，PVY、PVA和PVX分别为感染PVY、PVA和PVX的普通烟组织，CK1-和CK2-分别代表健康的烟草和马铃薯组织. PVS and PLRV represented PVS-, PLRV-infected potato plant tissues, respectively. PVY, PVA and PVX represented PVY-, PVA-, PVX-infected tobacco plant tissues, respectively. CK1-and CK2-represented healthy tobacco and potato plant tissues, respectively. 图2 ACP-ELISA方法的特异性(A)和灵敏度分析(B) Fig. 2 Specificity (A) and sensitivity (B) analyses of the developed ACP-ELISA |
方阵试验表明dot-ELISA和tissue blot-ELISA方法中4个PVY单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5 000和1:8 000倍稀释。以上述抗体最适工作浓度建立成检测植物中PVY的dot-ELISA和tissue blot-ELISA方法。特异性分析表明, 以4个PVY单抗为核心建立的dot-ELISA和tissue blot-ELISA方法仅与感染PVY的叶片组织呈强烈的阳性反应, 而与健康的烟草和马铃薯叶片组织以及感染PVS、PLRV、PVA和PVX的叶片组织均呈阴性反应(图 3A, 图片左栏为dot-ELISA方法的特异性分析结果, 图片右栏是tissue blot-ELISA方法的特异性分析结果), 说明建立的dot-ELISA和tissue blot-ELISA方法能特异性地检测感病植物组织中的PVY。灵敏度分析表明用3E4、3B2和20B2单抗为核心建立的dot-ELISA方法的检测灵敏度较好, 达到1:10 240倍稀释(g/mL), 而以25C2单抗为核心建立的dot-ELISA方法的检测灵敏度也达到1:5 120倍稀释(图 3B)。
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| A:PVS和PLRV分别代表PVS、PLRV感染的马铃薯病叶组织, PVY、PVA和PVX分别代表PVY、PVA和PVX感染的烟草组织, CK1-和CK2-分别代表健康的烟草和马铃薯叶片组织。上下2个点为同一个样品的重复；B:植物组织粗提液的稀释度如图顶端所示, CK+代表感染PVY的烟草组织, CK1-和CK2-分别是健康的烟草和马铃薯叶片组织。 A: PVS and PLRV represented PVS-, PLRV-infected potato leaf tissues, respectively. PVA, PVY and PVX represented PVA-, PVY-, PVX-infected tobacco leaf tissues, respectively. CK1-and CK2-represented healthy tobacco and potato leaf tissues, respectively. Up and lower dots of the same membrane were repeats of the same sample; B: dilutions of plant leaf crude extracts were indicated at the top of the figure. CK+ was PVY-infected tobacco leaf tissues. CK1-and CK2-represented healthy tobacco and potato leaf tissues, respectively. 图3 dot-ELISA和tissue blot-ELISA方法的特异性分析(A)及dot-ELISA方法的灵敏度分析(B) Fig. 3 Specificity analyses of the developed dot-ELISA and tissue blot-ELISA (A) and sensitivity analysis of the developed dot-ELISA (B) |
利用3E4单抗为捕获抗体及PVY的特异性引物, 建立检测PVY的IC-RT-PCR方法, 并分析该方法检测感染PVY的普通烟叶片组织的特异性和灵敏度。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示, 建立的IC-RT-PCR方法能从感染PVY的普通烟叶片组织中扩增到大小为406 bp的特异性条带, 而从健康普通烟组织及感染PVS、PLRV、PVA和PVX的植物组织中未扩增到任何基因条带(图 4A), 说明该方法具有很好的特异性。且用建立的IC-RT-PCR方法检测1:5 242 880倍稀释(g/mL)的病叶组织粗提液时仍呈阳性反应, 即其检测灵敏度高达1:5 242 880倍稀释(图 4B), 说明建立的IC-RT-PCR方法具有非常好的检测灵敏度。扩增的406 bp大小的基因片段进行测序和序列比对, 结果表明所扩增到的DNA为PVY的基因组序列。
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| CK+和CK-分别为感染PVY和健康的烟草叶片组织, PVS和PLRV分别代表感染PVS、PLRV的马铃薯病叶组织, PVA和PVX分别代表感染PVA、PVX的烟草组织, 1~21泳道是从1:10至1:10 485 760(g/mL)倍比稀释的PVY病叶粗提液检测结果, M为1 kb DNA标准分子质量。 CK+ and CK-represented PVY-infected and healthy tobacco leaf tissues, respectively. PVS and PLRV represented PVS-, PLRV-infected potato leaf tissues, respectively. PVA and PVX represented PVA-, PVX-infected tobacco leaf tissues, respectively. Lanes 1-21 were detection results of two-fold diluted concentrations from 1:10 to 1:10 485 760 (g/mL) of PVY-infected leaf tissue crude extract. M was a 1-kb DNA marker. 图4 IC-RT-PCR的特异性(A)和灵敏度(B)分析 Fig. 4 Specificity (A) and sensitivity (B) analyses of the developed IC-RT-PCR |
以3E4单抗为核心建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和tissue blot-ELISA方法对2015年采自云南田间马铃薯样品进行检测。结果发现30个马铃薯样品中有20个样品呈阳性反应(图 5A, B，C)。田间样品进一步用RT-PCR检测, 结果表明, ACP-ELISA、dot-ELISA和tissue blot-ELISA方法检测到的阳性样品均扩增到PVY的特异性条带, 而血清学方法检测阴性的样品中没有扩增到特异性基因片段(图 5D)。PCR产物核酸测序和序列比对结果表明, 这些阳性样品均感染PVY。说明建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和tissue blot-ELISA方法能准确、可靠地用于田间马铃薯中PVY的检测。
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| a1~a8、b1~b8、c1~c18、d1~d6均为田间马铃薯样品，d7和d8分别为感染PVY和健康的马铃薯植株, 并分别作为阳性和阴性对照。M:1 kb DNA标准分子质量。 a1-a8, b1-b8, c1-c8, d1-d6 were field potato plant samples, respectively. d7 and d8 were PVY-infected and healthy potato plant tissues used as positive and negative controls, respectively. Lane M was 1 kb DNA marker. 图5 ACP-ELISA (A), dot-ELISA (B), tissue blot-ELISA (C)和RT-PCR (D)方法检测田间马铃薯样品的结果 Fig. 5 Detection results of PVY in field potato samples by ACP-ELISA (A), dot-ELISA (B), tissue blot-ELISA (C) and RT-PCR (D) |
PVY是危害马铃薯、烟草等多种植物的重要病毒之一, 在全球广泛流行并造成了包括马铃薯在内的多种作物的巨大损失, 而建立病毒的检测技术是植物病毒防控的关键。近年来，检测植物病毒的方法在不断地发展和改进, 例如dot-ELISA和tissue blot-ELISA方法以硝酸纤维素膜代替酶标板, 使血清学方法变得更为简单、快速、直观, 从而成为目前检测植物病毒最常用的方法之一[21, 26]。虽然血清学检测方法具有简单、快速、高通量等优点, 但是在检测灵敏度上与PCR等分子方法相比略有逊色, 而IC-RT-PCR方法是血清学方法和分子生物学方法的有机结合, 它既省去了常规RT-PCR检测中提取RNA的繁杂步骤, 又提高了血清学方法的灵敏度和特异性。
目前，国内外有许多关于PVY抗体制备和血清学方法的报道。早在1981年张鹤龄, 等[18]利用提取的PVY病毒免疫兔子, 研制出了PVY的抗血清, 但其检测灵敏度较低, 检测感染PVY的烟草病汁液最高稀释度仅为1:100。1983年GUGERLI, 等[17]用PVYN病毒免疫小鼠制备了针对PVYN、PVYO、PVYC有特异性反应的单抗, 将制备的单抗与PVY的多抗比较发现, 所制备的单抗效价比多抗高10倍, 但未见单抗检测灵敏度和检测方法的报道。1985年我国学者姚康生, 等[27]从番茄上纯化得到3种株系的PVY病毒, 并免疫小鼠获得了分别对3种PVY株系具有特异性反应的单抗和1株对3个株系均有反应的单抗, 并利用制备的单抗对全国PVY株系进行调查, 然而其制备的单抗检测PVY的灵敏度却未见报道。1993年SINGH, 等[28]制备了PVY的多抗和单抗, 并以灵敏度最高的4E7单抗为核心建立了检测PVYN的dot-ELISA方法, 结果显示该方法能够检测感染PVY的病汁液最大稀释限度为1:640(g/mL)。2001年ROUIS, 等[29]利用纯化的核内含体蛋白制备了4株针对PVY的单抗, 在这4株单抗中有1株是针对NI蛋白、2株是针对细胞质内含体蛋白(CI)、1株是针对PVY CP, 但它们的灵敏度和检测应用未见报道。2008年高方方, 等[19]用原核表达PVYN CP蛋白免疫新西兰大白兔, 获得了PVYN抗血清, 并建立了检测PVYN病毒的ACP-ELISA方法, 该方法对病汁液的检测灵敏度最高也只达到1:128(g/mL)。众所周知, 血清学方法的主要缺点是灵敏度不如分子检测法, 从目前已报道的有关PVY抗体和血清学方法的文献看, PVY抗体和血清学方法的检测灵敏度均不高, 基于上述PVY检测技术的现状, 本研究利用PVYN株系侵染的烟草病叶提纯PVY病毒粒子作为免疫原, 经杂交瘤技术获得了4株PVY单抗, 根据田间检测结果和后继的检测应用表明, 我们所制备的单抗也能检测来自我国贵州、辽宁、黑龙江、云南、海南、浙江等多个地方的不同PV分离物, 说明我们制备的单抗对不同PVY分离物具有广谱性。利用制备单抗为核心建立了灵敏检测田间植物样品中PVY的ACP-ELISA、dot-ELISA、tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR方法, 从而为我国作物上PVY的检测和诊断提供优质的检测试剂和更准确的检测技术。
4 结论本研究通过杂交瘤技术获得了4株灵敏度高、特异强的PVY单克隆抗体。特异性分析结果显示, 这4种血清学方法均只与感染PVY的样品呈阳性反应而不与健康的烟草、马铃薯及感染其他4种试验的马铃薯病毒的植株反应, 且阴、阳性检测结果差异极显著。以制备单抗为核心建立的血清学方法灵敏度分析表明, ACP-ELISA和dot-ELISA检测病叶的灵敏度分别达1:81 920和1:10 240倍稀释(g/mL), 而最高灵敏度IC-RT-PCR方法在感病植物组织粗提液稀释到1:5 242 880倍(g/mL)时仍能检测到病毒。据我们所知, 这是该病毒血清学检测方法目前最高的检测灵敏度, 从而为我国作物上PVY的检测和诊断、脱毒种薯生产、抗病育种和该病毒病的科学防控提供了物质和技术支撑。
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