乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率近年来在世界范围内均呈上升趋势^[1]，其发生和发展是一个多步骤、多基因、多阶段的复杂过程^[2]。男性乳腺癌的发生虽只占乳腺癌发病率的1%左右^[3]，但是最近20年，男性乳腺癌的发病比例呈现明显的上升趋势^[4]。研究表明，乳腺癌的发生不仅与某些原癌基因的过度活化或抑癌基因的失活(或缺失)有关，还与细胞凋亡被抑制有关。B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukmia-2，Bcl-2)和B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(B cell lymphoma/leukmia-2 associated X protein，Bax)是调控凋亡的重要胞内蛋白质，两者在肿瘤的发生和发展中具有重要作用^[5]。半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)是介导细胞凋亡的核心蛋白酶及细胞凋亡蛋白酶级联反应最关键的执行者，在各种因素启动的凋亡程序中起最后枢纽作用^[6]。近年来，关于乳腺癌的研究表明，Bcl-2、Bax和Caspase-3在乳腺癌的发生和发展中起到重要作用，但是鲜有在自发性乳腺肿瘤中联合3个因子进行研究的报道。因此，研究上述基因在自发性乳腺肿瘤中的表达和相互作用，对于揭示乳腺癌发生和发展的机制有着十分重要的意义。

无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级Sprague-Dawley(SD)大鼠(SCXK(沪)2012-0002);鼠全价颗粒饲料(GB14924.3-2001);兔抗鼠Bax(rabbit anti-Bax)、Bcl-2(rabbit anti-Bcl-2)与Caspase-3(rabbit anti-Caspase-3)一抗、链霉素亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术试剂盒(SABC Kit)、二氨基联苯胺显色试剂盒(DAB Kit)购自武汉博士德生物工程有限公司；总RNA提取试剂盒(Total RNA Extractor Kit)购自生工生物工程有限公司(上海)；反转录试剂盒(RT reagent Kit with gDNA Eraser)和荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex Taq)均购自大连宝生物工程有限公司(大连)。

选择3周龄SPF级SD大鼠，雌雄对半共130只于中国医药集团安全性评价研究中心屏障系统[SYXK(川) 2009-021]中，在昼夜交替的自然光周期下饲养，自由饮水进食。环境温度为22~26 ℃，湿度高于40%。饲养60周后进行集体剖杀，取大鼠乳腺组织进行实验，由于在组织学形态上大鼠乳腺肿瘤与人类乳腺肿瘤有着很高的相似度^[7]，故本文将把2012年由多个国家毒性病理学会联合发布的大鼠乳腺肿瘤分类标准^[8]与世界卫生组织乳腺肿瘤组织学分类(2003)标准作为本次乳腺肿瘤分类的一个依据来判定实验中自发性乳腺肿瘤的具体病理分类。实验中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

动物饲养60周后所有大鼠用2%的戊巴比妥钠溶液按动物体质量的0.2倍进行麻醉，麻醉后进行解剖，解剖时肉眼观察并记录乳房组织的大小、颜色。

取正常乳腺及乳腺肿瘤组织固定于4%多聚甲醛溶液。组织固定至少48 h后，取材1 cm×1 cm×0.5 cm经自来水冲洗、70%~100%梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，制成5 μm厚切片。切片在恒温烘箱中37 ℃烘干过夜，次日二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后经苏木精染色10 min、自来水返蓝，再入伊红染色2 min，随后梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。镜检观察并照相。

将多聚赖氨酸与蒸馏水1∶5混匀，用干净棉签蘸取涂抹于载玻片正面，即为防脱片处理过的载玻片，自然晾干后保存备用。取出固定于4%多聚甲醛的乳腺组织，放在脱水盒中自来水冲洗过夜，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后进行切片至5 μm厚。切片贴于防脱片处理后的载玻片上，经恒温烘箱60 ℃烤片4 h以上，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、磷酸盐缓冲液洗涤，3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶的活性20 min，磷酸盐缓冲液洗涤后，将切片置于0.01 mol/L的枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中微波炉加热煮沸后断电，10 min后重复第2次以修复抗原，自然冷却至室温磷酸盐缓冲液洗涤。封闭液孵育40 min后，加入磷酸盐缓冲液稀释(1∶100)~(1∶200)的一抗4 ℃过夜。次日取出，经多次洗涤后，加入生物素化的二抗(兔抗大鼠)37 ℃下孵育40 min后洗涤。滴加试剂SABC 37 ℃ 20 min后磷酸盐缓冲液洗涤4次，然后加入到DAB显色液中显色，在光学显微镜下对其染色程度进行控制，上色后及时加入双蒸水中终止染色，后脱水透明并用中性树脂封片。分别用光学显微镜100倍、200倍和400倍进行观察并拍照，然后进行阳性表达分析。

取组织RNA并检测其质量，进行反转录，荧光定量PCR采用BIO-RAD CFX96序列检测系统来进行。在含有Mix、SYBR Green Ⅰ、2 μL cDNA以及上下游各0.5 μL的25 μL总反应体系中，进行如下扩增： 95 ℃预变性3 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s共进行40个循环；最后72 ℃下延伸10 min。各待测样品分别以内参基因(β-actin)作为对照，同时设立阴性对照(不加模板)，每个样品重复测3次，3次得到的C_T值结果平均值为最终测定结果。引物由大连宝生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1(Table 1)

表1 RTFQ-PCR引物Table 1 Sequences of primers for RTFQ-PCR *

表1 RTFQ-PCR引物Table 1 Sequences of primers for RTFQ-PCR 基因Gene 引物序列Primer sequence (5′—3′) 产物长度Product length/bp β-actin TGACGTTGACATCCGTAAAGACCTGCTAGGAGCCAGGGCAGTAA 116 Bax TTGCTACAGGGTTTCATCCAGGAGCTCCATGTTGTTGTCCAGTTC 152 Caspase-3 ATGCTTACTCTACCGCACCCGGAAGGACTCAAATTCCGTGGC 167 Bcl-2 TGAACCGGCATCTGCACACCGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG 96

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实验数据表示为平均值±标准差(±s)，通过SPSS 19.0软件进行ANOVA和Dunnett-t检验统计分析，以P&0.05为差异有统计学意义。免疫组织化学法和RT-PCR结果通过SPSS 19.0软件进行相关性双因素Pearson统计分析，检验2种方法间的相关性，以P&0.05 为差异有统计学意义。

大体解剖发现14只动物出现肿瘤的相关大体病变，部分大体病变见图1。图1A所示大鼠右侧倒数第二对乳腺处有一肿块，黄豆粒大小，质硬，可移动；尿道口周围大小不等肿块，质硬，最大约黄豆大小。图1B为大鼠尿道口右侧有6 cm×5.2 cm包块，质地软，表面光滑，触之可移动，边界清晰。图1C为尿道口右侧有一约3.2 cm×3.0 cm包块，质地软，表面光滑，边界清晰，可移动，随时间推移，包块渐长，且包块表面脱毛，颜色变黑。

图1(Figure 1)

表示乳腺肿块； 表示正常乳腺(对照)。 Indicates the breast lesion； Indicates the normal breast tissue (control)。 图1 SD大鼠大体解剖图片 Fig. 1 Gross anatomy image of SD rats

乳腺肿瘤组织切片在光镜下进行病理观察并记录(图2)，并根据病理变化对其进行组织学分类(表2)。病理观察可见，与对照组相比，乳腺纤维腺瘤可见间质纤维大量增生，小叶萎缩。整体呈分叶状，腺泡大小不一，部分腺泡上皮细胞变性坏死(图2D，E，F);乳腺腺癌镜检可见腺上皮呈不规则增生，单层或多层排列，肿瘤细胞大小不同，核质比增加，核深染，可见核分裂(图2G，H，I);乳腺乳头状癌：单层多层恶性上皮细胞群，纤维结缔组织和肌上皮细胞支持乳头状突起，多见有丝分裂，细胞异型性高(图2J，K，L);乳腺浸润性导管癌：腺泡间呈融合状，间质减少，管腔内有浆液性分泌物，细胞异型性高，核分裂广泛存在(图2M，N，O)。由于癌变组织样本较少，故将乳腺腺癌、乳头状癌、浸润性导管癌统一归为恶性肿瘤组。

图2(Figure 2)

(A，B，C，C1)：正常乳腺组织HE染色；(D，E，F)：乳腺纤维腺瘤HE染色；(G，H，I)：乳腺腺癌HE染色；(J，K，L)：乳腺乳头状癌HE染色；(M，N，O)：乳腺浸润性导管癌HE染色。 (A，B，C，C1)： HE-stained pictures of the control group; (D，E，F)： HE-stained pictures of fibroadenoma of mammary; (G，H，I)： HE-stained pictures of adenocarcinoma of breast; (J，K，L)： HE-stained pictures of mammary gland papillary carcinoma; (M，N，O)： HE-stained pictures of invasive ductal carcinoma. 图2 大鼠乳腺组织HE染色(bar=50 μm) Fig. 2 Hematoxylin and eosin stained mammary sections of rats (bar=50 μm)

表2(Table 2)

表2 大鼠乳腺组织学分类结果Table 2 Histological classification results of rats breast *

表2 大鼠乳腺组织学分类结果Table 2 Histological classification results of rats breast 大鼠总数1)Total rats number1) 患乳腺肿瘤数Breast cancer number 乳腺组织学类型Mammary histological type 例数(占雌性的百分比)No. (percentage in female rats) 65(雌)65(female) 14(21.54%) 纤维腺瘤Fibroadenoma 7(10.77%) 腺癌Adenocarcinoma 3(4.62%) 乳头状癌Papillary carcinoma 2(3.08%) 浸润性导管癌Invasive ductal carcinoma 2(3.08%) 1)由于实验中未见雄性发生乳腺肿瘤，故发病率仅描述雌性的发病情况. 1) Only the incidence of breast cancer in the female was described，and no breast cancer was observed in the male.

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SD大鼠乳腺中Bcl-2、Bax、Caspase-3的染色图片见图3,免疫组织化学结果(表3)显示，与对照组相比，良性组与恶性组的Bax及Caspase-3的蛋白表达有明显的降低，相比差异有高度统计学意义(P&0.01)，而Bcl-2的蛋白表达则明显增加(P&0.05)。

图3(Figure 3)

图3 SD大鼠乳腺中Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达(bar=50 μm) Fig. 3 Expression of Bcl-2，Bax and Caspase-3 in mammary gland of SD rats (bar=50 μm)

Bcl-2/Bax的比值由表3可知，在对照组其比值小于1，而在良性组和恶性肿瘤组中比值均变大，都大于1，可见在乳腺肿瘤中细胞凋亡受到抑制。

表3(Table 3)

表3 凋亡相关因子在大鼠乳腺组织中的蛋白表达Table 3 Protein expressions of apoptosis related factors in mammary gland of rats *

表3 凋亡相关因子在大鼠乳腺组织中的蛋白表达Table 3 Protein expressions of apoptosis related factors in mammary gland of rats 因子Factor 积分光密度Integral optical density 对照组Control(n=5) 乳腺纤维腺瘤Fibroadenoma(n=7) 恶性肿瘤Malignancy(n=7) Bax 9.75±0.04 8.16±0.16** 6.49±0.32** Bcl-2 8.13±0.35 9.14±0.22* 9.24±0.81* Caspase-3 6.60±0.04 4.43±0.10** 3.03±0.10** *，**分别表示与对照组相比在P&0.05和P&0.01水平差异有统计学意义。 Single and double asterisks (*，**) indicate statistically significant difference from control group at the 0.05 and 0.01 probability levels，respectively。

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通过荧光定量PCR检测SD大鼠乳腺中Bax、Bcl-2、Caspase-3的mRNA的表达量(图4)显示，良性组和恶性组的Bcl-2 mRNA表达水平高于对照组(P&0.01)，而良性组和恶性组大鼠Bax、Caspsase-3 mRNA表达水平则低于对照组(P&0.05)。mRNA的表达量通过2^-ΔΔC_T±s来表达。免疫组织化学法与荧光定量PCR结果的相关性分析(表4)显示，在所有试验组中，Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表达量变化与mRNA表达量变化具有很高的相关性(P&0.01)。

图4(Figure 4)

*，**分别表示与对照组相比在P&0.05和P&0.01水平差异有统计学意义。 Single and double asterisks (*，**) indicate statistically significant difference from control group at the 0.05 and 0.01 probability levels，respectively。 图4 SD大鼠乳腺中目的基因mRNA的表达变化 Fig. 4 Changes in mRNA expression of target genes in mammary gland of SD rats

表4(Table 4)

表4 目的基因的蛋白表达量与mRNA表达量的相关性Table 4 Relationship between the expression of protein and mRNA *

表4 目的基因的蛋白表达量与mRNA表达量的相关性Table 4 Relationship between the expression of protein and mRNA 基因Gene 相关系数(r)Correlation coefficient (r) P值P-value Bax 0.876** <0.01 Bcl-2 0.820** <0.01 Caspase-3 0.886** <0.01 **相关性极显著(P&0.01). Double asterisks (**) indicates highly significant correlation at the 0.01 probability level.

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乳腺癌现今已成为女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁到了女性的健康以及家庭和社会的幸福指数。乳腺癌的发生和发展是环境与遗传相互作用、多基因、多步骤的一个过程，其机制尚未完全阐明。细胞凋亡异常常常引起多种疾病的发生如自身免疫性疾病、神经退行性疾病以及恶性肿瘤^[9]。

本文65例雌性大鼠中有14例发生乳腺肿瘤，发病率为21.54%，而雄性未见乳腺肿瘤的发生。马超亚等^[10]经研究表明雌性SD大鼠的乳腺肿瘤发病率为46.50%;而赵磊等^[11]在大鼠自发性乳腺肿瘤流行病学的研究中指出其大鼠乳腺肿瘤的发病率为10.5%。2篇文章关于自发性乳腺肿瘤发病率的差异很大，本文的结果介于两者之间，也存在很大的差异，这可能与大鼠的个体差异、饲养环境、观察周期的长短以及遗传因素的影响有关。

Bcl-2家族蛋白在凋亡中扮演了一个极其重要的角色，且其与肿瘤的发生有着密切的关系^[12]。Bcl-2家族具有双重的效应，既可以促进凋亡如Bid、Bax，又能够促进细胞增殖阻止细胞凋亡^[13]，如Bcl-2、Bcl-X。Bcl-2基因(即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因)是一种原癌基因，Bcl-2能够阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质，抑制Caspase蛋白的水解从而抑制了细胞凋亡^[14]，是较为肯定的抗凋亡基因，其功能失调是乳腺癌形成的一个重要机制。Bax蛋白(Bcl-2 associated X protein)即Bcl-2相关X蛋白，是Bcl-2的显性抑制因子，它是促进细胞凋亡的基因代表，Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡，当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；Bax与Bcl-2形成异源二聚体时则实现了Bcl-2抑制细胞凋亡的功能^[15]。Bax和Bcl-2形成了细胞凋亡的正负调控，两者比例决定了细胞凋亡的走向^[16]。若Bcl-2/Bax比例增高，则抑制细胞凋亡；反之，则促进细胞凋亡^{[17, 18]}。本研究表明，在大鼠自发性乳腺肿瘤中，与对照组相比，Bax的蛋白及mRNA的表达量均呈下降趋势，而Bcl-2的蛋白及mRNA的表达量则升高，且Bcl-2/Bax的比例不断升高，说明当发生乳腺肿瘤时，细胞凋亡功能被抑制，这与肿瘤细胞能无限增殖的现象相一致。该结果与曲文志等^[19]、张丙信等^[20]的研究结果是一致的。但是王美玲^[21]在对乳腺浸润性导管癌的研究中发现，Bax在癌旁组织和癌组织中表达差异不明显，但是在癌组织中Bcl-2的表达显著高于癌旁组织。本文结果结合前人的研究说明随着乳腺肿瘤的发生和发展，细胞凋亡受到抑制，癌细胞对凋亡的敏感性降低，导致细胞存活周期变长。Bcl-2、Bax的表达以及Bcl-2/Bax比例的变化与自发型乳腺肿瘤的发生和发展有着密切的关系，且Bcl-2和Bax之间相互作用，对乳腺肿瘤的形成和发展起着至关重要的作用，可部分反映乳腺肿瘤的生物学行为。

目前研究表明，已知的3条凋亡信号转导通路均要依赖Caspase家族的级联反应，其中Caspase-3处于各条通路的枢纽环节，是最重要的凋亡效应分子^[22]。国外文献记载^[23]，Bcl-2是通过干扰细胞色素C的释放而阻断上游Caspase蛋白酶的激活，抑制细胞的凋亡。WINTER等^[24]发现与正常前列腺组织相比，Caspase-3在前列腺癌中蛋白表达减少。HOSHI等^[25]通过免疫组织化学的方法研究了Caspase-3在胃癌中的表达情况，发现Caspase-3在胃癌组织中的蛋白阳性表达率明显低于癌旁胃黏膜组织，并认为胃癌的形成与Caspase-3蛋白表达降低有关。PANG等^[26]发现IL-8通过上调Bcl-2下调Caspase-3来抑制MCF-7乳腺癌细胞的凋亡。与前人相关报道一致，本文结果显示与正常对照组织相比，Caspase-3的蛋白和mRNA的表达量随着乳腺肿瘤病变程度的加深而不断降低，且Caspase-3的表达与Bcl-2的表达呈负相关，可能是在乳腺肿瘤发展过程中随着Bcl-2表达的增加，抑制了Caspase-3的活性，导致细胞凋亡被抑制，从而使癌细胞不断增殖。本文结果提示Caspase-3与大鼠自发型乳腺肿瘤的发生和发展中的细胞凋亡有密切的关系，Caspase-3参与了一系列与凋亡相关的细胞变化过程，且与Bcl-2共同参与了细胞凋亡的调节机制，在乳腺癌的发生和发展过程中发挥重要作用，提示其有可能成为乳腺癌靶向治疗和预后评估的参考。

综上所述，乳腺肿瘤在雌性大鼠中发病较高，但是在本试验中却未见雄性乳腺肿瘤的发生。Bcl-2、Bax和Caspase-3均参与了自发性乳腺肿瘤的发生过程。Caspase-3、Bax表达的降低以及Bcl-2表达的升高可能与自发性乳腺肿瘤恶化有关，且Bcl-2与Caspase-3和Bax分别有着密切的关系，将Bcl-2、Bax和Caspase-3联合分析，完全将促凋亡、抗凋亡以及凋亡执行者联合起来，使临床上联合三者来进行乳腺肿瘤的早期诊断成为一种可能，同时也可利用这些敏感指标判定乳腺肿瘤的发生、发展及预后。