光照是影响植物生长发育的重要环境因子之一^[1]。光照不足即弱光会导致作物碳固定减少，光合作用降低，叶片衰老加快，因而导致产量明显降低^{[2, 3, 4, 5, 6]}。除了影响产量，弱光胁迫通过影响稻米的组分，也对稻米品质有着重要影响。蛋白质作为水稻的重要组分之一，其含量以及组成直接影响着稻米品质，如何提高稻米蛋白质含量兼顾营养品质一直受到研究者的重视^[7]。关于弱光对稻米籽粒蛋白质的影响，前人已做了相关研究。例如刘奇华等^[8]研究指出在插秧至幼穗分化期弱光不利于蛋白质的合成，而在抽穗至成熟期弱光则利于蛋白质的积累。任万军等^[9]和MO等^[10]同样研究发现灌浆期弱光可提高稻米蛋白质含量。蛋白质合成过程中，谷氨酰胺合酶(glutamine synthetase，GS)、谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(glutamic oxalo-acetic transaminase，GOT)和谷氨酸-丙酮酸转氨酶(glutamate pyruvate transaminase，GPT)是涉及氮代谢的关键酶，其活性显著影响着蛋白质与氨基酸含量^{[11, 12, 13]}。自然界中的无机氮主要通过谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶循环同化NH₄⁺为谷氨酸和谷氨酰胺，该过程是整个氮代谢的中心环节，进而又通过GOT和GPT等转氨酶作用转化为其他必需或非必需氨基酸，为蛋白质合成提供前体物质。尽管前人关于弱光胁迫对稻米籽粒蛋白质的影响已经进行了大量研究，但关于弱光对氮代谢关键酶(GS，GOT，CPT)的影响还鲜有报道。鉴于此，本文探讨了水稻灌浆结实期不同程度弱光胁迫对籽粒氮代谢关键酶、可溶性蛋白质以及成熟时蛋白质与氨基酸组分的影响，以探讨影响稻米品质的机制。

供试水稻品种为粳稻越光和秋田小町，籼稻IR72，以及杂交籼稻冈优527等4个品种。

试验于2013年4—9月在四川农业大学教学农场进行，供试土壤为紫色土，基础肥力：有机质20.18 g/kg，全氮1.31 g/kg，速效氮110.95 mg/kg，速效磷26.52 mg/kg，速效钾143.43 mg/kg。试验地的肥料用量为尿素322.5 kg/hm²、过磷酸钙630 kg/hm²、氯化钾240 kg/hm²，分蘖期追施尿素，基追肥施用比例为7∶3，其余采用大田常规管理，确保栽培管理措施无差异。

试验采用对比实验方案，设置2个处理，分别为遮光25%(A₁)和遮光50%(A₂)，以自然条件为对照(CK)。遮光处理为水稻开花后，在高约1.5 m铁架上挂上白色纱布为A₁处理，挂黑色遮阴网为A₂处理，每小区面积16 m²，重复3次。每小区选取生长基本一致的植株挂牌标记，自遮光后第10天起每7 d选取各穗强势籽粒取样1次，取样直至籽粒成熟。取样时间在上午8:00—9:00，样品用液氮速冻，并放入-80 ℃冰箱中保存，以待后期酶活测定。水稻成熟后另取样品置于80 ℃烘箱中烘干后脱糙、粉碎，并过100目筛，以进行蛋白质、氨基酸的测定。

GS活性测定根据赵全志等^[14]方法，取25粒水稻籽粒，加入缓冲液(pH 8.0)研磨并离心制成粗酶液。取0.7 mL粗酶液和0.7 mL ATP，并与1.6 mL反应混合液(Tris，MgSO₄·7H₂O、谷氨酸钠盐、半胱氨酸、EDTA、盐酸羟胺，pH 7.4)混合，于30 ℃下保温30 min，加入显色剂并离心，在540 nm测定吸光值。酶活性单位定义为30 ℃下30 min内平均每1 min反应液AODs等于0.01为1个酶活性单位。

GOT和GPT活性采用吴良欢等^[15]的方法，籽粒加缓冲液(pH 7.2)研磨并离心制成粗酶液。取10 mL试管加入酶粗制剂0.1 mL 和GOT(或GPT)底物液0.5 mL，37 ℃下水浴30 min，加入2，4-二硝基苯肼液0.5 mL终止反应，37 ℃水浴20 min后加入0.4 mol/L NaOH 5 mL，在500 nm下比色。GOT或GPT活性以每1 g鲜样在30 min内平均每1 min反应生成的丙酮酸1 μmol表示。

可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法^[16]；蛋白质含量测定使用瑞典Buchi B-324全自动凯氏定氮仪测定；氨基酸含量测定使用日立L-8800氨基酸分析仪测定。

以上测定至少重复3次，使用SigmaPlot 12.5及Excel 2007制作图表，并使用SAS Enterprise Guide 4.3进行方差分析及显著性检验。

从图1可以看出，水稻灌浆期GS活性呈单峰曲线变化，总的表现为随灌浆进程逐渐上升，到达峰值后又逐渐下降，冈优527和IR72均比越光和秋田小町提前7 d到达峰值。方差分析可知，GS活性品种间表现差异显著，越光和秋田小町显著高于冈优527和IR72。弱光下GS活性显著降低，且影响程度随着弱光程度的增加而加深(A₂＞A₁)。总体上，4个品种在A₁和A₂处理下GS活性分别比对照下降11.61%～19.36%和20.01%～30.52%，其中以冈优527下降幅度最大。

图1(Figure 1)

图1 灌浆结实期籽粒中谷氨酰胺合成酶活性的动态变化 Fig.1 Dynamic changes of GS activities of rice during the seed filling stage

如图2所示，除秋田小町GOT活性在灌浆期先上升后下降外，其余3个品种GOT活性均随着灌浆进程而下降，下降程度依次为越光＞IR72＞冈优527。方差分析可知，弱光显著提高了4个品种的GOT活性，且弱光程度越深GOT活性越高(A₂＞A₁)。4个品种在A₁与A₂处理下GOT活性分别比对照提高14.02%～23.02%和26.07%～36.82%。

图2(Figure 2)

图2 灌浆结实期籽粒中谷氨酸-草酰乙酸转氨酶活性的动态变化 Fig.2 Dynamic changes of GOT activities of rice during the seed filling stage

GPT趋势总体在4个品种间表现较为一致(图3)，除秋田小町A₂处理外，其余均随着灌浆进程而下降，总体下降程度依次为越光＞冈优527＞秋田小町＞IR72。与GOT表现相似，4个品种弱光处理均极显著提高了GPT活性，且随着弱光程度加深GPT提高更加明显(A₂＞A₁)。总体上，4个品种A₁和A₂处理GPT活性分别比对照提高11.81%～33.83%和26.07%～61.07%，以冈优527影响程度最深。

图3(Figure 3)

图3 灌浆结实期籽粒中谷氨酸-丙酮酸转氨酶活性的动态变化 Fig.3 Dynamic changes of GPT activities of rice during the seed filling stage

如图4所示，4个品种籽粒的可溶性蛋白质含量均随着灌浆进程呈下降趋势，下降程度依次为越光＞IR72＞秋田小町＞冈优527。方差分析表明，弱光极显著地提高了籽粒中的可溶性蛋白质含量，且弱光程度越重其含量越高。在A₁和A₂处理下可溶性蛋白质平均含量分别比对照提高12.06%～36.77%和31.19%～70.51%，其中以越光增加程度最大，其次是冈优527。

图4(Figure 4)

图4 灌浆结实期籽粒中可溶性蛋白质含量的动态变化 Fig.4 Dynamic changes of the soluble protein content of rice during the seed filling stage

图5可知，弱光有利于蛋白质的合成。其中A₁处理显著提高了蛋白质含量，而A₂处理极显著提高了蛋白质含量。在A₁和A₂处理下，蛋白质分别比对照提高6.43%～13.38%和16.02%～28.89%。籼稻IR72和冈优527增幅高于粳稻越光和秋田小町。

图5(Figure 5)

图上不同大写字母表示在P＜0.01水平差异有高度统计学意义. Different capital letters above the bar indicate statistically highly significant differences at the 0.01 probability level． 图5 弱光处理对水稻成熟籽粒蛋白质含量的影响 Fig.5 Effect of low light on protein content of rice grain

同弱光对蛋白质影响的表现基本一致，弱光处理总体上显著提高了氨基酸含量(表1)，且提高程度A₂＞A₁。但值得一提的是冈优527在弱光处理下的蛋氨酸含量低于对照(A₁低16.41%，A₂低5.13%)，秋田小町和冈优527赖氨酸在A₁处理下均低于对照，其余品种在弱光处理下氨基酸各组分含量均高于对照。总体而言，必需氨基酸含量在A₁和A₂处理下分别比对照高3.86%～11.86%和16.37%～22.15%，非必需氨基酸分别高3.47%～22.96%和15.72%～23.64%。综合起来，在A₁和A₂处理下氨基酸总含量比对照分别提高3.62%～20.25%和16.04%～22.48%。

表1(Table 1)

表1 弱光处理对水稻成熟籽粒氨基酸组分含量的影响Table 1 Effect of low light on amino acid contents of rice grain at maturity

表1 弱光处理对水稻成熟籽粒氨基酸组分含量的影响Table 1 Effect of low light on amino acid contents of rice grain at maturity w/(mg/g) 种类 Type 氨基酸 Amino acid 处理 Treatment 越光 Koshihikari 秋田小町 Akitakomachi 冈优527 Gangyou 527 IR72 必需氨基酸 Essential amino acid 苏氨酸 Threonine CK 2.33±0.02Cc 2.15±0.02Bb 1.90±0.02Bc 2.22±0.03Bc A1 2.59±0.02Bb 2.21±0.02Bb 2.29±0.02Ab 2.55±0.05Ab A2 2.77±0.04Aa 2.52±0.02Aa 2.41±0.02Aa 2.73±0.04Aa 蛋氨酸 Methionine CK 1.46±0.03Bb 1.08±0.02Bb 1.95±0.03Aa 1.63±0.04Bc A1 1.81±0.02Aa 1.49±0.04Aa 1.63±0.02Bb 2.44±0.03Aa A2 1.91±0.03Aa 1.55±0.04Aa 1.85±0.02Aa 1.89±0.04Bb 缬氨酸 Valine CK 4.50±0.07Bb 4.23±0.04Bc 4.36±0.04Bb 4.28±0.06Cc A1 5.21±0.08Aa 4.43±0.05Bb 4.51±0.03ABb 5.69±0.05Aa A2 5.39±0.08Aa 5.38±0.05Aa 4.73±0.03Aa 5.18±0.07Bb 亮氨酸 Leucine CK 6.61±0.07Bb 6.01±0.05Cc 5.22±0.06Cc 5.80±0.05Bb A1 7.52±0.04Aa 6.33±0.06Bb 6.18±0.07Bb 7.27±0.06Aa A2 7.66±0.08Aa 7.59±0.07Aa 6.53±0.07Aa 7.07±0.08Aa 苯丙氨酸 Phenylalanine CK 4.69±0.07Bb 4.28±0.07Bb 3.68±0.05Bb 3.93±0.10Bb A1 5.05±0.04Aa 4.29±0.09Bb 4.28±0.06Aa 4.81±0.11Aa A2 5.18±0.06Aa 5.04±0.10Aa 4.45±0.06Aa 4.92±0.09Aa 赖氨酸 Lysine CK 3.17±0.04Bb 3.24±0.04Aa 2.85±0.04Bb 2.89±0.04Bb A1 3.22±0.07ABb 2.87±0.04Bb 2.82±0.04Bb 3.57±0.04Aa A2 3.40±0.06Aa 3.24±0.04Aa 3.10±0.04Aa 3.51±0.05Aa 异亮氨酸 Isoleucine CK 3.12±0.04Bb 2.75±0.02Cc 2.58±0.03Bb 2.92±0.04Bb A1 3.58±0.04Aa 3.08±0.04Bb 3.10±0.03Aa 3.64±0.04Aa A2 3.76±0.05Aa 3.58±0.03Aa 3.19±0.04Aa 3.60±0.05Aa 天冬氨酸 Aspartic acid CK 5.88±0.04Bb 5.55±0.04Cc 4.70±0.02Cc 5.23±0.04Bb A1 6.75±0.05Aa 5.72±0.05Bb 5.66±0.03Bb 6.34±0.04Aa A2 6.89±0.06Aa 6.83±0.04Aa 5.84±0.04Aa 6.40±0.06Aa 非必需氨基酸 Non-essential amino acid 谷氨酸 Glutamic acid CK 13.26±0.13Bb 12.46±0.10Bc 11.04±0.10Bc 11.91±0.09Cc A1 15.27±0.11Aa 12.87±0.08Bb 12.71±0.10Ab 15.30±0.10Aa A2 15.34±0.11Aa 15.61±0.09Aa 13.32±0.10Aa 14.52±0.10Bb 组氨酸 Histidine CK 1.91±0.02Cc 1.84±0.02Bb 1.63±0.02Bc 1.75±0.02Cc A1 2.15±0.04Bb 1.87±0.02Bb 1.79±0.02Ab 2.13±0.02Bb A2 2.36±0.04Aa 2.22±0.02Aa 1.88±0.02Aa 2.31±0.03Aa 精氨酸 Arginine CK 5.99±0.10Bc 5.62±0.05Cc 4.99±0.06Bb 5.34±0.07Bc A1 6.95±0.06Ab 6.08±0.06Bb 5.81±0.07Aa 6.76±0.08Aa A2 7.19±0.06Aa 7.23±0.07Aa 5.77±0.08Aa 6.48±0.06Ab 胱氨酸 Cystine CK 2.45±0.02Cc 2.35±0.02Bb 2.19±0.03Bb 2.34±0.04Bb A1 2.56±0.02Bb 2.31±0.02Bb 2.26±0.03Bb 2.35±0.03Bb A2 2.73±0.03Aa 2.43±0.02Aa 2.53±0.04Aa 2.65±0.03Aa 丙氨酸 Alanine CK 4.08±0.08Cc 3.60±0.10Bb 3.69±0.04Bb 3.59±0.10Bc A1 4.58±0.08Bb 3.68±0.07Bb 4.07±0.05Aa 5.08±0.09Aa A2 4.74±0.07Aa 4.67±0.13Aa 4.23±0.06Aa 4.59±0.10Ab 甘氨酸 Glycine CK 3.22±0.03Bb 2.99±0.03Bc 2.44±0.02Cc 3.15±0.02Bc A1 3.82±0.04Aa 3.21±0.04Bb 3.01±0.02Bb 3.26±0.02Bb A2 3.94±0.05Aa 3.83±0.03Aa 3.31±0.02Aa 3.76±0.03Aa 脯氨酸 Proline CK 6.06±0.09Bb 5.80±0.06Bb 3.13±0.07Cc 5.32±0.06Bb A1 6.93±0.05Aa 5.38±0.08Bc 5.95±0.07Aa 4.10±0.07Cc A2 6.88±0.09Aa 6.40±0.08Aa 5.27±0.08Bb 6.94±0.08Aa 酪氨酸 Tyrosine CK 1.55±0.04Aa 1.28±0.08Bb 1.12±0.07Bb 1.72±0.02Bc A1 0.91±0.04Cc 1.85±0.07Aa 1.88±0.10Aa 1.81±0.04ABb A2 1.36±0.04Bb 1.83±0.06Aa 1.17±0.09Bb 1.95±0.03Aa 丝氨酸 Serine CK 4.60±0.05Bc 4.39±0.02Bc 3.74±0.03Bc 4.26±0.03Bb A1 5.14±0.06Ab 4.48±0.02Bb 4.29±0.03Ab 5.02±0.05Aa A2 5.36±0.06Aa 5.17±0.02Aa 4.52±0.04Aa 5.08±0.05Aa 氨基酸总含量 Total content of amino acids CK 74.86±0.45Cc 69.62±0.32Bc 61.20±0.42Cc 68.28±0.49Bb A1 84.03±0.27Bb 72.14±0.32Bb 72.21±0.26Bb 82.11±0.35Aa A2 86.87±0.26Aa 85.11±0.44Aa 74.10±0.10Aa 83.63±0.42Aa 同列数据后的不同大、小写字母分别表示同一氨基酸不同处理间在P＜0.01和P＜0.05水平差异有统计学意义. Values within the same column followed by different capital and lowercase letters indicate the significant difference of the same amino acid among different treatment groups at the 0.01 and 0.05 probability levels,respectively.

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在水稻中，氮元素主要是通过GS/GOGAT(谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶)途径同化为谷氨酰胺或谷氨酸，进而转化为其他氨基酸^{[17, 18]}。作为典型的喜铵植物，GS在水稻氮素营养过程中乃至产量、品质的形成过程中起着关键性的作用^[11]。金正勋等^[11]研究指出，在灌浆前期籽粒中GS活性与水稻食味值、最高黏度、崩解值呈负相关，而在灌浆后期呈正相关；同时，还发现GS在灌浆前期与蛋白质呈正相关，灌浆中后期则呈负相关，据此分析GS可能主要通过影响蛋白质的合成而间接影响水稻的蒸煮食味品质。而黄星等^[19]研究指出GS与蛋白质相关性不显著，而与可溶性蛋白质含量呈显著负相关。曹珍珍等^[20]则指出GS与可溶性蛋白质含量呈极显著正相关。在本实验中，GS活性在籽粒中随弱光程度加深而下降明显，而可溶性蛋白质、蛋白质和氨基酸含量却随着弱光加深而显著上升，GS与可溶性蛋白质、蛋白质和氨基酸均呈显著负相关。OBENDORF等^[21]研究指出，谷氨酰胺主要是在叶片中生成，然后转运到籽粒中，再在籽粒中转化为其他氨基酸^{[22, 23]}。这表明，氨同化过程可能主要发生在叶片中，籽粒中GS活性变化对蛋白质合成影响较小^{[12, 24]}，这可能与水稻籽粒在弱光胁迫下的防御代谢有关，但还有待于进一步研究^{[19, 20]}。除了氨同化过程，转氨基作用同样是植物体内氮代谢的重要环节。在水稻籽粒发育过程中，GOT可以促进L-谷氨酸与草酰乙酸合成L-天冬氨酸，进而合成限制性必需氨基酸；GPT则是负责催化谷氨酸和丙酮酸之间的转氨作用促进生成新的酮酸和α-氨基酸；水稻籽粒通过GOT和GPT的转氨作用最终促进蛋白质的合成^[25]。前人研究表明GOT和GPT活性上升显著提高了蛋白质含量^{[12, 26]}。同样，在本实验中，GOT和GPT活性均随着弱光加深而显著提高，相关分析表明，GOT和GPT均与蛋白质含量呈极显著正相关。这表明，相对于GS，GOT和GPT可能显著影响着水稻籽粒中蛋白质合成。

前人多数研究已表明灌浆结实期弱光有利于蛋白质的积累^{[8, 10, 27]}，这也可以从弱光下碳水化合物的减少可见。任万军等^[9]研究指出，弱光下稻株全氮含量会增加并促进氮素向籽粒转移，因而促进蛋白质的合成。本研究同样发现弱光下籽粒中蛋白质含量均显著增加，且随着弱光程度的加深而增强(A₂＞A₁)，这也同董明辉等^[28]的研究结果是一致的。除了蛋白质含量，籽粒可溶性蛋白质含量也显著增加，且A₂＞A₁。可溶性蛋白质主要在同化物代谢过程中起着重要的作用，能提高细胞可溶性物质含量，从而增强细胞抗逆境能力^[29]。

稻米营养价值的高低，不仅取决于蛋白质含量，还受其他品质成分的影响，尤其是必需氨基酸含量^[7]。在本研究中，弱光显著增加了籽粒的氨基酸含量，其中必需氨基酸和非必需氨基酸含量增幅较为一致，均是A₂＞A₁，这同周广洽等^[30]的研究结论是一致的。氨基酸含量的提高主要由于GOT和GPT等酶活性的增强，由相关性分析可知，GOT和GPT活性也同氨基酸含量呈极显著正相关。在必需氨基酸中，赖氨酸被认为是稻米蛋白质合成的第一限制性氨基酸，苏氨酸和蛋氨酸则分别是第二、三限制性氨基酸^{[31, 32]}。在本研究中，3个氨基酸组分在品种间表现有所差异，其中赖氨酸含量在秋田小町和冈优527 A₁处理下甚至低于对照，其余品种在弱光处理下增幅也不高；4个品种的苏氨酸含量在弱光处理下均显著增加；蛋氨酸含量除冈优527弱光下降低外，其余均显著提高。这表明氨基酸组分除受环境因子影响外，品种间差异也不可忽视^[33]。

综上所述，灌浆结实期在弱光处理下，水稻籽粒中GS活性显著降低，而GPT、GOT、可溶性蛋白质、蛋白质以及氨基酸含量均明显增加，且影响程度随着弱光的加深而加重。说明在未来关于稻米蛋白质研究过程中，应更加注重GOT和GPT的活性。值得一提的是，虽然弱光下稻米的蛋白质含量升高，但过高的蛋白质同样会导致米饭的蒸煮食味品质下降，因此，未来研究在注意提高稻米营养品质的同时，应同时兼顾营养品质与食味品质的均衡。