抗体制备技术的发展，已经历了多克隆抗体技术、单克隆抗体技术和抗体库技术3个发展阶段^[1]。单克隆抗体技术的出现，解决了多克隆抗体亲和力、特异性相对较低和难以重复制备的问题。而抗体库技术的出现，则能以体外建库和筛选代替单克隆抗体复杂的免疫和杂交瘤筛选过程，被誉抗体制备创新性的换代技术，随着相关行业的发展迅猛，国内外已有大量抗体库筛选的报道^{[2, 3, 4, 5]}。 然而，抗体库来源的抗体与传统的单、多克隆抗体相比，实际应用非常少见，究其原因是由于库来源抗体与天然抗体相比，亲和力偏低，难以满足多种实际应用需求。特别是来自于未经免疫的天然抗体库中的抗体，抗体的亲和力通常在微摩尔水平，这仅与动物在初次免疫应答后获得的抗体亲和力水平相当^[6]。与此同时，天然抗体的亲和力通常存在一个“天花板效应”，通过免疫获得的天然抗体亲和力通常低于100 pmol/L，这是由于B细胞受体难以区分更低的解离速率造成的。可是，抗体的亲和力体外成熟技术却可以帮助解决这些问题。

要想实现抗体的亲和力体外成熟，就必须充分地了解天然抗体的亲和力体内成熟原理；设计模拟体内可能出现和存在的变化，从而促进抗体的体外进化^[7]。

天然抗体的亲和力成熟可以分为体细胞高频突变和克隆选择2个过程。机体接受抗原刺激后，体细胞发生高频突变，突变产生的各种亲和力不同的B细胞克隆，经过滤泡树突细胞捕获，使得后代B细胞及其产生的抗体对抗原的平均亲和力得到了提升，天然抗体从而实现了亲和力的体内成熟。

在天然抗体亲和力成熟的过程中，抗原刺激下的体细胞高频突变有着举足轻重的作用，因此亲和力体外成熟的策略也多在抗体基因突变水平上，即采用各种突变方法来模拟体内的高频突变。本文将对抗体亲和力体外成熟技术中常用的突变方法加以介绍。

易错PCR技术是最常用的抗体基因突变技术，可以在抗体基因的全长或部分区域随机引入突变。该技术可以通过提高镁离子浓度、加入锰离子、失衡4种脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate，dNTPs)浓度、使用低保真DNA聚合酶等方法，来提高抗体基因的突变率^[8]。

除此之外，突变率的高低也可以采用改变模板DNA的复制次数进行控制。复制次数越多，突变率将累积得越高。因此，要想获得高突变率，可以采用低浓度的DNA模板同时增加PCR循环数来实现。但是，随着突变率的提高也将造成大量突变抗体失活，从而影响突变库库容。表1中列出了一些易错PCR的应用实例，DAUGHERTY等^[9]对易错PCR的突变率与抗体活性保留关系进行了研究。通过对地高辛单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)进行低(0.22%)、中(0.5%)和高(3%)3个水平的随机突变研究，表明随着突变率的提高，突变库中活性克隆所占比例大幅下降，在3种突变率下对应的活性克隆比例分别为40%、6.7%和0.17%。但是，亲和力提高最多的克隆(提高1.9倍)仍然来自于高频突变库。

表1(Table 1)

表1 易错PCR、DNA改组和突变株技术在抗体亲和力成熟中的应用实例Table 1 Examples of antibodies affinity-maturation by error PCR,DNA shuffling and mutator strains

表1 易错PCR、DNA改组和突变株技术在抗体亲和力成熟中的应用实例Table 1 Examples of antibodies affinity-maturation by error PCR,DNA shuffling and mutator strains 抗原 Antigen 抗体 Antibody 突变方法 Mutation method 最佳克隆 Best affinity 展示及筛选方法 Display and selection 亲和力 提高倍数 Affinity gain 参考文献 Reference 地高辛 Digoxin scFv 易错PCR Error PCR 0.5 nmol/L 大肠埃希菌展示,荧光活性细胞分选,解离筛选法 Escherichia coli surface display,flow cytometric selection (FACS),off-rate selection 1.9 [9] 黄体酮-BSA Progesterone-BSA Fab,scFv 易错PCR Error PCR 3 μmol/L 噬菌体展示 Phage display 30 [10] 睾丸激素 Testosterone Fab 易错PCR Error PCR 2 nmol/L 噬菌体展示 Phage display 200 [11] 链霉亲和素 Streptavidin Fab 易错PCR Error PCR 3.2 nmol/L 酵母展示,荧光活性细胞分选 Yeast display,FACS 10.7 [12] 人IgE单克隆抗体 Human anti-IgE monoclonal antibodies scFv 易错PCR Error PCR 51 pmol/L 酵母展示 Yeast display 20 [13] 前胃蛋白酶释放肽 Progastrin releasing peptide scFv DNA改组 DNA shuffling — 噬菌体展示 Phage display 800~9001) [14] 荧光素 Fluorescein scFv 易错PCR和DNA改组联用 Error PCR and DNA shuffling 48 fmol/L 酵母展示,荧光活性细胞分选,解离筛选法 Yeast display,FACS,off-rate selection 208 [15] 短肽 Short peptide scFv 易错PCR和DNA改组联用 Error PCR and DNA shuffling 5 pmol/L 核糖体展示,解离筛选法 Ribosome display,off-rate selection 500 [16] 2-苯基-5-噁唑酮 2-phenyl-5-oxazolone scFv 突变株 Mutator strains 3.2 nmol/L 噬菌体展示,液相筛选 Phage display,selection in solution 100 [17]  —:未检出;1):表示酶联免疫吸附测定信号提高800~900倍。  “—” indicate not detected; 1) Increasing (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) signal by 800-900 times.

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GRAM等^[10]从非免疫鼠组合抗体库中获得的Fab抗体，对黄体酮-牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的亲和力仅为10^-4~10^-5 mol/L，作者随后采用易错PCR法对4个抗体基因模板重、轻链可变区随机突变，PCR体系采用了系列浓度的模板DNA和优化的MgCl₂、MnCl₂以及dNTP浓度，筛选到的最佳克隆较母体抗体亲和力提高了30倍，突变率为1.5%。作者观察到的最主要突变形式是A/G和T/C的替换，同时发现突变热点的存在。PERSSON等^[11]采用Ampli Taq聚合酶，对将睾丸激素抗体结合片段(fragment antibody-binding，Fab)进行随机突变，结果表明构建的2个突变库CTep1和CTep2的突变率分别是0.77%和0.87%，其中89%的突变含有插入碱基，而80%突变存在于抗体的框架结构。作者随后采用了逐轮减少抗原浓度、改变和洗脱捕获条件等方法，获得的最佳克隆亲和力为2 nmol/L，亲和力提高了200倍。

DNA改组技术是对同源的抗体基因，采用脱氧核糖核酸酶Ⅰ将其切割成不超过50 bp的片段，再随机组合后进行PCR扩增成完整的抗体基因。它包含了抗体片段随机化切割、重组和筛选的过程，一定程度上模拟了天然抗体的亲和力成熟过程，并加快了体外定向进化速度^{[18, 19]}。采用连续多轮的DNA改组具有去除有害突变优势^[20]。另外，DNA改组获得的突变体，突变位点可以位于非抗原直接接触的区域，有扩大库容的作用^[7]。

为了获得足够多的点突变，DNA改组技术还常与易错PCR技术联用。BODER等^[15]以荧光素单链抗体4-4-20为研究对象，其亲和力为0.3 nmol/L，已接近于天然抗体所能获得的最大亲和力，但是通过DNA改组和易错PCR的组合应用对其进行了四轮突变及筛选后，获得的最佳克隆4M5.3在PBS的半数解离常数达到了5 d，比母体抗体延长了4个数量级，解离时间超过了生物素与链霉亲和素的解离时间。在LSB溶液中与生物素化荧光素的亲和力可达48 fmol/L，比4-4-20提高了208倍，是目前公开报道的亲和力最高的非共价结合物。

Escherichia coli MutD5是最常用的大肠埃希菌突变株，该菌株具有校对和复制后错配修复缺陷，可以产生高频率的单个碱基替换，突变率高于普通菌株10⁵倍。突变株法的优势是突变发生在转化宿主菌后，而其他方法的突变均发生于转化之前，而转化效率是限制大容量突变库构建的关键因素之一。使用突变株法可以构建库容为10¹²~10¹⁴个克隆的超大容量抗体库，但是该方法较难对突变率进行控制，且获得的随机突变也可能发生于载体部分，造成有害突变。

LOW等^[17]采用E. coli MutD5对半抗原3-苯基-噁唑酮抗体进行突变，获得的突变体亲和力可达3.2 nmol/L，亲和力提高了100倍。MUTEEB等^[21]也报道了采用E. coli XL1-red作为突变菌株的研究。

由于天然抗体在亲和力成熟过程中，体细胞高频突变发生区域并非均匀分布，而是主要集中在与抗原直接接触的CDR区。这样既可以获得足够的序列多样性，又不会破坏蛋白质结构。因此在抗体的亲和力体外成熟中，CDR区是最常选用的定点突变区域。

在表2所列出的一系列定点突变中，有平行对多个CDR进行突变或对多个CDR进行逐步优化，即CDR步行法(CDR walking)。STEIDL等^[22]报道了对CDR-H2区的突变，将母体抗体亲和力提高近300倍。除了CDR区的点突变外，LAMMINMAKI^[23]和PARHAMI-SEREN^[24]通过增加 CDR-H2 loop环长度的方法提高半抗原特异性抗体的亲和力。KOBAYASHI^[25]则对半抗原17β-雌二醇母体抗体进行了2步法突变，首先是在抗体的CDR H2，H3，L1和L3进行了CDR改组，对该突变库中筛选出亲和力提高的克隆，再进行重、轻链可变区的易错PCR，多轮筛选获得的最佳克隆亲和力提高了10倍。

表2(Table 2)

表2 定点突变法在抗体亲和力成熟中的应用实例Table 2 Examples of antibodies affinity-maturation by site-directed mutagenesis

表2 定点突变法在抗体亲和力成熟中的应用实例Table 2 Examples of antibodies affinity-maturation by site-directed mutagenesis 抗原 Antigen 抗体 Antibody 突变方法 Mutation method 最佳克隆 Best affinity 展示及筛选方法 Display and selection 亲和力 提高倍数 Affinity gain 参考文献 Reference 粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Fab CDR-L3,CDR-H2 400 fmol/L 噬菌体展示, 逐轮增加洗涤强度 Phage display,increasing washing stringency 5 000 [22] 胃泌激素 Gastrin scFv CDR-H3,CDR-L3 13.2 nmol/L 噬菌体展示,液相筛选,逐轮减少筛选抗原浓度 Phage display,selection in solution,decreasing antigen concentration 454 [26] VEGF Fab CDR-H1,CDR-H3,框架区 CDR-H1,CDR-H3,framework 0.14 nmol/L 噬菌体展示,解离筛选法 Phage display,off-rate selection 22 [27] 金属蛋白酶1 Metalloproteinase 1 Fab CDR步行 CDR walking 0.15 nmol/L 噬菌体展示,抗原竞争洗脱 Phage display,selection with competing antigens 13 [28] 白细胞抗原-DR Leukocyte antigen-DR Fab CDR步行 CDR walking 2.7 nmol/L 噬菌体展示 Phage display 130 [29] 肿瘤抗原 Tumor antigen scFv CDR步行 CDR walking 1.1 nmol/L 噬菌体展示,液相筛选 Phage display,selection in solution 145 [30] HIV-1衣壳糖蛋白gp120 HIV-1 envelope glycoprotein gp120 Fab CDR步行 CDR walking 66 pmol/L 噬菌体展示,解离筛选 Phage display,off-rate selection 96 [31] 副甲状腺激素衍生肽 Parathyroid hormone VHH 热点突变 Hotspot randomization 2 μmol/L 核糖体展示 Ribosome display 30 [32]

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然而，由于单链抗体或Fab抗体具有6个CDR区，抗体与抗原结合过程中又涉及多个CDR。因此在确定对抗原结合起作用氨基酸残基，以及CDR边缘氨基酸残基对亲和力起作用方面相当复杂。为了解决这一问题，近年来最突出的进展是利用抗体晶体结构信息或计算机辅助设计，来分析与抗原直接接触的氨基酸位点。BARDERAS等^[26]采用了胃泌激素抗体可变区的3D结构模型来辅助预测抗原结合部位的氨基酸位点，设计采用的CDR步行法将胃泌激素单链抗体的亲和力提高了454倍。

除了CDR区突变外，天然抗体亲和力成熟中的突变热点(hotspot)也是常见的定点突变位点。这些热点通常包含或接近AGY和RGYW (R=A or G；Y=C or T；W=A or T)序列^[32]。

链替换是保留某个特定抗体的重链或轻链，并与一个随机化的互补链进行组合，从中筛选更高活性的突变株(表3)。由于通常认为抗体的重链CDR3区对抗体的结合能力至关重要，因此轻链的替换较为常见。FITZGERALD等^[33]将提取第5轮筛选后的溴氯哌喹酮scFv重链可变区基因与原始抗体库的轻链基因随机组合，构建了库容1.25×10⁷的轻链替换库，从中筛选到最佳克隆建立的ELISA检测方法，灵敏度可达80 pg/mL，比母体抗体提高了185倍。

表3(Table 3)

表3 链替换在抗体亲和力成熟中的应用实例Table 3 Examples of antibodies affinity-maturation by chain shuffling

表3 链替换在抗体亲和力成熟中的应用实例Table 3 Examples of antibodies affinity-maturation by chain shuffling 抗原 Antigen 抗体 Antibody 突变方法 Mutation method 最佳克隆 Best affinity 展示及筛选方法 Display and selection 亲和力 提高倍数 Affinity gain 参考文献 Reference 溴氯哌喹酮 Halofuginone scFv 轻链替换 Light chain shuffling — 噬菌体展示,逐轮 减少筛选抗原浓度 Phage display,decreasing antigen concentration 185 [33] N-羟乙酸基GM3神经节苷脂 N-glycolyl GM3 ganglioside scFv 轻链替换 Light chain shuffling 15 nmol/L 噬菌体展示 Phage display 1.7 [34] IgG Fab 轻链替换 Light chain shuffling 45 pmol/L 噬菌体展示,逐轮减少筛选抗原浓度 Phage display,decreasing antigen concentration 92 [35] 白细胞介素-15 Interleukin-15 Fab 轻链替换 Light chain shuffling 6 nmol/L 噬菌体展示,逐轮减少筛选抗原浓度 Phage display,decreasing antigen concentration 36 [36] 肝炎B病毒preS1 Hepatitis B virus preS1 scFv 重链替换 Heavy chain shuffling 19 nmol/L 噬菌体展示,逐轮增加洗脱次数 Phage display,increasing washing times 6.5 [37] 血清学检测的雄性特异性抗原 Serologically detected male antigen Fab 轻、重链替换组合应用 Light and heavy chain shuffling — 噬菌体展示 Phage display 1.91) [38]  —:未检出;1)表示ELISA信号提高1.9倍。 “—”indicate not detected; 1) Increasing ELISA signal by 1.9 times.

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链替换技术除了可以用于提高抗体亲和力外，也有对抗体特异性、稳定性提高方面的报道。该技术可以用于鼠源抗体的人源化改造^[40]，帮助解决杂交瘤来源的抗体转变为单链抗体形式后，在原核表达中出现失活的问题^[34]。

除了轻链替换外，也有重链替换或两者组合应用的成功报道。PARKER等^[37]通过对母体抗体结构分析，认为轻链在抗原识别中起到决定性作用，因此采用了重链替换的方法对肝炎B病毒scFv进行改造，获得的最佳克隆比母体抗体亲和力提高了6.5倍。KRAMER^[38]则对阿特拉津单链抗体的重链和轻链依次进行置换，亲和力成熟抗体的检测灵敏度由最初的5.1 μg/L提高到0.2 μg/L，抗体的特异性也有所改善。

近年来学术界虽然在应用基因突变技术实现抗体亲和力体外成熟中取得了一些进展，但由于人们对亲和力体外成熟的分子基础方面的认知不够明确，抗体的突变策略选择仍然较为盲目，获得成熟抗体的效率不高。

在现有的抗体亲和力成熟分子基础研究中，通过对成熟抗体与母体抗体序列比对分析，可以证明抗体的CDR3氨基酸对于亲和力成熟演化过程非常重要，然而主要用于维持抗体结构保守性、折叠功能和稳定性的框架结构序列，对抗原结合作用也存在影响^{[41, 42]}。氨基酸序列的差异对抗体功能性影响，在不同区域呈现的相关性又会不同，因此仅采用氨基酸序列分析的方法，难以精确预测出哪些位点的突变会对抗体亲和力的改变产生影响^[43]。

为了解决这些问题，可以采用X射线晶体衍射或是核磁共振的方法对亲和力成熟抗体及其抗原复合物的三维结构进行分析^{[44, 45]}。或采用计算机模型来模拟“抗原-抗体”的互作过程，用于预测亲和力成熟的关键位点。对范德华力、氢键、亲水性、构型、电荷互补、变构效应、可塑性和协调性等物化因子进行测定，也可对“抗原-抗体”复合物的形成做定量分析，以增加对亲和力成熟过程的理解，并为突变位点的理性设计提供有效的信息^[46]。

随着人们对天然抗体亲和力成熟分子基础认知的不断加深，以及突变技术应用于抗体亲和力体外成熟实践的积累，抗体基因体外突变技术将日趋发展成熟，成为更为有效的抗体体外定向进化手段。