芽变在果树上普遍存在, 芽变选种是果树育种的重要方法之一。葡萄的种植历史悠久, 种质资源丰富, 品种繁多, 在其推广和传播过程中易产生芽变, 为鉴别变异的真伪, 需要在遗传上进行分析、鉴定。“夏黑”是三倍体无核葡萄, 由日本山梨县果树试验场1968年用“巨峰”和“无核白”杂交所得, 1997年8月获得品种登记^[1]。“夏黑”果粒圆形, 果肉硬脆, 鲜食浓甜爽口, 有浓郁草莓香味, 而且果皮厚, 在运输过程中不易因挤压而破裂。它是我国南方近年来继“巨峰”之后的又一主栽品种。现实生产中发现, “夏黑”容易发生芽变, 如上海奥德农庄于2008年在“夏黑”葡萄园中发现特早熟芽变——“早夏无核”, 于2012年9月27日通过品种认定 (沪农品认果树[2012]第003号)。2011年我们在极早熟葡萄选种过程中, 意外发现了被农户称为“三本提”葡萄上的一个优质芽变“11-06-25”(暂定名), 其成熟期比母本提前约2周, 与“早夏无核”相近, “三本提”葡萄的生物学性状与“夏黑”基本相似 (表 1)。

表1(Table 1)

表1 “三本提”“11-06-25”“早夏无核”“夏黑”的果实品质性状 Table 1 Fruit quality traits of "Summer Black", "Zaoxia Wuhe", "Sanbenti" and "11-06-25"

表1 “三本提”“11-06-25”“早夏无核”“夏黑”的果实品质性状 Table 1 Fruit quality traits of "Summer Black", "Zaoxia Wuhe", "Sanbenti" and "11-06-25" 品种或品系 Cultivar or strain 成熟采收时间 Harvesting time 色泽 Color (CIRG) w(花青苷) Anthocyanin content/ (mg/g) m(单粒) Single berry mass/ g m(单穗) One spike mass/ g 可溶性固形物 Total soluble solid/ % 硬度 Hardness/ N w(总香气物质) Total aroma content/ (μg/kg) “三本提” “Sanbenti” 2015-07-29 5.78 0.12 6.57 787.93 15.7 3.74 4 826.13 “11-06-25” 2015-07-17 7.63 0.70 7.05 952.27 17.0 3.73 5 231.26 “早夏无核” “Zaoxia Wuhe” 2015-07-17 8.01 0.57 8.24 488.40 13.4 3.98 3 715.99 “夏黑” “Summer Black” 2015-07-27 7.73 0.45 6.65 429.39 18.5 3.83 4 028.19

点击放大

传统品种鉴定常用的方法是根据形态特征进行, 因而会受到很多因素的限制, 比如不同的组织类别、发育阶段的形态特征、栽培条件等因素。DNA分子标记技术的发展, 使葡萄品种鉴定的困难迎刃而解。目前常用于葡萄品种鉴定的分子标记有限制性片段长度多态性、随机扩增片段长度多态性、简单重复序列、扩增片段长度多态性、单核苷酸多态性等^[2]。其中简单重复序列 (simple sequence repeat, SSR) 分子标记以其高度的多态性、孟德尔共显性遗传模式 (可以区别纯合显性个体和杂合显性个体)、引物的公开性和易获得性、实验重复性高等优点, 已得到广泛应用^[3]。本研究选用35对国际通用的SSR荧光标记引物对8份葡萄试验材料的基因组DNA进行扩增, 并利用毛细管电泳技术对扩增产物进行分离, 从分子水平上研究这些品种 (系) 间的亲缘关系, 以便确定“11-06-25”是否为可遗传的变异, 从而为葡萄遗传育种、种质资源管理及品种保护提供科学依据。

试验材料共8份, 包括欧亚种葡萄 (Vitis vinifera L.)2份：“红亚历山大”“紫苑”; 欧美杂交种 (V. vinifera L.×V. labrusca L.)6份：“三本提”“11-06-25”“早夏无核”“夏黑”“阳光玫瑰”“巨峰”。其中“三本提”“11-06-25”“早夏无核”“夏黑”的叶片于2015年5月上旬采集自江苏常州某葡萄果园, 它们均栽培于同一环境中, 采用相同的栽培措施, 并在盛花后1~3 d内用相同质量浓度的50 mg/L GA₃和5 mg/L N-(2-氯-4-吡啶基)-N′-苯基脲作为植物生长调节剂来处理花穗。“阳光玫瑰”“红亚历山大”“巨峰”“紫苑”的叶片采集自浙江杭州经济葡萄园。样品基本信息见表 2。幼嫩叶片采下后立即使用液氮冷冻保存直至运回实验室提取基因组DNA。

表2(Table 2)

表2 试验材料信息 Table 2 Information of accessions studied in this research

表2 试验材料信息 Table 2 Information of accessions studied in this research 品种或品系 Cultivar or strain 倍性 Ploidy 亲本 Parent 育成年份 Bred year “三本提” “Sanbenti” 3x 未知 Unknown 未知 Unknown “11-06-25” 3x “三本提” “Sanbenti” “早夏无核” “Zaoxia Wuhe” 3x “夏黑” “Summer Black” 2012 “夏黑” “Summer Black” 3x “巨峰”ד无核白”[1] “Kyoho”דThompson Seedless”[1] 1997 “阳光玫瑰” “Shine-Muscat” 2x “安芸津21号”ד白南”[4] “Akitsu-21”דHakunan”[4] 1997 “红亚历山大” “Muscat of Red Alexandria” 2x “亚历山大”[5] “Muscat of Alexandria”[5] 2006 “巨峰” “Kyoho” 4x “石原早生”ד森田尼”[6] “Ohtama Campbell”דCentenial”[6] 1937 “紫苑” “Shien” 2x “红三尺”ד赤岭” “Benisanshaku”דSekirei” 未知Unknown

点击放大

采用改良的CTAB法提取植物叶片组织的基因组DNA^[7], 其中使用CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化铵) 提取DNA之前的步骤参考李金璐等^[8]的方法：在研磨好的样品中加入预冷的缓冲液A, 缓冲液A由0.1 mol/L (pH 8.0) Tris·HCl、5 mmol/L EDTA-Na₂、0.25 mol/L NaCl和2% PVP (polyvinyl pyrrolidone, 聚乙烯吡咯烷酮) 组成, 混匀后冰浴15 min, 冰浴过程中颠倒混匀2~3次, 然后4 ℃ 12 000 r/min，离心10 min并弃去上清液, 重复冰浴和离心的步骤, 直至上清液不黏稠后再加入CTAB进行下一步的提取。最后用标准DNA作为标记对基因组DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测确定其质量和数量, 再将DNA的质量浓度稀释到30 ng/μL备用。

选用在品种鉴定或亲缘关系研究中常用的SSR引物35对 (表 3)。采用TP-M13-SSR荧光标记的方法检测PCR产物的有无及条带大小^[9]。用3条引物进行PCR扩增。第1条引物是在普通的SSR引物的正向引物5′端加上M13序列, 成为TP-M13引物; 第2条引物为普通的SSR反向引物; 第3条引物是5′端带有荧光标记的M13引物, 分别标识4种颜色, FAM (蓝)、HEX (绿)、NED (黄) 和PET (红), 由美国ABI公司合成。TP-M13-SSR引物由上海华津生物科技有限公司合成。

表3(Table 3)

表3 SSR引物序列信息 Table 3 Information of SSR primer sequences

表3 SSR引物序列信息 Table 3 Information of SSR primer sequences 引物名称 Name of primer 正向引物 (5′→3′) Forward primer sequence (5′→3′) 反向引物 (5′→3′) Reverse primer sequence (5′→3′) 参考文献 Reference SCU04 M13-TGTCCTCTTTCCCTCTCCCAAC CAGTCTGTCATCTGACCATGTAGCC [10] SCU06 M13-CCTAATGCCAGGAAGGTTGC CCCTAGTCTCTCTACCTATCCATG [10] SCU11 M13-AATTGATAGTGCCACGTTCTCGCC AACGCCGACAAGAATCCCAAGG [10] VrZAG7 M13-GTGGTAGTGGGTGTGAACGGAGTGG AACAGCATGACATCCACCTCAACGG [11] VrZAG15 M13-GGATTTTGGCTGTAGTTTTGTGAAG ATCTCAAGCTGGGCTGTATTACAAT [11] VrZAG21 M13-TCATTCACTCACTGCATTCATCGGC GGGGCTACTCCAAAGTCAGTTCTTG [11] VrZAG25 M13-CTCCACTTCACATCACATGGCATGC CGGCCAACATTTACTCATCTCTCCC [11] VrZAG30 M13-TGGTAAACCTAGAAAAATTCATCAA CATATGACCATGTCACTAAATTAAT [11] VrZAG47 M13-GGTCTGAATACATCCGTAAGTATAT ACGGTGTGCTCTCATTGTCATTGAC [11] VrZAG62 M13-GGTGAAATGGGCACCGAACACACGC CCATGTCTCTCCTCAGCTTCTCAGC [11] VrZAG64 M13-TATGAAAGAAACCCAACGCGGCACG TGCAATGTGGTCAGCCTTTGATGGG [11] VrZAG79 M13-AGATTGTGGAGGAGGGAACAAACCG TGCCCCCATTTTCAAACTCCCTTCC [11] VrZAG93 M13-TATGGAGGGACCGAGGTGGGCTAGG GCACTCTTCGACGTTAAACAAAGCC [11] VVS4 M13-CCATCAGTGATAAAACCTAATGCC CCCACCTTGCCCTTAGATGTTA [3] VMC1b11 M13-CTTTGAAAATTCCTTCCGGGTT TATTCAAAGCCACCCGTTCTCT [12] VMC4A1 M13-ATGCGACCTTAATAAATTGGGAA AAGCTAGGCTTGTATGAGGGAGA [13] VMC4F3 M13-AAAGCACTATGGTGGGTGTAAA TAACCAATACATGCATCAAGGA [13] VMC6f1 M13-AAGGAGGAGTTGAGATGTAGTA GAGTAAGAGAGAAGCAAGAAAA [14] VMC9A2.1 M13-AGCTCGGCTAGCTGCAAAATC ACCCTTCCCTCTTCAAAACCC [15] VVMD5 M13-CTAGAGCTACGCCAATCCAA TATACCAAAAATCATATTCCTAAA [16] VVMD7 M13-AGAGTTGCGGAGAACAGGAT CGAACCTTCACACGCTTGAT [16] VVMD21 M13-GGTTGTCTATGGAGTTGATGTTGC GCTTCAGTAAAAAGGGATTGCG [17] VVMD24 M13-GTGGATGATGGAGTAGTCACGC GATTTTAGGTTCATGTTGGTGAAGG [17] VVMD25 M13-TTCCGTTAAAGCAAAAGAAAAAGG TTGGATTTGAAATTTATTGAGGGG [17] VVMD27 M13-GTACCAGATCTGAATACATCCGTAAGT ACGGGTATAGAGCAAACGGTGT [17] VVMD31 M13-CAGTGGTTTTTCTTAAAGTTTCAAGG CTCTGTGAAAGAGGAAGAGACGC [17] VVMD32 M13-TATGATTTTTTAGGGGGGTGAGG GGAAAGATGGGATGACTCGC [17] VVIb01 M13-TGACCCTCGACCTTAAAATCTT TGGTGAGTGCAATGATAGTAGA [18] VVIh54 M13-CCGCACTTGTGTTGAATTTCAG CAAACCGTTTTTACACCAGCAG [18] VVIn16 M13-ACCTCTATAAGATCCTAACCTG AAGGGAGTGTGACTGATATTTC [18] VVIn73 M13-TACTTCACCTAACAATACAGCT AATACATAAGGTGAAGATGCCT [18] VVIp31 M13-TATCCAAGAGACAAATTCCCAC TTCTCTTGTTTCCTGCAAATGG [18] VVIp60 M13-GGGGAATAACTAAATTGAGGAT GTATGAATGCGGATAGTTTGTG [18] VVIq52 M13-TAAAAGGATGGTAGATGACAGA ACAGGAAAGTGTTCAATGGTTA [18] VVIv67 M13-TATAACTTCTCATAGGGTTTCC TTGGAGTCCATCAAATTCATCT [18] M13引物序列 (5′→3′) 是TGTAAAACGACGGCCAGT。 The sequence of M13 primer is TGTAAAACGACGGCCAGT (5′→3′).

点击放大

PCR反应体系：10×PCR缓冲液 (含Mg²⁺)2 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL, 5 U/μL rTaq酶0.2 μL, 10 pmol/L TP-M13正向引物0.1 μL, 10 pmol/L反向引物0.5 μL, 带有荧光标记的M13引物0.4 μL, 30 ng/μL模板DNA 2 μL, ddH₂O 20 μL。使用艾本德中国有限公司 (Eppendorf) 的PCR仪进行扩增。扩增程序如下：94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 适温退火45 s, 72 ℃延伸45 s, 循环32次; 94 ℃变性30 s, 53 ℃退火45 s, 72 ℃延伸45 s, 循环8次; 最后72 ℃延伸10 min。

PCR完成后取PCR产物3 μL用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测, 紫外灯下观察扩增效果。取PCR产物3~4 μL进行混样, 再用ABI3700XL全自动基因分析仪进行毛细管电泳检测, 检测工作由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。

所有片段数据由ABI3700XL配套软件GeneMapper ID V3.2自动读取后并输出到Microsoft Excel文件 (含sample file，sample name，panel，size，marker，dye，height) 和PDF文件 (峰型图、片段大小) 中。对35对引物出现的所有片段按大小顺序排列, 每个品种的PCR产物片段大小与其对比, 有该片段大小出现标为1, 否则标为0。为了方便亲缘关系分析, 根据SSR标记产生的二进制数据计算相似系数, 建立相似矩阵, 采用NTSYS-pc V2.10e程序计算遗传距离, 以非加权数据分析法 (UPGMA) 来进行聚类分析, 建立聚类树状图, 分析各自之间的亲缘关系。

采用改良的CTAB法, 8个供试样品DNA的1%琼脂糖凝胶电泳条带清晰。用英国柏楉 (Biochrom) 有限公司的超微量蛋白核酸分析仪BioDrop μLite检测样品DNA质量浓度及纯度, 结果均符合PCR实验的要求。

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示, 扩增条带较清晰。35对SSR引物的毛细管电泳结果均表现出较高的多态性。8份不同样品中共扩增得到135个等位基因, 平均每对引物可扩增得到3.86个等位基因 (表 4)。其中, 引物VVIv67扩增得到7个条带, 而VVS4扩增仅得到1个条带。扩增产物长度介于90~400 bp, 以150~300 bp的扩增片段居多。在扩增出的所有条带中多态性条带有124个, 多态性百分率为91.85%, 供试样品的相似系数在0.49~0.95之间 (图 2)。可见, SSR标记检测葡萄遗传多样性的效率很高, 也表明葡萄的遗传多样性极为丰富。

表4(Table 4)

表4 遗传多样性参数 Table 4 Genetic diversity parameters

表4 遗传多样性参数 Table 4 Genetic diversity parameters 参数 Parameter SSR 引物数 Number of primers used (U) 35 扩增谱带总数 Total number of bands (N) 135 多态性谱带总数 Total number of polymorphic bands (Np) 124 多态性比例 Percent of polymorphic bands (Pi)/% 91.85 平均扩增谱带数 Average number of total bands/primer (N/U) 3.86 平均多态性谱带数 Average number of polymorphic bands/primer (Np/U) 3.60

点击放大

图1(Figure 1)

图1 VrZAG21引物在二倍体 (A、B)、三倍体 (C) 及四倍体 (D) 中的扩增结果 Fig. 1 Electropherograms of VrZAG21 loci in diploid (A, B), triploid (C) and tetraploid (D) cultivars

图2(Figure 2)

图2 UPGMA聚类分析 Fig. 2 Dendrogram of UPGMA cluster analysis

根据毛细管电泳峰图的峰型和每个引物PCR产物片段的大小, 对供试样品的基因型数据进行判读和整理。图 1所示, 二倍体纯合的基因型在毛细管电泳峰图中表现为明显的单峰, 而杂合则表现为双峰; 相应地, 三倍体和四倍体杂合的基因型分别为三峰和四峰。

综合35个位点的SSR数据, 8个葡萄样品的SSR指纹图谱互不相同, 可以为品种鉴别提供依据。“三本提”“11-06-25”“早夏无核”“夏黑”这4个样品在27个位点上表现出完全相同的带型, 在另外8个位点上的带型存在一定的差异 (表 5), 我们可以利用这8个位点的分子信息鉴别“三本提”“11-06-25”“早夏无核”“夏黑”。

表5(Table 5)

表5 8对SSR引物在8份葡萄样品中的扩增结果 Table 5 Amplified results of the 8 grape samples by 8 SSR markers

表5 8对SSR引物在8份葡萄样品中的扩增结果 Table 5 Amplified results of the 8 grape samples by 8 SSR markers 样品Sample SCU04 VrZAG15 VrZAG64 VMC4A1 样品Sample VVMD5 VVMD7 VVIb01 189 191 193 163 167 183 135 153 155 157 175 253 257 283 287 291 295 180 184 194 196 245 247 249 253 255 252 256 258 264 266 270 308 310 314 “三本提” “Sanbenti” 0 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 “11-06-25” 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 “早夏无核” “Zaoxia Wuhe” 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 “夏黑” “Summer Black” 1 1 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 “阳光玫瑰” “Shine-Muscat” 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 “红亚历山大” “Muscat of Red Alexandria” 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 “巨峰” “Kyoho” 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 0 “紫苑” “Shien” 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 条带有无分别用1和0来表示。 The presence and absence of bands are indicated by 1 and 0, respectively.

点击放大

“三本提”和“11-06-25”仅在VrZAG64和VVMD5这2个位点存在差异; “11-06-25”和“早夏无核”的差异表现在VrZAG15、VrZAG64、VMC4A1和VMC9A2.1的4个位点上; “早夏无核”和“夏黑”在6个位点 (SCU04、VrZAG15、VMC4A1、VMC9A2.1、VVMD7和VVIb01) 存在差异; “夏黑”和“三本提”的差异表现在SCU04、VVMD5、VVMD7和VVIb01的4个位点上。

基于SSR数据计算出试验材料的Dice相似系数, 可获得UPGMA聚类图 (图 2)。从聚类图中可以看出, SSR标记在相似系数0.49处将8个样品清楚地分成2大类。第Ⅰ类包含了“紫苑”“红亚历山大”“阳光玫瑰”3个样品, 第Ⅱ类包含“巨峰”“11-06-25”“三本提”“夏黑”“早夏无核”5个样品。

在第Ⅱ聚类枝中, “巨峰”与其他4个样品的相似系数为0.7, 证实了“巨峰”是“夏黑”的杂交亲本之一; “三本提”与“11-06-25”的相似系数最高0.95, 亲缘关系最近, 符合二者间的芽变关系; “三本提”与“夏黑”的相似系数为0.93;“夏黑”与“早夏无核”的相似系数为0.92。“11-06-25”“三本提”“夏黑”“早夏无核”这4个葡萄样品聚类紧密, 相似系数均大于0.92, 表明四者有着非常近的亲缘关系, 它们之间的分化可能是由无性系变异所引起。

芽变 (bud sport) 是体细胞突变的一种, 发生在芽的分生组织细胞中, 当芽萌发长成枝条, 在性状上表现出与原类型不同, 它是果树新品种的重要来源^[19]。芽变大多为基因突变产生的, 其遗传物质发生了改变。SSR标记具有高度的多态性, 在品种和品系鉴定中已广泛应用。早在1996年BOWERS，等^[16]就已利用此技术论述了4个酿酒葡萄品种可能是同一个栽培品种的体细胞变异。近年来, JAHNKE等^[20]也利用SSR标记将“黑比诺”“灰比诺”“白比诺”的克隆系的遗传差异追溯到了它们不同的地理来源; 杜晶晶等^[21]为国家葡萄品种资源圃内保存的80份葡萄种质建立了分子身份证; 李慧等^[22]揭示了“关口葡萄”的品种来源和分类; 尹玲等^[2]成功建立了24个我国近年来新育成葡萄品种的SSR指纹图谱。本研究结果显示SSR标记能有效地鉴别葡萄品种及其芽变品系。明确了“11-06-25”是“三本提”产生的一个芽变, 二者在UPGMA聚类图中的相似系数高达0.95, “11-06-25”改变了35个位点中2个位点的遗传物质。“早夏无核”是“夏黑”产生的一个芽变, 二者的相似系数为0.92, “早夏无核”在35个位点中有6个位点的遗传物质与“夏黑”不同。“11-06-25”与“早夏无核”的生物学性状相似, 但二者的遗传本质存在差异, 即在VrZAG15、VrZAG64、VMC4A1、VMC9A2.1的4个位点上表现出的带型不同, 由此推断“11-06-25”和“早夏无核”是2个不同的葡萄品系。由第Ⅱ聚类枝可知, “三本提”、“11-06-25”、“早夏无核”、“夏黑”与“巨峰”的亲缘关系比较近, 证实了“巨峰”是“夏黑”的亲本之一。本试验也发现, “三本提”与“夏黑”之间存在较近的亲缘关系, 推测“三本提”可能是“夏黑”的一个芽变, 在“夏黑”的推广过程中, 由于“夏黑”是三倍体无核品种, “三倍体”与“三本提”谐音, 在口耳相传时, 某些地方的种植者就将“夏黑”的这个芽变称为“三本提”葡萄。

果树芽变的变异性状多种多样, 有树体比较矮小的短枝型芽变, 有果实的浓红型和大果型芽变, 有果实风味品质的变异, 有果实成熟期、耐贮性的变异, 还有丰产性变异以及适应性、抗逆性等方面的变异。“夏黑”和“三本提”葡萄的成熟期在7月下旬末, “11-06-25”与“早夏无核”成熟期接近 (7月中旬)。本研究在相同栽培条件下的初步结果表明, “11-06-25”除成熟期提前于母本“三本提”外, 在色泽上有明显改善, 与“早夏无核”相近; 但在平均穗质量、可溶性固形物含量和香味方面较“早夏无核”更具优势 (表 1); 特别是具有柠檬味的右旋柠檬烯和具有绿叶清香的青叶醛、己醛在“11-06-25”的果肉中含量比“早夏无核”高; 具有草香并伴有橙花油气息的特征香气物质罗勒烯和具有生酒花香的特征香气物质月桂烯在“三本提”和“早夏无核”的果肉中均没有检测到 (数据未显示)。因此, “三本提”芽变“11-06-25”是一个品质优异的极早熟葡萄品系, 对其进行开发利用可丰富早熟葡萄市场, 具有较高的经济价值。