2. 烟台新药创制山东省实验室, 山东 烟台 264117;
3. 中国科学院上海药物研究所, 上海 201203
2. Shandong Laboratory of Yantai Drug Discovery, Yantai Shandong 264117, China;
3. Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China
肝癌是全球第4大癌症相关死因，其中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占据主导地位[1−2]。在中国，HCC的发病率和死亡率分别居所有恶性肿瘤的第4位和第2位，具有高复发性和转移性，治疗难度大[3]。在多种治疗方法中，中医疗法治疗恶性肿瘤的优势日益凸显[4]。前期研究表明，中药蟾酥可以作为肿瘤治疗的有效药物，但其具体作用成分有待解析。蟾酥是蟾蜍分泌物加工的名贵药材[5]，前期研究表明，蟾酥有效单体成分——蟾毒灵（bufalin）在抗癌领域表现出广阔的应用前景[6]。于是，本研究针对蟾毒灵治疗HCC功效和机制展开研究，在机制上，我们发现其通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路促进细胞凋亡和自噬，进而阻滞细胞周期和细胞增殖。PI3K/AKT信号通路是一种重要的胞内信号通路，可被多种细胞刺激或毒性损伤所激活，并通过磷酸化一系列底物来调控细胞内的多种生物过程[7]。同时，PI3K/AKT信号通路维持细胞的正常功能和稳态，在细胞生长、增殖、代谢和迁移等多个生物过程中发挥着关键作用[8]。PI3K/AKT信号通路的异常激活与多种恶性肿瘤的发生与发展密切相关[9−10]。30%~50% 的HCC病例中，PI3K/AKT信号通路呈现高度激活状态[11]。综上，本研究从药效和药理两方面揭示蟾毒灵抑制肝癌细胞的增殖、迁移、细胞周期的作用及药物机理。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，货号：C11995500BT）购自美国Gibco生物公司；胎牛血清（货号：KC001-01）购自KEL生物技术公司；0. 25% 胰酶（货号：25200072）购自美国Gibco生物公司；蟾毒灵（货号：465-21-4）购自上海源叶生物科技有限公司。1% 的青霉素-链霉素（货号：BL505A）、CCK-8试剂盒（货号：BS350B）、Hoechst 33258（货号：BL804A）、结晶紫染色液（0. 1%）（货号：BL802A）购自Biosharp生物技术有限公司；RNA抽提试剂盒（货号：R6934-01）购自美国Omega Bio-Tek生物公司；反转录试剂盒（货号：AT311-02）、荧光定量检测试剂盒（货号：AQ601）购自北京全式金生物技术股份有限公司；BCA蛋白定量试剂盒（货号：P0012S）购自上海碧云天生物技术有限公司；AKT抗体（货号：9272S）和phospho-AKT抗体（货号：4060P）购自美国Cell Signaling Technology公司，PI3K抗体（货号：67071-1-Ig）和GAPDH抗体（货号：10494-1-AP）购自Proteintech公司；IRDye 680CW山羊抗兔IgG二抗（货号：926-32211）和IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG二抗（货号：926-32210）购自美国LICOR公司。
1.2 细胞和动物人肝癌细胞系HepG2、SK-HEP-1、小鼠肝癌细胞系H22购自武汉普诺赛生命科技有限公司；本研究所选用的雄性KM小鼠购自朋悦实验动物繁育有限公司，SCXK（鲁）20220006，中国济南。实验动物置于SPF动物房，可自由获得干净的食物和水，并检测小鼠状况。饲养期间，每天监测2次动物的健康状态。所有实验程序遵循《实验动物护理和使用指南》，所有实验方案均经滨州医学院烟台校区实验动物伦理委员会批准，SYKX（鲁）20210036。
1.3 仪器Cytek全光谱流式细胞分析仪（型号：Aurora），购自上海厦泰生物科技有限公司；Molecular Devices多功能微孔板读板机（型号：SpectraMax M2），购自美谷分子仪器（上海）有限公司；耐可视倒置荧光显微镜（型号：NIB920-FL），购自宁波永新光学股份有限公司。
1.4 方法 1.4.1 CCK-8细胞活性检测将人肝癌细胞SKHEP-1和HepG2用0. 25% 的胰酶消化，重悬后，将细胞浓度调整至3. 5×104个/mL，每孔吸取100 μL接种至96孔板，放入培养箱中培养，待其完全贴壁后，用不同浓度（0、5、25、100、500、1 000 nmol·L-1）的蟾毒灵（蟾毒灵粉末先用二甲基亚砜溶解为10 mmol· L-1的母液，再用完全培养基稀释至目标浓度）分别处理细胞24 h和48 h后，吸出培养基，每孔加入100 μL CCK-8工作液孵育1 h，在自动酶标仪上检测波长450 nmol·L-1下每孔的吸光度值，并计算其细胞存活率。
| $ \begin{array}{l} \;\;\;\;\;\;\;细胞存活率 = (实验组A值 - 空白A值)/[(空白\\ 对照组A值 - 空白孔值)] \times 100\% \end{array} $ |
取对数生长期的SK-HEP-1和HepG2细胞制成1×105个/mL浓度的单细胞悬液，每孔2 mL接种于六孔板中，于培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，按照空白对照组（普通完全培养基）和给药组（500 nmol·L-1蟾毒灵完全培养基）进行加药处理后，置于培养箱中培养48 h后进行实验。取处理后的各组细胞样本，加入甲醇室温固定10 min，弃去固定液，加入1 mL细胞专用PBS清洗2次，每次3 min，弃去细胞专用PBS。清洗完成后，加入1 mL Hoechst 33258染色液，室温染色5 min。染色完成后，弃去染色液用细胞专用PBS清洗3遍，每次3 min，最后加入1 mL细胞专用PBS。再在荧光显微镜下观察并拍照。
1.4.3 克隆形成实验取对数生长期的SK-HEP-1和HepG2细胞配置成1. 5×103个/mL的单细胞悬液，以每孔2 mL接种到六孔板中，放置于细胞培养箱中，待细胞完全贴壁后，按照空白对照组（普通完全培养基）和给药组（2. 5、5、10 nmol·L-1蟾毒灵完全培养基稀释液）分别进行加药处理，培养7~14 d，每3天更换培养基，培养结束后，加入结晶紫染色，观察细胞集落形成并拍照。
1.4.4 流式细胞术取对数生长期的SK-HEP-1和HepG2细胞配制成1×105个/mL的单细胞悬液，以每孔2 mL接种至六孔板中，置于培养箱中培养至完全贴壁后，按照空白对照组（普通完全培养基）和给药组（500 nmol·L-1蟾毒灵完全培养基）进行加药处理后，继续培养48 h后。胰酶消化处理后，转移至离心管内轻柔吹打至均匀，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，用细胞专用PBS重悬后，分别分装至5个1. 5 mL EP管中，2 000 r·min-1离心5 min后轻轻弃去上清液，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，再加入5 μL膜联蛋白Ⅴ（annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）混匀后，加入5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）混匀。室温避光反应5~15 min。使用Cytek Aurora全光谱流式细胞分析仪检测，激发波长λex=488 nm，发射波长λem= 530 nm。
1.4.5 细胞划痕实验取对数生长期的细胞制成2. 5×104个/mL的单细胞悬液，以每孔2 mL接种于六孔板中，待细胞贴壁后，用200 μL的枪头在孔中划一条痕，再用PBS冲洗后，置于显微镜下拍照，并标记拍照位置，再按照空白对照组（普通完全培养基）和给药组（500 nmol·L-1蟾毒灵完全培养基）分别进行加药处理，分别在12 h和24 h后置于显微镜下于同一位置拍照，观察细胞迁移状况。
1.4.6 蛋白免疫印迹实验取对数生长期的SKHEP-1和HepG2细胞配制成1×105个/mL的单细胞悬液，以每孔2 mL接种至六孔板中，置于培养箱中培养至完全贴壁后，按照空白对照组（普通完全培养基）和给药组（0、50、100、500 nmol·L-1蟾毒灵完全培养基）进行加药处理后，置于细胞培养箱中继续培养24 h，用细胞专用PBS清洗细胞，在冰上充分裂解后，4 ℃条件下，1 000 r·min-1离心5 min，离心后吸取上清，保存于-80 ℃冰箱中备用。用BCA蛋白定量试剂盒定量后，在金属浴中100 ℃加热10 min使蛋白变性，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，每个泳道上样10 μL，恒压条件下电泳，恒流条件下转膜，然后用5% 脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST清洗干净后，分别加入AKT（1∶1 000）、phospho-AKT（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）一抗稀释液，4 ℃摇床过夜孵育，再用TBST清洗干净后加入二抗稀释液室温孵育1 h后，再次使用TBST清洗干净，多模式成像系统曝光检测蛋白表达变化。
1.4.7 RT-qPCR实验取对数生长期的SK-HEP-1和HepG2细胞，使用500 nmol·L-1和1 000 nmol·L-1的蟾毒灵处理24 h后，加入1 mL TRIzol和200 μL氯仿，涡旋混匀静置10 min，12 000 r·min-1离心10 min后收集上层水相液体，加入等体积的异丙醇涡旋混匀，静置10 min后12 000 r·min-1离心10 min。用75% 的无水乙醇清洗沉淀3次，室温风干后加入DEPC水。检测RNA浓度，使用反转录试剂盒进行RNA反转录获得cDNA。使用荧光定量PCR仪进行mRNA水平检测。通过2-△△CT法计算不同基因的mRNA相对表达量。引物设计见 Tab 1。
| Gene | Primer sequence（5'-3'） | Primer length/bp |
| β-Actin-F | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | 21 |
| β-Actin-R | CTCCTTAATGTCACGCACGAT | 21 |
| Beclin-1-F | CCATGCAGGTGAGCTTCGT | 19 |
| Beclin-1-R | GAATCTGCGAGAGACACCATC | 21 |
| SQSTM1-F | GCACCCCAATGTGATCTGC | 19 |
| SQSTM1-R | CGCTACACAAGTCGTAGTCTGG | 22 |
H22小鼠肝癌细胞培养至一定密度后，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，用PBS重悬清洗，再离心，重复2次后，将细胞密度调整至1×107个/mL，按照每只小鼠0. 5 mL的量将细胞悬液注入小鼠腹腔。注射完成后每天关注小鼠腹部变化，2周左右形成大量腹水后，建立荷瘤小鼠实体瘤模型。雄性C57BL/6J小鼠先进行适应性饲养，待腹水形成后，抽取腹水，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，加入PBS重悬，调整细胞浓度为1×107个/mL，按照每只小鼠0. 2 mL的量注射进小鼠右前肢腋下。将接种成功的小鼠随机分为4组，分别为：1）模型组：每天腹腔注射1×PBS，8 mL·kg-1；2）5-氟尿嘧啶（5-Fu）组：每2天腹腔注射1次5-Fu（30 mg·kg-1）；3）低剂量组：每天腹腔注射1次蟾毒灵（0. 8 mg·kg-1）；4）中剂量组：每天腹腔注射1次蟾毒灵（1. 0 mg·kg-1）；5）高剂量组：每天腹腔注射1次蟾毒灵（1. 5 mg·kg-1）。连续给药15 d。给药期间，每天观察小鼠状态和肿瘤生长情况，记录小鼠体质量。给药后第六天开始用游标卡尺每2天测量1次小鼠肿瘤体积。待肿瘤体积达到1 500 mm3前，停止实验，最后1次给药后开始禁食，次日将小鼠脱颈法处死，摘眼球取血，摘取移植瘤，以及心、肝、脾、肺、肾组织，用于后续组织学研究。采用肿瘤体积（mm3）=长度×宽度×（1/2×宽度）的公式计算肿瘤体积。
1.4.9 RNA-seqHepG2细胞使用1 μmol·L-1蟾毒灵处理24 h，收集总RNA，并使用DNA酶I去除基因组DNA。总RNA反转录成cDNA，基于Illumina平台进行PE150双端测序，原始数据经Trim Galore过滤后，STAR软件比对到hg38参考基因组上，DESeq2软件进行差异基因分析（|log2FC|≥1，FDR＜0. 01），并通过GO/KEGG完成功能注释。
1.4.10 统计学方法使用GraphPad Prism 8. 0统计软件对本实验研究数据进行分析。实验数据以 x±s表示；采用单因素方差分析（One-way ANOVA）或t检验进行组间数据比较。检验水准α=0. 05。
2 结果 2.1 不同浓度蟾毒灵对肝癌细胞活力的影响蟾毒灵的化学结构式如 Fig 1A所示。为了探究蟾毒灵对肝癌细胞活率的影响，使用不同浓度的蟾毒灵（0、5、25、100、500、1000 nmol·L-1）处理肝癌细胞24 h和48 h，使用CCK-8实验检测SK-HEP-1和HepG2在不同给药浓度后的细胞活力，如 Fig 1B，1C结果所示，蟾毒灵处理后，细胞存活率随着给药时间增加而明显下降，并且具有明显的药物浓度依赖性。同时，Fig 1D，1E细胞单克隆形成实验结果显示，蟾毒灵可以抑制肝癌细胞的克隆形成能力。
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| Fig 1 The effect of different concentrations of bufalin on the viability of HCC A: The chemical structure of bufalin; B: The effect of different bufalin concentrations on the viability of SK-HEP-1 cells; C: The effect of different bufalin concentrations on the viability of HepG2 cells; D: SK-HEP-1 cells were treated with bufalin, subjected to a colony formation assay, and then stained with crystal violet followed by photography; E: Bufalin-treated HepG2 cells were subjected to a colony formation assay, stained with crystal violet, and photographed. **P< 0. 01 vs Control group. |
为了检测蟾毒灵对肝癌细胞凋亡的影响，使用Hoechst 33258染料和流式细胞术检测细胞凋亡率。如 Fig 2A所示，蟾毒灵处理后细胞内出现较多颗粒状强荧光，而空白对照组大部分都呈弥散荧光，说明给药蟾毒灵后细胞凋亡增加。并且，Fig 2B-2E的Annexin V和PI双染色流式细胞术结果显示，蟾毒灵处理组凋亡细胞比率明显增加。综上，蟾毒灵处理后明显增加肝癌细胞的凋亡水平。
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| Fig 2 The effect of bufalin on cell apoptosis A: SK-HEP-1 and HepG2 cells were stained with Hoechst after bufalin treatment and photographed(×20);B: SK-HEP-1 cells were treated with bufalin, stained with Annexin V and PI, and analyzed by flow cytometry; C: Statistical analysis of the percentage of apoptotic cells based on B; D: HepG2 cells were treated with bufalin, stained with Annexin V and PI, and analyzed by flow cytometry; E: Statistical analysis of the percentage of apoptotic cells based on D. **P< 0. 01 vs control group. |
为了进一步研究蟾毒灵的功能，对细胞周期和迁移能力进行检测。如 Fig 3A所示，蟾毒灵处理SKHEP-1细胞可以明显抑制细胞的迁移能力。进一步，使用流式细胞术检测细胞周期，Fig 3B，3C结果显示，蟾毒灵处理后，G0/G1期细胞比例升高，S期细胞比例降低。上述结果证明蟾毒灵能够影响人肝癌细胞的细胞周期和迁移能力。
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| Fig 3 Bufalin inhibits the migration of hepatocellular carcinoma cells and blocks the cell cycle A: Bufalin treats SK-HEP-1 cells and conducts scratch experiments to detect cell migration; B: Cell cycle distribution was detected by flow cytometry; C: Statistical charts of cell cycle ratios. **P< 0. 01 vs control group. |
为了探究蟾毒灵诱导人肝癌细胞发生凋亡的作用机制，进行RNA-seq实验。HepG2细胞使用1 μmol·L-1蟾毒灵处理24 h后，收集总RNA并反转成cDNA进行高通量测序。Fig 4A的PCA结果显示，蟾毒灵处理后，与对照组相比，基因转录水平发生了明显的改变。使用DESeq2软件对差异基因进行分析，如 Fig 4B ，4C所示，蟾毒灵处理后，2 873个基因明显上调，3 181个基因明显下调（设定阈值：|Fold Change|>2，P值＜0. 01）。进一步，对差异基因进行GO分析，Fig 4D，4E结果显示，自噬信号通路，DNA损伤修复信号通路，蛋白磷酸化信号通路等得到富集。
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| Fig 4 High-throughput sequencing results after bufalin treatment A: HepG2 cells treated with bufalin conducts high-throughput sequencing and generates PCA diagrams; B: Analyze the differences of all gene expressions and generate heat maps; C: Set threshold value: |Fold Change| > 2, P value < 0. 01, a total of 2 873 genes were upregulated and 3 181 genes were downregulated; D and E: GO analysis of the differential genes. |
高通量测序结果提示，蟾毒灵调节细胞自噬和DNA损伤修复，由于PI3K/AKT信号通路在细胞自噬和DNA损伤修复过程中起到重要作用，于是进行Western blot实验检测信号通路蛋白表达变化。如 Fig 5A，5B所示，蟾毒灵明显抑制PI3K/AKT信号通路。qPCR实验结果显示，自噬相关蛋白Beclin1基因水平明显上调，而SQSTM1基因明显下调，见 Fig 5C。进一步，使用自噬抑制剂氯喹（CQ）处理细胞，细胞存活率上升，见 Fig 5D。综上，蟾毒灵能够抑制PI3K/AKT信号通路并激活细胞自噬。
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| Fig 5 Bufalin inhibits PI3K/AKT pathway activation A and B: After different concentrations of bufalin treated SK-HEP-1(A)and HepG2(B), Western blot experiments were carried out to detect PI3K/AKT pathway protein expression; C: qPCR was performed to evaluate Beclin-1 and SQSTM1 mRNA expression; D: CQ rescued bufalin induced cell death. *P< 0. 5, **P< 0. 01 vs control group. |
使用KM小鼠建立荷瘤实验以探究蟾毒灵对肝细胞癌的治疗效果。如 Fig 6A-6G所示，不同剂量的蟾毒灵和阳性药物5-Fu处理荷瘤小鼠，高剂量（1. 5 mg·kg-1）组的蟾毒灵可以明显减缓小鼠肿瘤生长趋势。但对小鼠体质量和脏器没有明显影响。
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| Fig 6 Bufalin inhibits tumor growth in vivo A: Tumor-bearing experiments were conducted using KM mice, which were treated with bufalin at different concentrations and the positive drug 5-fluorouracil(5-Fu). Tumor size was measured and calculated; B-G: Mouse body weight(B), heart(C), liver(D), lung(E), kidney(F), and spleen(G)weights were measured, and the organ-to-body weight ratio was calculated. **P< 0. 01 vs control group. |
为了验证蟾毒灵对脏器是否有损伤，我们对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行了HE组织染色，如 Fig 7所示，蟾毒灵对小鼠的所有脏器没有损伤，提示蟾毒灵安全性良好。
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| Fig 7 HE staining of the respective tissue after treatment of bufalin |
HCC是常见的恶性肿瘤之一，目前仍是威胁全球人民健康的一大隐患，中国更是HCC的高发地区[12]。传统的手术切除和化疗手段对肝癌的治疗效果和预后方面的作用都有限。随着近几年中医的复兴，越来越多的中医疗法在肿瘤治疗中起到了重要作用[13−14]。蟾酥是传统中药，具有解毒消肿、强心止痛的功效，其有效成分蟾毒灵已被证明在多种恶性肿瘤治疗中具有明显作用[15−16]，能够通过多种机制诱导肿瘤细胞凋亡。PI3K/AKT信号通路的过表达常出现在人类恶性肿瘤中，与癌细胞增殖、凋亡、周期、侵袭和转移密切相关[17]。PI3K/AKT信号通路能被激活的癌基因和突变的酪氨酸激酶异常激活，而它持续性激活会促进肿瘤的发展和对抗癌治疗的耐药机制形成，导致肝癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生和发展。因此，PI3K/ AKT信号通路在肿瘤形成的全过程和治疗中发挥重要作用。
本研究中的CCK-8实验和克隆形成实验结果证明蟾毒灵能够抑制肝癌细胞的增殖，Hoechst染色和流式细胞术实验证明蟾毒灵能够促进肝癌细胞的凋亡，划痕试验证明蟾毒灵能够抑制肝癌细胞迁移，又通过小鼠移植瘤模型证明蟾毒灵能够抑制肿瘤的增长，并且对小鼠其他脏器没有毒副作用。体外研究发现PI3K、AKT表达量均下调，提示蟾毒灵可能通过抑制PI3K/AKT信号通路的激活，抑制癌细胞的增殖和侵袭，从而抑制肿瘤的发展。未来研究中，可以通过多靶点药物联用（蟾毒灵和PI3K信号通路抑制剂）加强药物对肿瘤治疗效果，对PI3K抑制剂耐药肿瘤，可以借鉴蟾毒灵处理进行药物治疗。虽然现在对于蟾毒灵没有明确的靶点报道，但是通过CRISPR全基因组文库筛选等方法，寻找蟾毒灵直接作用靶点可能成为研究其具体作用机制的主要方向。另一方面，通过药物化学的优化改造，获得新型结构的分子药物，既可以提高蟾毒灵的药效价值，也可以为临床转化提供新的依据。
综上所述，蟾毒灵能够抑制PI3K/AKT信号通路，从而促进肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞侵袭和迁移能力，进而抑制肿瘤生长。为HCC的治疗提供了新的思路。
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