2. 南昌市第一医院急诊重症医学科，江西 南昌 330006;
3. 南昌大学药学院，江西 南昌 330006
2. Dept of Emergency Intensive Care Medicine, the First Hospital of Nanchang City, Nanchang 330006, China;
3. College of Pharmacy, Nanchang University, Nanchang 330006, China
心肌肥厚是多种心血管疾病从代偿反应过渡到心力衰竭的关键过程，心肌质量增加、蛋白质合成和胎儿型基因的重新表达是心肌肥厚的主要特征[1-2]。心肌肥厚的预防和逆转一直是许多研究者关注的焦点，旨在降低心力衰竭的高发病率和死亡率。许多因素被发现参与心肌肥厚的发病机制，包括钙处理、基因表达、细胞死亡、心脏纤维化、蛋白酶体抑制和血管生成[3-4]。病理性心肌肥厚是高血压、瓣膜病及冠状动脉疾病等共同作用的复杂过程[6-7]。探索调节心肌肥厚的潜在靶点或新方法对心肌肥厚的干预和预防至关重要。SLC26A4，被称为PDS基因，有21个外显子编码包含780个氨基酸的多跨膜蛋白，越来越多的研究发现SLC26A4在甲状腺癌、胃癌等多种疾病中起着至关重要的作用[8]。更重要的是，近期研究发现SLC26A4与高血压相关，SLC26A4突变患者左室肥厚指数明显降低，提示SLC26A4可能参与了心肌肥厚的过程[9]。然而，SLC26A4在心肌肥厚中的作用尚不清楚。因此，在本文的研究中探讨了SLC26A4在心肌肥厚中的作用，以及抑制SLC26A4是否会显著改善心肌肥厚。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器主要试剂：H9c2大鼠心肌细胞系购自浙江赛兰生物科技有限公司，DMEM培养基及胎牛血清（FBS）购自Gibco（Thermo Fisher），苯肾上腺素（PE）购自Sigma-Aldrich，Lipofectamine 3000购自Invitrogen（Thermo Fisher），NC siRNA/SLC26A4 siRNA购自广州锐博生物，腺病毒载体Ad35购自汉恒生物。主要仪器有CO2培养箱（Thermo Scientific），倒置荧光显微镜（Olympus），流式细胞仪（Beckman），共聚焦显微镜（Nikon）等。
1.2 细胞培养和处理将H9c2细胞在DMEM培养基中进行培养，该培养基内含有10% 的胎牛血清、10% 的l-谷氨酰胺、0.5% 的青霉素/链霉素、10%的非必需氨基酸以及10% 的丙酮酸。所需的培养环境包括：37 ℃、5% 的CO2以及饱和的湿度，并且培养基应每隔3 d进行1次更新。将培养至约80% 汇合度的H9c2细胞分为分别为对照组、PE组、NC组、PE+NC组、PE+SiRNA-SLC26A4组和SiRNA-SLC26A4组。对照组不做任何处理；PE组用200 μmol·L-1 PE处理48 h诱导心肌肥厚；NC组上将NC siRNA插入可靶向心肌细胞的腺病毒载体（Ad35），PE+NC组在PE组处理的基础上将NC siRNA插入Ad35，经脂质体试剂（Lipofectamine 3000）转染H9C2细胞24 h；SiRNA-SLC26A4组将SLC26A4 siRNA插入Ad35，用质粒经脂质体试剂转染H9C2细胞24 h，PE+SiRNA-SLC26A4组在PE组处理的基础上将SLC26A4 siRNA插入Ad35，经Lipofectamine 3000转染H9c2细胞24 h。
1.3 免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析免疫荧光检测各组细胞α-SMA的表达。取稳定培养的各组细胞转移至载玻片，采用4% 的多聚甲醛进行15 min的固定，并用0.5% 的Triton X-100在常温条件下进行20 min的渗透处理。在封闭状态下，使用抗α-SMA抗体在4 ℃的温度下进行孵育1夜，然后在d 2，在黑暗环境中使用二抗进行细胞孵育，最后利用DAPI在黑暗环境中进行5 min的染色，以便准确识别细胞核。最终，使用共聚焦荧光显微镜对照片进行了观察。
1.4 实验动物取45只健康雄性SD大鼠购自中国上海实验动物中心，使用许可SYXK（沪）2024-0003，体质量（250±20）g，适应实验环境1周。将大鼠随机分为对照组、心肌肥厚组和siRNA-SLC26A4组（n =15）。对照组大鼠不做任何处理，心肌肥厚组和siRNA-SLC26A4组均建立心肌肥厚模型。大鼠心肌肥厚模型的建立：通过腹腔注射10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，然后在右肋下垂直切开约2 cm的切口，无创分离腹主动脉周围的组织脂肪，取一根无菌线穿过分离好的腹主动脉并结扎，造成约60% 的狭窄。术后行青霉素200 kU·d-1肌内连续注射1周，预防感染。为了研究siRNA-SLC26A4的作用，将siRNA-SLC26A4粉末（5OD）用20 μL dd H2O溶解，siRNA-SLC26A4组大鼠每天尾静脉注射1次siRNA-SLC26A4（2.5 μL），持续7 d。对照组和心肌肥厚组大鼠尾静脉注射等量生理盐水。
1.5 血液样本分析各组动物处理7 d，结束后经腹主动脉采集血液，在3 600 r·min-1离心，10 min，获得血清，收集并保存在-80 ℃下备用。采用ELISA试剂盒检测各组大鼠心肌肥厚标志物心房利钠肽（ANP）、脑利钠肽（BNP）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）水平，评估大鼠心肌肥厚水平。
1.6 苏木精-伊红（HE）染色和心肌细胞各组动物采血后注射过量2% 戊巴比妥钠后处死，取出心脏进行后续实验。为了评估心肌细胞的大小，用4% 多聚甲醛在室温下固定新鲜大鼠心脏24 h。脱水后，蜡浸渍心脏包埋于石蜡中。蜡固化后，将修剪好的蜡块置于石蜡切片机上，切片至4 μmol·L-1厚度，石蜡切片脱蜡。然后苏木精染色细胞核5~10 min，伊红染色细胞质1~3 min，放置脱水封片，脱水后中性胶封片。最后用直立光学显微镜观察染色结果并拍照，将照片放大400倍后使用ImageJ软件对每只大鼠至少50个视图和400个心肌细胞的横截面积进行定量分析。
1.7 RNA提取和RT-qPCR使用TRIzol从细胞或组织中提取总RNA，并对RNA的纯度和浓度进行了测定，接着利用RevertAid第1链cDNA合成试剂盒将这些总RNA逆转录成cDNA。之后，采用SsoAdvance Universal SYBR Green Supermix来进行qPCR的检测工作。BIO-RAD CFX Manager 3.1定量PCR分析软件能够自动计算实验结果。以GAPDH作为内参，采用2-∆∆CT法测定靶基因的相对表达水平。目的基因引物见Tab 1。
| Gene | Primer sequence（5′–3′） |
| SLC26A4 | CATCATGCCTGGCTGGTTCT |
| TGGACACCAACATTCCGTCA | |
| GAPDH | GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT |
| GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG | |
| ANP | GGGCTTCTTCCTCTTCCTG |
| CGCTTCATCGGTCTGCTC | |
| BNP | AAGTCCTAGCCAGTCTCCA |
| GGTCTATCTTCTGCCCAAA | |
| GSK-3β | ACTATGTCAACTCTGGCTATGC |
| TCGGTAAGTGCGAGGAAT | |
| GAPDH | ACTCCCATTCTTCCACCTTTG |
| CCCTGTTGCTGTAGCCATATT | |
| Bcl-2 | GACCTGCTGCTGAGTGAGAA |
| TGTGGTGTTGGCATGTAGGA | |
| Bax | GGCAGAAGATGGAGGAGAGA |
| GCTGCTGAGCAGGTAGAAGA | |
| Caspase-3 | ATGGTGGACGACGACAAGGA |
| TCAGCCACCGACCTGTCTTG | |
| p53 | GAGACAGAGAGCAGCAGCAG |
| GGAGAGAGAGAGGGTGAGGA | |
| LC3 | CGCAGACGAGAAGAAGGTGA |
| CCGCTCTTCAGCACTTTCTC | |
| Beclin-2 | CAGAAGGTGCTGTGTGACCA |
| GCAGACAGGTAGTGGTGGTG-3′（R） | |
| p62 | GACAAGAAGGAGAAGGAGGA |
| CCAGAGCAGCTTCTGCTTCT | |
| GAPDH | ACCACAGTCCATGCCATCAC |
| TCCACCACCCTGTTGCTGTA |
采用Western blot检测心肌肥厚、凋亡和自噬相关蛋白的表达水平。分别在电压90 mV和120 mV条件下进行凝胶电泳，电泳时间分别为30 min和90 min，然后通过电泳印迹转移到PVDF膜。随后，在4 ℃下，用抗Bcl-2、Bax、Caspase-3、p53、LC3、Beclin-2、p62和GAPDH的一抗孵育过夜。薄膜用TBST溶液洗涤后，与二抗在室温下孵育2 h。用TBST溶液洗涤后，最后用ECL试剂通过ChemiDocTMMP系统进行检测，并使用Image LabTM软件进行分析。以GAPDH作为内参。
1.9 流式细胞术检测细胞凋亡流式细胞术检测转染siRNA-SLC26A4后PE诱导心肌细胞凋亡情况。使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，按照制造商的说明分析细胞凋亡。首先制备100 μL细胞悬液，然后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μl碘化丙啶（PI）（20 mg·L-1），室温黑暗孵育15 min。流式细胞术分析细胞凋亡（Beckman，USA）。细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。
1.10 统计学方法GraphPad Prism8.0软件用于进行所有的统计分析工作。数据用x±s表示。通过t检验和单因素方差分析分别对两组和多组进行比较。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 SLC26A4在PE诱导的心肌细胞肥大中的表达免疫荧光和共聚焦显微镜检测结果显示，PE组的细胞相对面积明显高于对照组（P < 0.01），如Fig 1A-1B。RT-qPCR结果显示，PE组细胞中SLC26A4 mRNA的表达高于对照组（P < 0.01），如Fig 1C。
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| Fig 1 Expression of SLC26A4 in PE-induced cardiac hypertrophy A: Morphological changes of H9c2 cells in each group; B: The cell surface area measured by anti-α-SMA staining(green)under fluorescence microscope; C: Relative expression of SLC26A4 mRNA in each group of cells **P < 0.01 vs Control group. |
免疫荧光和共聚焦显微镜进行分析结果显示，与NC组相比，siRNA-SLC26A4组细胞相对面积减小（P < 0.01），PE+NC组的细胞相对面积增加（P < 0.01）；与PE+NC组相比PE+siRNA-SLC26A4组细胞相对面积减小（P < 0.01），如Fig 2A-2B。采用RT-qPCR法进一步检测各组H9c2细胞中SLC26A4的表达发现，与NC组相比，siRNA-SLC26A4组SLC26A4的表达下调（P < 0.01），PE+NC组SLC26A4的表达上调（P < 0.01）；与PE+NC组相比PE+ siRNA-SLC26A4组SLC26A4的表达下调（P < 0.01），如Fig 2C。以上结果提示，抑制SLC26A4可改善PE诱导的心肌肥厚。
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| Fig 2 Inhibition of SLC26A4 regulation of PE-induced cardiac hypertrophy A: Morphological changes of H9c2 cells in each group; B: The cell surface area was measured by anti-α-SMA staining(green)under fluorescence microscope; C: Relative expression of SLC26A4 mRNA in each group of cells. **P < 0.01 vs NC group; ##P < 0.01 vs PE+NC group. |
进一步观察各组细胞中心肌肥厚标志物ANP，BNP和GSK-3β mRNA的表达情况。结果显示，与NC组相比，siRNA-SLC26A4组细胞中ANP和BNP mRNA的表达水平明显下降（P < 0.01），PE+NC组细胞中ANP和BNP mRNA的表达水平显升高（P < 0.01），而PE+siRNA-SLC26A4组细胞中ANP和BNP mRNA的表达水平明显低于PE+NC组（P < 0.01）；此外，与NC组相比，siRNA-SLC26A4组细胞中GSK-3β mRNA的表达水平明显升高（P < 0.01），PE+NC组细胞中GSK-3β mRNA的表达水平明显下降（P < 0.05）；而与PE+NC组相比，PE+siRNA-SLC26A4组细胞中GSK-3β mRNA的表达水平明显升高（P < 0.01），见Fig 3。
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| Fig 3 ANP, BNP and GSK-3β mRNA expression levels in each group **P < 0.01 vs NC group; ##P < 0.01 vs PE+NC group. |
流式细胞术检测结果显示，与NC组相比，siRNA-SLC26A4组的细胞凋亡率明显升高（P < 0.01），PE+NC组的细胞凋亡率明显下降（P < 0.01）；而与PE+NC组相比，PE+siRNA-SLC26A4组的细胞凋亡率明显升高（P < 0.01），见Fig 4。以上结果表明，抑制SLC26A4可促进心肌肥大细胞凋亡。
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| Fig 4 Effect of SLC26A inhibition on apoptosis of hypertrophic cardiomyocytes induced by PE A-D: Flow cytometry detection of the apoptotic rate in each group; E: Comparison of apoptosis rate in each group. **P < 0.01 vs NC group; ##P < 0.01 vs PE+NC group. |
为了进一步观察SLC26A4在细胞自噬中的作用，我们检测了各组细胞中自噬相关标志物beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ和p62的蛋白和mRNA的表达水平。如Fig 5所示，与NC组相比，siRNA-SLC26A4组细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-2的蛋白和mRNA表达增加，p62表达降低，而与PE+NC组相比，PE+siRNA-SLC26A4组的LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-2蛋白和mRNA表达水平下调，p62水平上调（P < 0.01）。因此，在PE诱导的心肌肥厚中，抑制SLC26A4可以减弱细胞自噬。
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| Fig 5 Effect of SLC26A inhibition on autophagy in H9c2 cardiomyocytes with PE-induced hypertrophy A: Representative protein bands of LC3, Beclin-2 and p62;B: Quantitative results of LC3, Beclin-2 and p62 expression; C: mRNA quantitative results of LC3, Beclin-2 and p62 expression. **P < 0.01vs NC group; ##P < 0.01 vs PE+NC group. |
HE染色结果显示，心肌肥厚组大鼠心肌细胞横截面积明显高于对照组，表明模型建立成功。siRNA-SLC26A4组大鼠心肌细胞横截面积明显低于心肌肥厚组（P < 0.01），见Fig 6A-6B。RT-qPCR结果显示，心肌肥厚组大鼠心脏组织中SLC26A4的表达水平明显高于对照组，而siRNA-SLC26A4组大鼠的心脏组织中SLC26A4的表达明显下调（P < 0.01），见Fig 6C。ELISA分析结果显示，心肌肥厚组大鼠血清中ANP和BNP的水平高于对照组，GSK-3β水平低于对照组（P < 0.01）；而siRNA-SLC26A4组大鼠血清中ANP和BNP的水平低于心肌肥厚组，血清GSK-3β水平高于心肌肥厚组心肌肥厚组（P < 0.01），见Fig 6D-6F。
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| Fig 6 Effect of in vivo inhibition of SLC26A4 on cardiac hypertrophy in rats 1:Control; 2:Myocardial hypertrophy; 3:siRNA-SLC26A4. A-B: Cardiac hypertrophy detected by HE staining(×70);C: SLC26A4 mRNA expression levels in myocardial tissue of each group; D-F: Serum ANP, BNP and GSK-3β expression levels in each group. **P < 0.01 vs Control group; ##P < 0.01 vs myocardial hypertrophy group. |
如Fig 7A-7C所示，与对照组相比心肌肥厚组大鼠Bcl-2/Bax蛋白和mRNA表达比值下降（P < 0.01），p53和Caspase-3表达均升高；siRNA-SLC26A4组大鼠心脏组织中Bcl-2/Bax蛋白和mRNA表达高于心肌肥厚组，p53和Caspase-3表达均低于心肌肥厚组（P < 0.01）。如Fig 7D-7F所示，与对照组相比心肌肥厚组大鼠心脏组织中LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-2蛋白和mRNA表达增加（P < 0.01），p62表达降低（P < 0.01），而siRNA-SLC26A4组与心肌肥厚组相比，LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-2蛋白和mRNA水平下调，p62水平上调（P < 0.01）。这表明，在大鼠心肌肥厚模型中，抑制SLC26A4可以促进心肌细胞凋亡并抑制其自噬。
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| Fig 7 Effect of SLC26A4 inhibition on cardiomyocyte apoptosis and autophagy in rats in vivo A: Representative protein bands of Bcl-2, Bax, Caspase-3, and p53;B: Quantitative results of Bcl-2, Bax, Caspase-3 and p53 protein expression; C: Quantitative results of Bcl-2, Bax, Caspase-3 and p53mRNA expression; D: Representative protein bands of LC3, Beclin-2 and p62;E: Quantitative results of LC3, Beclin-2 and p62 expression; F: Quantitative results of LC3, Beclin-2 and p62 mRNA expression. **P < 0.01 vs Control group; ##P < 0.01 vs myocardial hypertrophy group. |
病理性心肌肥厚是机体对长期生物力学压力或容量过载的代偿引起的反应，常见于高血压、心肌梗死和瓣膜疾病患者，是心血管疾病患者死亡的独立风险因素[10]。心肌肥厚的特征是心肌细胞增大，本研究中通过计算心肌细胞的相对表面积来评估肥大情况。通过免疫荧光和共聚焦显微镜观察发现，PE处理的心肌细胞表面积增加，而抑制SLC26A4可明显逆转PE诱导的心肌细胞表面积增加，提示抑制SLC26A4可减轻PE诱导的心肌肥厚。GSK-3β是一种普遍表达的组成型活性丝氨酸/苏氨酸激酶，可磷酸化细胞底物并调节多种细胞功能[11]。越来越多的证据表明GSK-3β是心脏肥厚的重要调节因子，在调节心脏发育中起重要作用[12]。因此，本研究在观察了心肌肥厚标志物ANP和BNP在心肌肥大模型中的表达的同时，检测了也了GSK-3β的表达，发现siRNA-SLC26A4可抑制肥厚心肌细胞中ANP和BNP的表达，促进GSK-3β的积累。本研究通过主动脉结扎建立了心肌肥厚大鼠模型，与对照组相比心肌肥厚大鼠血清中心肌肥厚相关标志物ANP和BNP水平明显上调、GSK-3β明显下调，且心肌肥厚大鼠心肌细胞中SLC26A4的表达明显升高。与体外研究结果相一致，转染了siRNA-SLC26A4后可逆转上述现象，提示体内抑制SLC26A4也可改善大鼠心肌肥厚。上述结果表明，抑制SLC26A4对心肌肥厚具有保护作用，其机制是下调ANP和BNP，上调GSK-3β。
心肌肥厚是一种常见的心血管病理状态，细胞凋亡与自噬在心肌肥厚的发生、发展过程中发挥着重要作用，二者之间存在着复杂的相互关系。在心肌肥厚的病理状态下，适度的自噬激活可以通过清除细胞内的受损细胞器和错误折叠的蛋白质，减轻细胞内的氧化应激和内质网应激，从而抑制细胞凋亡的发生[13]。蛋白质转换的适应是心肌肥厚的关键过程，是蛋白质合成与降解之间的平衡，控制蛋白质降解的主要机制是泛素-蛋白酶体系统，它在许多细胞过程中都发挥重要作用，包括细胞凋亡[14]。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，通常可确保多细胞生物正常的功能和代谢稳态，细胞凋亡参与了包括心肌肥厚在内的许多心血管疾病的进展，促进肥厚心肌细胞的凋亡是治疗心肌肥厚的潜在策略[15]。本研究结果显示，抑制SLC26A4在体内外模型中均可降低心肌肥厚模型中p53和Caspase-3的表达，增加Bcl-2/Bax的表达，说明抑制SLC26A4基因可以通过诱导细胞凋亡来重塑心肌肥大后的心脏结构。
自噬是一个进化保守的过程，这一过程的核心是自噬体的形成，它由一组自噬相关基因控制[16]。以往研究发现，自噬体-溶酶体途径活性的变化对心肌肥厚具有关键的致病作用，正常水平的自噬可保护心肌细胞免受环境刺激，但自噬失衡可导致心肌肥厚[17]。自噬失调已在心肌肥厚中得到证实，提示靶向自噬是治疗心肌肥厚的一种潜在策略。Beclin1和LC3在自噬体的形成中起关键作用，在自噬体形成过程中，胞质LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺偶联生成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ被募集到自噬体膜上降解，随后自噬体与溶酶体融合，因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值是自噬活性的一个标志[18]。此外，越来越多的证据表明p62与自噬过程密切相关，p62通过泛素相关结构域与泛素化蛋白结合，并将其传递给自噬体降解[18]。本研究中检测了体内外各组心肌细胞中自噬标志物Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ和p62的表达情况，结果显示心肌肥厚模型中表现出自噬增强，而抑制SLC26A4可通过下调Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ，上调p62来调节自噬，表明抑制SLC26A4可调节自噬，这可能在抑制SLC26A4对心肌肥厚的保护作用中起关键作用。综上所述，SLC26A4参与心肌肥厚，抑制SLC26A4可减少ANP或BNP的释放，促进GSK-3β的表达。此外，抑制SLC26A4可抑制心肌细胞自噬，诱导心肌细胞凋亡。本研究结果表明，SLC26A4可能成为治疗心肌肥厚的潜在靶点，为心肌肥厚的机制和治疗提供了新的认识。凋亡与自噬在心肌肥厚中的复杂关系，单独靶向凋亡或自噬的治疗方法可能存在一定的局限性。因此，联合应用凋亡诱导剂和自噬调节剂可能会提高心肌肥厚治疗的效果。
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