2. 暨南大学附属江门中医院药学部，广东 江门 529000
2. Dept of Pharmacy, Affiliated Jiangmen TCM Hospital of Ji′nan University, Jiangmen Guangdong 529000, China
非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)危害人类健康，以铂类药物为主的化疗仍然是NSCLC治疗的一线药物[1]。但化疗药物和靶向药物都不可避免地会产生耐药性，导致其疗效下降[2]。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)是哺乳动物细胞中至关重要的抗氧化信号因子。Nrf2在肿瘤的发生、发展、预防和治疗中具有重要而复杂的双重作用：一方面，它可以保护正常细胞，降低氧化损伤和肿瘤发生的风险；另一方面，它可以有利于肿瘤细胞存活，刺激其发生增殖和产生化疗耐药性[3]。研究证实，肿瘤细胞中Nrf2的高表达或Kelch样Ech相关蛋白1(Kelch like ECH-associated protein 1，Keap1)基因的突变，会促进肿瘤细胞增殖并产生化疗耐药性[4]。因此，寻找Nrf2抑制剂来逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性正成为人们关注的焦点。
北枳椇(Hovenia dulcis Thunb)为鼠李科枳椇属植物，现代化学和药理学研究表明枳椇属树皮及树干等富含三萜类成分，且该类成分具有抗菌、抗肿瘤等潜在活性。本课题组前期研究发现，从北枳椇当中分离获得的三萜类化合物具有抗肿瘤作用，且能抑制Nrf2的表达[5]。以往研究发现，Nrf2的下游蛋白包括NAD(P)H醌氧化还原酶1[NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1，NQO1][6]、血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)[7]和谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)[8]等，其中GPX4为铁死亡指标性蛋白。铁死亡是一种铁离子催化的坏死性细胞死亡，特点是铁依赖性脂质过氧化[9]。研究发现，癌细胞，尤其是对化疗或靶向治疗具有耐药性的细胞，对铁死亡特别敏感。研究表明，抑制Nrf2的表达在对抗顺铂耐药性方面具有良好效果，但其潜在机制尚不清楚[10]。因此，本研究将对北枳椇总三萜(total triterpenoids from Hovenia dulcis，H-TP)治疗顺铂耐药的NSCLC细胞的作用及机制展开探究，为H-TP作为铁死亡诱导剂在对抗顺铂耐药癌症中的研发提供科学依据。
1 材料 1.1 H-TP的制备北枳椇树干于2020年11月采自湖北省宜昌市，由广东省中医院佘甘树中药师鉴别，样品保存在广州中医药大学第二附属医院，样品编号为202011002。取2 kg北枳椇干燥树干，粉碎后，用95%乙醇(料液比为1∶5)回流提取3次，每次1 h。合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到北枳椇提取物浸膏。将浸膏用水混悬后，上D101大孔树脂柱，用水洗脱，至水澄清后，用80%乙醇-水(8 L)洗脱，收集该部分洗脱液，利用旋转蒸发仪浓缩后，置于-20 ℃冷冻过夜，并冷冻干燥成粉末，得到H-TP。
1.2 细胞株人肺腺癌细胞A549、人肺腺癌顺铂耐药细胞A549/DDP以及乳腺癌细胞MDA-MB-231，均购于武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.3 试剂A549/DDP细胞专用培养基(货号：CM-0519)、Ham′s F-12K培养基(货号：PM150910)，均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清(货号：40131ES76)、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(货号：40302ES)，均购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；CCK-8检测试剂盒(货号：C0039)、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(货号：P1045)、RIPA裂解液(货号：P10013C)，均购自碧云天生物科技公司；SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒(批号：PG110)，购自上海雅酶公司；顺铂(货号：MB1055)、Nrf2抑制剂ML385(货号：MB2620)，均购自大连美仓公司；Nrf2激活剂特丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone，tBHQ，货号：HY-100489)，购自MedChemExpress公司；抗体GADPH、Keap1、Bcl-2、Bax(货号：2118、8047、3498、2772)，均购自Cell Signaling Technology公司；抗体HO-1、NQO1、GPX4(货号：66743-1-Ig、11451-1-AP、67763-1-Ig)，均购自武汉三鹰生物技术有限公司；Nrf2抗体(货号：ab62352)，购自英国Abcam公司。
1.4 仪器Quanteon流式细胞仪(美国ACEA公司)；EonC型全波长酶标仪(美国Bio-Tek公司)；Buchi R-3型旋转蒸发仪(瑞士步琦公司)；GloMax 20/20 luminometer发光检测仪(美国Promega公司)；5430R型高速台式冰冻离心机(德国Eppendorf公司)；Gel Doc XR+凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司)。
2 方法 2.1 抗氧化响应元件(antioxidant response element，ARE)荧光素酶报告基因检测使用ARE荧光素酶报告基因分析Nrf2转录活性。使用稳定转染萤光素酶表达质粒的MDA-MB-231细胞[11]。培养细胞时，使培养基含有浓度为1.5 g·L-1的嘌呤霉素以维持细胞系稳定。所有转染实验均在48孔板进行，取处于对数生长期的细胞，用胰酶将细胞消化，重悬混匀后，每孔0.5 mL等分到48孔培养板中。H-TP的浓度设定为12.5、25、30、50、80、100、120、150 mg·L-1，tBHQ(50 μmol·L-1)作为阳性对照。孵育24 h后，取出培养基，用PBS洗涤细胞。将细胞置于快速振荡器中，用冷PBS将细胞洗涤2次，加入细胞裂解缓冲液，充分震荡20 min以完全裂解。将细胞裂解液与荧光底物以1∶5的比例混合，并将其放置在发光仪器上，测量荧光强度。
2.2 细胞活力检测将细胞以每孔5×103个的密度接种在96孔板中，培养在A549/DDP完全培养基(Ham′s F-12K+10% FBS+1 mg·L-1 DDP+1% P/S)中，置于含5% CO2、37 ℃的培养箱中培养24 h。丢弃培养基，用PBS洗涤细胞。将由1∶10的CCK-8试剂和完全培养基组成的预混合100 μL培养基加入每个孔中。细胞在37 ℃下孵育1 h，用酶标仪测量450 nm处的吸光度(absorbance，A)。使用以下公式计算细胞存活率：细胞存活率=(Atest-Abalnk)/(Acontrol-Ablank)。
2.3 细胞凋亡检测将A549/DDP细胞以每孔5×103个接种在6孔板中，在H-TP、顺铂或联合治疗后，用胰蛋白酶消化细胞，用冷却的PBS洗涤2次。使用Annexin V-FITC和PI进行双重染色，流式细胞仪分析。
2.4 Western blot检测相关蛋白表达收集A549细胞，用冷PBS洗涤。每孔加入50 μL配制好的裂解液，提取细胞总蛋白。取少量总蛋白溶液，BCA蛋白浓度测试试剂盒检测蛋白浓度。用10%的SDS-PAGE凝胶分离蛋白后，转移到PVDF膜上，室温下以5%的脱脂牛奶封闭1 h，一抗在4 ℃孵育过夜，随后使用TBST洗涤3次，每次5 min，使用相应二抗室温孵育1 h，经TBST洗涤3次(每次5 min)后，对条带进行曝光。用ImageJ软件测定蛋白质印迹条带，以GAPDH作为内参，然后将对照组的平均相对值归一化为1，通过与给药组比较得到相关蛋白表达水平。
2.5 统计学方法数据用SPSS 18.0软件进行统计分析。实验数据结果以x±s表示。两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较，首先进行正态性检测，满足正态性的多组间均数比较采用单因素方差分析，LSD检验法适用于方差齐性多组间的两两比较，Dunnett′s T3法则用于分析方差不齐的多组间两两分析。检验水准α=0.05。
3 结果 3.1 H-TP对ARE荧光素酶活性的影响采用稳定转染荧光素酶表达质粒的MDA-MB-231细胞，检测不同浓度的H-TP对ARE荧光素酶的影响。Fig 1结果表明，与空白对照组相比，tBHQ组(阳性对照组)的荧光强度明显增加(P < 0.01)，H-TP浓度为12.5、80 mg·L-1时，其荧光强度与阳性对照组相当。与空白对照组相比，当H-TP浓度高于80 mg·L-1时，ARE荧光强度明显增强(P < 0.01)，表现出Nrf2激活作用；当药物浓度在25~50 mg·L-1时，荧光强度明显降低(P < 0.01)，表现出Nrf2抑制作用。其中，H-TP浓度为30 mg·L-1时Nrf2抑制作用最强。因此，在后续实验中选择的H-TP浓度为30 mg·L-1。
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| Fig 1 Effects of H-TP on ARE-dependent luciferase activity(x±s, n=3) **P < 0.01 vs Control group. |
顺铂对亲本A549细胞的IC50为29.62 μmol·L-1(Fig 2A)，对A549/DDP细胞的IC50是74.20 μmol·L-1(Fig 2B)，其耐药指数(resistance index，RI)为2.51，表明A549/DDP细胞系对顺铂治疗表现出耐药性。单独使用30 mg·L-1[Log(30)≈1.48]时，与空白对照组相比，细胞增殖差异无统计学意义，说明该浓度下药物对A549/DDP细胞没有产生细胞毒性(Fig 2C)。然而，与顺铂联合使用时，大多数组合明显增加了细胞毒性(Fig 2D)，并将IC50从74.20 μmol·L-1降低到47.57 μmol·L-1，说明H-TP与顺铂联合使用能增强顺铂对A549/DDP的敏感性。
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| Fig 2 Effects of H-TP on the drug resistance of A549/A549/DDP cells(x±s, n=3) A: Cisplatin alone acted on A549 cells; B: Cisplatin alone acted on A549/DDP cells; C: H-TP alone acted on A549/DDP cells; D: H-TP (30 mg·L-1) combined with cisplatin at different concentrations acted on A549/DDP cells. |
Western blot结果显示(Fig 3A)，耐药A549/DDP细胞中Nrf2、NQO1的表达水平明显高于A549细胞(P < 0.01)。经过H-TP以及H-TP联合顺铂处理后，A549/DDP细胞中Nrf2及下游HO-1、NQO1表达水平明显下降，而上游基因Keap1的表达水平升高(Fig 3B)。该结果说明，H-TP能够作用于Nrf2信号通路，增加顺铂耐药的A549细胞对顺铂的敏感性。
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| Fig 3 Effects of H-TP on expression levels of Nrf2 and related proteins in the Nrf2 signaling pathway(x±s, n=3) A: Protein expression levels in A549 and A549/DDP cells. **P < 0.01 vs A549 group; B: Protein expression levels in the Nrf2 signaling pathway before and after combination drug treatment; C: Nrf2 protein expression levels after tBHQ modeling; D: Nrf2 protein expression levels after ML385 modeling. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Blank control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs tBHQ or ML385 group. |
为了进一步验证H-TP通过Nrf2靶点发挥顺铂耐药增敏作用，本研究使用Nrf2激动剂tBHQ(5 μmol·L-1)和Nrf2抑制剂ML385(5 μmol·L-1)，通过Western blot进行验证。结果显示(Fig 3C-3D)，与空白组相比，使用tBHQ后Nrf2表达水平明显升高(P < 0.05)，使用H-TP联合顺铂给药处理48 h后，Nrf2的表达明显下降(P < 0.05)。与此同时，使用Nrf2抑制剂的结果显示，与空白组相比，Nrf2抑制剂处理48 h后，Nrf2的表达水平明显下降(P < 0.05)，H-TP联合顺铂给药后，Nrf2表达明显降低(P < 0.01)。结果表明，H-TP能靶向作用于Nrf2，调节Nrf2/HO-1/NQO1信号通路，从而增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。
3.4 H-TP增强A549/DDP细胞铁死亡GPX4是铁死亡的关键调控因子。Western blot结果显示(Fig 4)，给药处理48 h后，A549/DDP细胞中的GPX4表达水平明显下调，说明H-TP能通过抑制关键蛋白GPX4来诱导铁死亡的发生。联合治疗较H-TP单药明显增强了GPX4的下调(P < 0.01)，提示H-TP可协同顺铂促进耐药细胞的铁死亡。
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| Fig 4 Effects of H-TP on expression of GPX4(x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Blank control group; ##P < 0.01 vs H-TP+CIS group. |
前述结果表明，H-TP靶向抑制Nrf2表达水平，以提高顺铂耐药细胞A549/DDP对顺铂的敏感性。进一步使用流式细胞术检测细胞凋亡率，结果显示(Fig 5A)，与空白对照组相比，单独或联合使用H-TP与顺铂后，细胞凋亡率明显增加。使用Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平，结果显示(Fig 5B)，与空白对照组相比，单独或联合使用H-TP与顺铂后，Bax的表达水平明显上调。提示H-TP可以通过抑制Nrf2的表达，促进A549/DDP细胞发生凋亡。
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| Fig 5 Effects of H-TP on apoptosis of A549/DDP cells(x±s, n=3) **P < 0.01 vs Blank control group; ##P < 0.01 vs H-TP+CIS group. |
肿瘤耐药是一个多靶点、多通路调控的复杂过程，与凋亡抑制、药物摄取与外排异常、DNA结构改变等因素相关[12]。顺铂作为NSCLC临床上的一线化疗药物，主要通过诱导肿瘤细胞凋亡、破坏细胞DNA、抑制肿瘤细胞分裂增殖，进而抑制肿瘤发展[13]。实际治疗中，部分NSCLC患者对顺铂产生耐药性，已经成为影响患者预后的重要因素。因此，探寻抗顺铂耐药物质，对增强顺铂治疗NSCLC的疗效，提高NSCLC患者生存率至关重要。
本研究使用ARE荧光素酶报告法检测发现，H-TP对Nrf2的剂量效应呈现U型曲线，在一定浓度区间范围内，对Nrf2基因表现出明显的抑制活性，超出阈值后，对Nrf2基因表现出激活作用。本研究结果显示，当H-TP浓度为30 mg·L-1时，对Nrf2基因具有较强的抑制活性。有研究报道，多酚化合物调控Nrf2信号通路的剂量效应基本呈现倒U型曲线，即低剂量时能够激活Nrf2信号通路，当剂量超过阈值则抑制Nrf2信号通路[14]。Nrf2的调控网络复杂且高度动态，涉及Keap1依赖/非依赖途径、翻译后修饰、表观遗传等多种影响因素[15]。本研究结果呈现H-TP对Nrf2基因具有双向调控作用，可能给该类化合物的开发利用带来新的研究策略。
Nrf2是一种碱性亮氨酸拉链转录因子，通过激活解毒酶、调控抗氧化基因和蛋白的表达来防止氧化损伤[16]。顺铂耐药的肿瘤细胞中，Nrf2的表达常处于异常升高的状态，而GPX4已被确定为Nrf2的转录靶标，其表达可被Nrf2上调[17]。以GPX4为主内源性调节是诱导细胞发生铁死亡最经典的途径，抑制GPX4表达可以促进细胞膜完整性缺失，引发铁死亡[18]。本研究对A549、A549/DDP细胞进行细胞毒性实验，结果表明，当使用H-TP(30 mg·L-1)与顺铂联合使用时，IC50具有较大范围的下降，说明H-TP可较好地逆转A549/DDP顺铂耐药性。进一步使用Western blot法检测A549亲本细胞和耐药细胞中Nrf2蛋白的表达量，结果显示，耐药细胞中Nrf2及其下游靶基因NQO1表达明显升高，经H-TP干预后，耐药细胞中的Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4蛋白表达水平明显降低，说明H-TP可能通过抑制Keap-1/Nrf2/HO-1/GPX4信号通路活性，从而逆转耐药细胞对顺铂的敏感性。进一步通过流式检测凋亡，以及检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达，结果显示，H-TP在增加A549/DDP对顺铂的敏感性后，能明显促进其发生凋亡，从而发挥治疗作用。
综上所述，H-TP与顺铂联用可以抑制A549/DDP细胞中的Nrf2基因，并能调节Nrf2信号通路上相关蛋白的表达，降低铁死亡标志性因子GPX4的表达，从而增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性，诱导细胞发生凋亡。因此，北枳椇中的三萜类化合物具有开发成为逆转NSCLC顺铂耐药新药的潜力。后续可通过分离纯化等方式，探究北枳椇总三萜中抗顺铂耐药的主要药效物质，为NSCLC的临床治疗和新药研究提供新思路。
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