血管内皮细胞(endothelial cell，EC)功能异常是导致血管功能障碍相关疾病的关键因素[1]。血管EC功能障碍表现为炎症增加、代谢紊乱、白细胞/血小板向损伤内皮的黏附、EC损伤与死亡等，这些可能会推动类风湿关节炎、肿瘤、动脉粥样硬化等疾病的发生发展[2-5]。血管EC活性和功能受到多种细胞因子的调控，其中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)起到了非常重要的作用[6]。
TNF-α激动肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)和TNFR2，招募肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor associated factor 2，TRAF2)，激活下游经典或非经典的核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)-AKT等信号通路，调控细胞增殖、存活及血管EC功能[7-8]。本研究利用Cre-loxP技术将Cre重组酶插入小鼠血管EC的Traf2基因起始密码处，通过在基因和蛋白水平对其进行鉴定，构建血管EC特异性Traf2基因敲除小鼠(Traf2flox/flox Tek-iCre+)，为研究TRAF2调控血管EC功能的机制及其在类风湿关节炎、肿瘤、心血管疾病等疾病中的作用提供可靠的实验动物模型。
1 材料 1.1 实验动物Traf2flox/+小鼠和Tek-iCre+小鼠，均购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2023-0009。小鼠均为C57BL/6JGpt，饲养于安徽医科大学临床药理研究所SPF级动物房内，饲养室内的温度保持在(20±2)℃，相对湿度维持在40%~60%，实验动物使用许可证号：SYXK(皖)2020-001。本实验动物饲养和繁育均得到安徽医科大学临床药理研究所实验动物伦理委员会批准(编号：PZ-2022-031，PZ-2022-028)。
1.2 试剂Super Red核酸染料(货号：BS354B)，购自北京兰杰柯科技有限公司；NaOH(货号：A620617-0500)、Traf2-flox和Tek-iCre基因鉴定引物，均购自上海生工生物工程股份有限公司；Tris-HCl(货号：ST780)，购自上海碧云天生物技术公司；β-actin一抗(货号：20536-1-AP)、TRAF2一抗(货号：26846-1-AP)、CD31一抗(货号：28083-1-AP)，均购自美国Proteintech公司；FITC Rat Anti-Mouse CD31流式抗体(货号：558738)，购自美国BD公司；山羊抗鼠IgG荧光二抗(货号：711-546-152)、山羊抗兔IgG荧光二抗(货号：715-606-150)，均购自美国Jackson ImmunoResearch公司；ECL发光试剂盒(货号：BL520B)，购自北京Biosharp公司。
1.3 仪器T100TM台式梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司)；EPS-300型琼脂糖凝胶电泳仪、Tanon-1600全自动数码凝胶图像分析系统、Tanon-5200全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；Pannoramic MIDI Ⅱ组织原位细胞扫描分析系统(匈牙利3DHIESTECH公司)；FACSAria Ⅱ型高端分选流式细胞仪(美国BD公司)；CytoFLEX型十色流式细胞仪(美国Beckman公司)。
2 方法 2.1 Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠的获得根据小鼠Traf2基因的结构，选取Traf2-201转录本(ENSMUST00000028311.12)的外显子3~4(含有178 bp长度的编码序列)作为敲除区域，敲除该区域会导致蛋白质功能的缺失，以此基因编辑技术构建Traf2flox/+小鼠，见Fig 1A。在本研究中，利用CRISPR/Cas9和显微注射技术得到Traf2flox/+小鼠，将Traf2flox/+小鼠进行配繁得到Traf2flox/flox小鼠，再将Traf2flox/flox小鼠与Tek-iCre+小鼠配繁得到Traf2flox/+ Tek-iCre+小鼠，然后将这些小鼠与Traf2flox/flox小鼠再次交配得到子代Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠，即为血管EC特异性敲除Traf2基因小鼠，见Fig 1B。同窝Traf2flox/flox小鼠作为对照组小鼠。
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| Fig 1 Construction and breeding strategy of Traf2flox/flox Tek-iCre+ mice A: Construction strategy; B: Reproductive route. |
待小鼠4周龄左右时，剪0.2 cm左右小鼠尾巴于1.5 mL EP管中，每管加入100 μL NaOH(50 mmol·L-1)，100 ℃金属浴震荡30 min。待冷却后，加入10 μL Tris-HCl(1 mmol·L-1)并充分混匀。12 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液至新的EP管中作为DNA模版，放入4 ℃冰箱备用。
2.2.2 PCR扩增反应Traf2-flox和Tek-iCre的基因鉴定引物序列见Tab 1。PCR体系的构成：12.5 μL(2×)Taq Mix、9.5 μL去离子水、正反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL、DNA模板(100 mg·L-1)1 μL，总体积为25 μL。
| Primer name | Primer No | Sequence (5′→3′) | Band size/bp |
| Traf2-flox | T052267-F1 | TTGAGTTTGGTCCTCTCCACCCAT | WT: 245 |
| T052267-R1 | GGGAGAAAATGAATATGGGTGCATATAC | Targeted: 350 | |
| Tek-iCre | H11-tF3 | GGGCAGTCTGGTACTTCCAAGCT | WT: 0 |
| 000116-Tek-tR1 | CTTGATTCACCAGATGCTGAGGTTA | Targeted: 411 |
Traf2-flox PCR扩增程序为：95 ℃(5 min)→98 ℃(30 s)，65 ℃(30 s，-0.5 ℃/循环)，72 ℃(45 s)，20个循环→98 ℃(30 s)，55 ℃(30 s)，72 ℃(45 s)，15个循环→72 ℃(5 min)，10 ℃(hold)。Tek-iCre PCR扩增程序为：95 ℃(5 min)→98 ℃(30 s)，65 ℃(30 s，-0.5 ℃/循环)，72 ℃(45 s)，20个循环→98 ℃(30 s)，55 ℃(30 s)，72 ℃(45 s)，20个循环→72 ℃(5 min)，10 ℃(hold)。
2.2.4 琼脂糖凝胶电泳取60 mL的1×TAE缓冲液于锥形瓶中，加入1.2 g琼脂糖后充分混匀，放于微波炉中加热沸腾，直到溶液澄清透明。待溶液冷却后，小心加入6 μL核酸染料，迅速摇晃混匀后，倒入制胶架中并及时插入梳子。静置30 min等凝胶凝固后，每孔加入10 μL样品，并在标记孔中加入10 μL marker。140 V、400 mA条件下电泳30 min，置于化学发光凝胶成像分析系统中拍照观察。
2.3 流式细胞术分选小鼠胸主动脉血管原代EC二氧化碳吸入致小鼠安乐死后，在洁净细胞台中无菌分离出小鼠胸主动脉血管，充分剪碎，加入1 mL胶原酶Ⅳ消化液，放于37 ℃摇床消化2 h；将其通过200目筛网过滤、离心，加入含10%胎牛血清的培养基重悬后接种在24孔板培养。将培养扩增后的细胞加入CD31流式抗体孵育，使用高端分选流式细胞仪分选，并通过十色流式细胞仪进行纯度鉴定，将分选得到的血管原代EC继续在24孔板中培养。
2.4 免疫荧光检测小鼠胸主动脉血管EC中TRAF2表达取小鼠胸主动脉血管组织进行固定、石蜡包埋和切片，在脱蜡水化后孵育兔抗小鼠CD31(1 ∶1 000)和鼠抗小鼠TRAF2(1 ∶500)一抗，4 ℃过夜；洗涤3次后，室温下滴加山羊抗兔488荧光二抗和山羊抗鼠647荧光二抗，孵育1 h，洗涤3次，DAPI染色封片后，使用组织原位细胞扫描分析系统拍照记录。
2.5 Western blot检测小鼠胸主动脉血管原代EC中TRAF2蛋白表达提取小鼠胸主动脉血管原代EC总蛋白。制备10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔加入10 μL蛋白样品，电泳、转膜和封闭，最后在条带相应位置滴加TRAF2抗体(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶2 000)，置于冰箱4 ℃孵育过夜；TBST洗脱3遍后，放于5%脱脂牛奶配制的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶10 000)在室温下孵育2 h；孵育完成后TBST洗脱3遍，使用化学发光图像分析系统显影。
2.6 HE染色检测小鼠胸主动脉血管及主要器官病理学形态取小鼠胸主动脉血管及主要器官(心、肝、脾、肺、肾、脑)进行固定、石蜡包埋和切片，在脱蜡水化后，使用苏木精和0.5%伊红染液依次染色；脱水后使用中性树脂封片，风干后使用组织原位细胞扫描分析系统拍照记录。
2.7 基质胶成管实验检测小鼠胸主动脉血管原代EC的成管能力将小鼠胸主动脉血管原代EC按每孔5×104个细胞铺到24孔板中培养8 h左右，待细胞贴壁后，加入TNF-α(20 μg·L-1)处理24 h；用胰酶将各组原代EC消化后，加入DMEM培养基重悬成单细胞悬液(5×106·L-1)。将Matrigel基质胶在4 ℃过夜溶解后，96孔板中每孔加入50 μL，每组3个复孔，共12个孔，放于37 ℃培养箱中凝胶30 min。取原代EC约5×103个(100 μL单细胞悬液)铺在含基质胶的96孔板中，放置在37 ℃培养箱中6 h，在显微镜下每2 h观察并记录成管情况。
2.8 统计学方法实验数据均采用GraphPad Prism 8进行统计分析。实验结果以x±s表示，两组间的差异比较采用未配对的Student′s t检验。检验水准α=0.05。
3 结果 3.1 小鼠基因型鉴定结果以T052267-F1和T052267-R1为引物，PCR扩增后进行凝胶电泳，结果如Fig 2A所示，同时显示出245 bp和350 bp条带的为Traf2flox/+小鼠，仅显示350 bp条带的为Traf2flox/flox小鼠，仅显示245 bp条带的为野生型小鼠。以H11-tF3和000116-Tek-tR1为引物，PCR扩增后进行凝胶电泳，结果如Fig 2B所示，显示出411 bp条带的为Tek-iCre+小鼠，无条带显示的为野生型小鼠。结合Fig 2A和Fig 2B鉴定结果可知：2、5、8、10为Traf2flox/+ Tek-iCre+小鼠，3、4、6、7为Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠，1、9为Tek-iCre+小鼠，11为野生型小鼠。
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| Fig 2 Results of Traf2-flox and Tek-iCre genotyping identification in mice(n=11) A: Identification results of Traf2-flox gene; B: Identification results of Tek-iCre gene. M: DNA marker. 2, 5, 8, 10: Traf2flox/+ Tek-iCre+ mice; 3, 4, 6, 7: Traf2flox/flox Tek-iCre+ mice; 1, 9: Tek-iCre+ mice; 11: Wild-type mice. |
将Traf2flox/flox小鼠和Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠胸主动脉血管无菌分离后，使用胶原酶Ⅳ消化成细胞培养，使用CD31流式抗体进行标记，使用高端分选流式细胞仪分选出血管原代EC，并通过十色流式细胞仪进行纯度鉴定。结果如Fig 3A、3B所示，成功分选出小鼠胸主动脉血管原代EC，其纯度达到90%以上(Fig 3C)。
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| Fig 3 Flow cytometry sorting of primary EC (CD31+ cells) isolated from mouse thoracic aortic vessel and purity identification A: Blank control; B: Sorting plot of CD31+ cell; C: Purity verification plot of CD31+ cell. |
对Traf2flox/flox小鼠和Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠胸主动脉血管进行CD31(红色，血管EC膜上特异性表达的蛋白)和TRAF2(绿色)免疫荧光双染。结果如Fig 4所示，与Traf2flox/flox小鼠相比，Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠胸主动脉血管中TRAF2表达明显降低，表明成功在Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠血管EC上敲除了Traf2基因。
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| Fig 4 Immunofluorescence analysis of TRAF2 expression in mouse thoracic aortic vessel(scale bar: 50 μm) |
Traf2flox/flox小鼠和Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠胸主动脉血管原代EC中TRAF2蛋白表达，结果如Fig 5所示，与Traf2flox/flox小鼠相比，Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠胸主动脉血管原代EC中TRAF2蛋白表达明显降低(P < 0.01)，证实成功敲除Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠血管原代EC中Traf2基因。
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| Fig 5 Western blot analysis of TRAF2 protein expression in primary EC isolated from mouse thoracic aortic vessel(x±s, n=6) **P < 0.01 vs Traf2flox/flox group |
对Traf2flox/flox小鼠和Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠胸主动脉血管及主要器官(心、肝、脾、肺、肾、脑)进行HE染色。结果如Fig 6所示，与Traf2flox/flox小鼠相比，Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠中胸主动脉血管及心、肝、脾、肺、肾、脑的病理学形态无明显变化。
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| Fig 6 Histopathological examination of pathological morphology in mouse thoracic aortic vessel and major organs (heart, liver, spleen, lung, kidney, brain) by HE staining(scale bar: 100 μm) |
将分选出来的小鼠胸主动脉血管原代EC加入TNF-α(20 μg·L-1)处理后，铺在含有基质胶的96孔板中，检测Traf2flox/flox小鼠和Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠中胸主动脉血管原代EC的成管能力。结果如Fig 7所示，与Traf2flox/flox组相比，Traf2flox/flox +TNF-α组小鼠胸主动脉血管原代EC成管能力明显增强；与Traf2flox/flox +TNF-α组相比，Traf2flox/flox Tek-iCre++TNF-α组小鼠胸主动脉血管原代EC成管能力明显下降。提示在小鼠血管EC中特异性敲除Traf2抑制TNF-α调控的血管EC成管功能。
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| Fig 7 Matrigel tube formation assay evaluation of angiogenic capacity of primary ECs isolated from mouse thoracic aortic vessel(×200) **P < 0.01 vs Traf2flox/flox group; ##P < 0.01 vs Traf2flox/flox +TNF-α group. |
利用CRISPR/Cas9技术将两个方向相同的LoxP位点敲入目的基因序列，再通过Cre-LoxP系统选择性地在特定的组织或细胞中敲除目的基因，可以为不同类型疾病的研究提供良好的模型基础，有利于更加深入研究相应基因的功能[9-10]。TNF-α通过激活TNFR1和TNFR2，共同调控NF-κB、PI3K-AKT等信号转导，在调节细胞增殖、活化、凋亡，以及调节免疫和组织保护方面起着十分重要的作用。TRAF2是TNF-α激活下游信号的重要衔接蛋白，该蛋白可直接或间接与TNF受体相互作用，并介导其信号转导。在血管EC中特异性敲除Traf2可能抑制下游NF-κB、PI3K-AKT等信号转导，对血管功能障碍相关疾病的发生发展有着缓解作用。
有研究表明，Traf2基因的全敲除可引起胚胎致死，且可能引起广泛的生理变化。与全身性基因敲除不同，Cre-loxP系统构建特异性Traf2基因敲除可以实现在特定的组织或细胞中敲除目的基因，减少非特异性效应，且不会导致胚胎致死现象，适用范围较广[11-12]。因此，利用Cre-loxP技术将Cre重组酶插入小鼠血管EC的Traf2基因起始密码处，可以构建可靠的血管EC特异性Traf2基因敲除动物模型，对研究TRAF2介导血管病理进程或血管功能障碍相关疾病的作用机制具有重要意义[13]。
本研究首先通过Traf2flox/+小鼠配繁得到Traf2flox/flox小鼠，然后将Traf2flox/flox小鼠与Tek-iCre+小鼠配繁得到Traf2flox/+ Tek-iCre+小鼠，再将其与Traf2flox/flox小鼠配繁得到的子代Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠即为血管EC特异性Traf2基因敲除小鼠。通过PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型，结果表明，小鼠DNA以T052267-F1和T052267-R1为引物仅显示350 bp条带、以H11-tF3和000116-Tek-tR1为引物仅显示411 bp条带，符合基因型要求。Western blot和免疫荧光结果表明，TRAF2在血管EC中被敲除成功。通过流式细胞术成功分选出血管原代EC，并通过基质胶成管实验表明，在小鼠血管EC中特异性敲除Traf2抑制TNF-α调控的血管EC成管功能，提示TRAF2对调控血管EC活性及成管能力有重要作用，为研究类风湿关节炎、肿瘤、心血管疾病等血管功能障碍相关疾病中TRAF2对血管EC的调控机制提供体内实验的基础和平台。通过HE染色表明，Traf2flox/flox Tek-iCre+小鼠的胸主动脉血管及主要器官(心、肝、脾、肺、肾、脑)的病理形态与同窝Traf2flox/flox小鼠相比均无明显差异，说明在血管EC上特异性敲除Traf2不影响小鼠正常生长发育和生理功能。
综上所述，本研究成功构建血管EC特异性Traf2基因敲除小鼠，为进一步探究TRAF2调控血管EC活性与功能的机制及其在血管功能障碍相关疾病中的作用提供了有价值的实验动物模型。
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