2. 山东中医药大学药学院，山东 济南 250355;
3. 山东现代学院，山东 济南 250355;
4. 山东省日照市质量检验检测研究院，山东 日照 276800;
5. 中医药经典理论教育部重点实验室 山东省中医药抗病毒工程研究中心，山东 济南 250355
2. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;
3. Shangdong Xiandai University, Jinan 250355, China;
4. Rizhao Institute of Quality Inspection and Testing, Rizhao Shandong 276800, China;
5. Key Laboratory of Classical Theory of Traditional Chinese Medicine, Ministry of Education, Traditional Chinese Medicine Antivirus Engineering Research Center in Shandong Province, Jinan 250355, China
急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一种发生在人体血液系统中的恶性肿瘤，可发生于人类各个年龄段[1]，发病后常伴有发热、出血、器官损伤等症状[2]。以化学疗法和放射疗法为主流的治疗方案对机体损伤较大，易出现严重不良反应和耐药情况[3]。
在中医理论中，急性白血病被归为“虚劳”、“急劳”、“热劳”等范畴，亦有医家将其命名为血癌、髓毒、淋毒病等[4]。中医药对急性白血病的治疗显现出一定的优势，能够减轻化疗所致的毒副作用，延长患者生存期，防治白血病相关并发症等[3]。黄芩作为临床常用中药，可解热毒、除湿热[5]，黄芩苷是黄芩的主要活性成分之一，研究表明黄芩苷可抑制ALL、淋巴瘤和多发性骨髓瘤细胞系的生长[6]。
热刺激法抗肿瘤利用了肿瘤细胞对热的低耐受性[7]，通过对肿瘤组织适宜加温，引起肿瘤细胞变化[8]，进而杀死肿瘤细胞，并增强机体的抗肿瘤免疫反应[9]。治疗性热疗作为热刺激抗肿瘤方法之一，主要通过诱发高热来治疗肿瘤[10]，通常与其他治疗肿瘤的方法联用[11]。研究表明，中药协同热刺激抗肿瘤可增强药物作用效果、改善患者生活质量等[12]。
网络药理学是一种基于基因组学、蛋白质组学等学科，通过网络拓扑计算分析、聚类分析、网络可视化技术等，全面、深入、系统地研究药物、疾病、靶标等关键因素之间复杂的网络关系，并与体内外实验相结合，进而发现新的药物靶点及探讨作用机制的方法[13]。
本研究以发热作为热刺激条件，基于网络药理学方法，探究黄芩苷联合热刺激对ALL的作用及作用机制，并利用体外实验进行验证，以期为中药与热刺激结合治疗ALL的进一步研究及临床应用提供理论依据和实验基础。
1 材料与方法 1.1 细胞株人急性淋巴细胞白血病细胞Jurkat Clone E6-1(Jurkat)、CCRF-CEM、Hut-78，人B淋巴母细胞HMy2.CIR，均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。Jurkat细胞与CCRF-CEM细胞均分离自患者外周血，为ALL研究中最常见的两种细胞株[14-15]，Hut-78细胞为皮肤淋巴细胞白血病细胞，常用于ALL患病机制研究[16]，3种细胞株均能以稳定的形式传代培养，在ALL研究中具有一定的代表性。HMy2.CIR细胞是经转化的人正常外周血B淋巴母细胞系，生长、传代稳定，可作为ALL研究中的正常对照细胞[17]。
1.2 药物与试剂黄芩苷、盐酸柔红霉素(上海源叶生物科技有限公司，批号：P23S7F21640、J25GS155966)；胎牛血清(以色列BI公司，批号：2244289)；RPMI 1640培养基、PBS缓冲液、青霉素/链霉素溶液(美国Gibco公司，批号：8121680、8122101、2441864)；IMDM培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：8122238)；Cell Counting Kit(CCK-8)(科尤博生物科技有限公司，批号：#42830)；DMSO(北京索莱宝科技有限公司，批号：814O034)；RNA prep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒、SuperReal荧光定量预混试剂(增强版)(天根生化科技(北京)有限公司，批号：DP430、KR116、FP205)。
1.3 仪器HF90型CO2培养箱(上海力申科学仪器有限公司)；CKX41倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；TC20细胞计数仪(Bio-Rad公司)；ST16R高速冷冻离心机(美国赛默飞公司)；Multiskan GO酶标仪(美国赛默飞公司)；NanoDrop One型超微量分光光度计(赛默飞世尔科技有限公司)；XP基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)；CFX Connect型实时荧光定量PCR仪(伯乐生命医学产品有限公司)；IMS-200型制冰机(上海龙跃仪器设备有限公司)。
2 方法 2.1 CCK-8法筛选对ALL细胞热刺激的适宜条件将Jurkat、CCRF-CEM、Hut-78和HMy2.CIR细胞接种于96孔板中，每孔5×104个细胞，对照组培养箱设定为37 ℃，发热实验组培养箱设定为39 ℃、40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃，CO2浓度均为5%，培养时间分别为24 h和48 h。结束后，根据CCK-8试剂盒说明书进行操作及计算，对细胞活力进行评估，即取出96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，再培养4 h，然后通过酶标仪测定波长450 nm下的吸光度(A)。细胞存活率=[(A含药实验孔-A空白对照孔) (A含药对照孔-A空白对照孔)]×100%。
2.2 CCK-8法评价黄芩苷联合热刺激对ALL细胞的抑制作用基于“2.1”项的实验结果，选定培养温度41 ℃、孵育时间24 h为热刺激条件，将Jurkat、CCRF-CEM、Hut-78和HMy2.CIR细胞接种在96孔板中，每孔5×104个细胞，以37 ℃为正常对照温度，以盐酸柔红霉素为阳性对照药，使用CCK-8法检测不同浓度的黄芩苷(0、5、10、20、40、100、150 mg·L-1)对HMy2.CIR细胞毒性以及对Jurkat、CCRF-CEM、Hut-78细胞生长抑制作用。细胞存活率=[(A含药实验孔-A空白对照孔) / (A含药对照孔-A空白对照孔)]×100%。使用Graphpad prism 7.0计算黄芩苷对正常细胞的半数细胞毒性浓度(concentration of cytotoxicity 50%，CC50)及对ALL细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，以此评价药物毒性与药效。
2.3 黄芩苷抗ALL的网络药理学分析 2.3.1 黄芩苷作用靶点及疾病靶点筛选通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得黄芩苷的化学结构式和SMILES，通过SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)、TCMSP(https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、SymMap(http://www.symmap.org/)数据库获取黄芩苷的相关作用靶点。所有靶点信息通过UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)统一标准化，去除重复靶点合并建立黄芩苷靶点数据集。
以“acute lymphoblastic leukemia” “fever”为关键词，种属选择“Homo-sapiens”或“human”，分别在DisGeNET(https://www.disgenet.org)、GeneCards(https://www.genecards.org/)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库收集ALL和发热相关靶点，并删除重复靶点。
2.3.2 网络可视化及关键靶点筛选将黄芩苷及对应靶点导入Cytoscape 3.8.2软件构建黄芩苷-基因靶点的网络图。将黄芩苷靶点数据集和ALL及发热相关靶点分别取交集，获得黄芩苷和ALL、黄芩苷和发热的交集靶点。将交集靶点分别导入String数据库(https://string-db.org/)，选择种属为“Homo sapiens”，最高置信度为0.900，删除游离基因节点，其他参数保持默认设置，得到交集基因之间的蛋白互作关系。通过Cytoscape 3.8.2软件构建蛋白质互作网络(protein-protein interaction networks，PPI)并进行网络拓扑学分析，综合考虑介度中心值(betweenness centrality，BC)、紧密中心值(closeness centrality，CC)、节点连接度(Degree)以对交集靶点进行排序，进而识别并筛选关键靶点。
2.3.3 GO富集分析与KEGG通路分析将“2.3.2”中得到的黄芩苷与ALL、黄芩苷与发热交集靶点分别导入Metascape网站(http://metascape.org/)，进行GO富集分析与KEGG通路分析，设置对象“Human”，个性化分析最小重叠度为3，最低浓缩度为1.5，P值为0.05，并通过Inkscape软件和微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)对结果进行可视化处理。
2.4 体外实验验证通过人类蛋白质图谱查询网站(https://www.proteinatlas.org)的Cell Line项查询Degree值排名前十的关键靶点在ALL细胞株中的表达水平，选取排名靠前且能在ALL细胞株中正常表达的基因作为后续实验的目的基因。通过RT-qPCR检测黄芩苷联合发热刺激对ALL关键靶点mRNA的表达影响。将Jurkat、CCRF-CEM细胞接种在6孔板中，每孔2×106个细胞，并分为正常对照组、单纯热刺激组、药物低浓度组(5 mg·L-1)、药物中浓度组(10 mg·L-1)、药物高浓度组(20 mg·L-1)、阳性药组、药物低浓度+热刺激组、药物中浓度+热刺激组、药物高浓度+热刺激组、阳性药+热刺激组，热刺激组均在41 ℃下培养24 h，其余组均在37 ℃下培养24 h。采用RNA prep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，并通过超微量分光光度计测定RNA纯度与浓度。使用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒反转录成cDNA，随后使用SuperReal荧光定量预混试剂(增强版)试剂盒进行RT-qPCR检测。以SDHA基因作为内参基因，2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司、北京擎科生物科技有限公司设计与合成，目的基因引物序列见Tab 1。
| Primer | Sequence(5′-3′) | Product length/bp |
| TYMS | F：CTTCAGCGAGAACCCAGACCTTTC | |
| R：AGTTGGATGCGGATTGTACCCTTC | 114 | |
| TNF-α | F：ATGTGGCAAGAGATGGGGAA | |
| R：CTCACACCCCACATCTGTCT | 159 | |
| AKT1 | F：GACGGGCACATTAAGATCAC | |
| R：TGAGGATGAGCTCAAAAAGC | 235 | |
| CASP3 | F：GGCGGTTGTAGAAGTTAATAAAGGT | |
| R：TTCCAGAGTCCATTGATTC | 96 |
使用IBM SPSS Statistics 23.0软件进行统计学分析。实验数据以(x±s)表示，组间差异用单因素方差分析法(One-way ANOVA)。检验水准α=0.05。
3 结果 3.1 ALL细胞宜在41 ℃下热刺激24 h使用CCK-8法检测不同温度对Jurkat、CCRF-CEM、Hut-78和HMy2.CIR细胞的抑制作用。结果表明，(39~43) ℃热刺激48 h后，ALL细胞生长抑制明显，存活率大幅下降，不适宜进行后续药物联合干预实验。41 ℃刺激24 h后，3种ALL细胞活力明显下降，且存活率维持在60%~70%之间，正常细胞HMy2.CIR存活率约为87%，明显高于ALL细胞(Fig 1)。故选定41 ℃热刺激ALL细胞24 h作为本实验的适宜发热刺激条件。
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| Fig 1 Cell viability rates of Jurkat, CCRF-CEM, Hut-78 and HMy2.CIR cells under different stimulation conditions(x±s, n=3) A: Cell viability rates of Jurkat cells; B: Cell viability rates of CCRF-CEM cells; C: Cell viability rates of Hut-78 cells; D: Cell viability rates of HMy2.CIR cells. |
使用CCK-8法检测黄芩苷联合热刺激对Jurkat、CCRF-CEM、Hut-78和HMy2.CIR细胞的抑制作用。结果表明，黄芩苷能抑制ALL细胞的增殖，联合发热刺激后对3种ALL细胞的抑制作用明显增强，且对HMy2.CIR细胞的毒性作用降低，表明热刺激与黄芩苷结合后可协同抑制ALL细胞系的生长，并有效减少黄芩苷的细胞毒性(Tab 2, 3)。
| Drug | IC50-Jurkat/μmol·L-1 | IC50-CCRF-CEM/μmol·L-1 | IC50-Hut-78/μmol·L-1 | CC50-HMy2.CIR/μmol·L-1 |
| Baicalin | 60.26 | 30.75 | 140.1 | 30.49 |
| Daunorubicin hydrochloride | 3.97 | 3.24 | 2.15 | 2 |
| Drug | IC50-Jurkat/μmol·L-1 | IC50-CCRF-CEM/μmol·L-1 | IC50-Hut-78/μmol·L-1 | CC50-HMy2.CIR/μmol·L-1 |
| Baicalin | 25.47 | 12.02 | 98.98 | 37.48 |
| Daunorubicin hydrochloride | 3.28 | 3.3 | 4.17 | 3.39 |
通过PubChem数据库得到黄芩苷化学结构式(Fig 2)。利用SwissTargetPrediction、TCMSP、SymMap等数据库，共获得100个黄芩苷潜在作用靶点。利用NCBI、GeneCards和DisGeNET数据库，共获得4 502个ALL相关靶点和7 992个发热相关靶点。
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| Fig 2 Chemical structure of baicalin |
通过Cytoscape 3.8.2软件构建黄芩苷-基因靶点的网络图(Fig 3)。将黄芩苷靶点数据集和ALL及发热相关靶点分别取交集，获得黄芩苷与ALL疾病交集靶点55个，黄芩苷与发热交集靶点77个(Fig 4)。把以上交集靶点分别导入STRING数据库并构建PPI网络，隐藏游离基因节点，最终获得黄芩苷与ALL疾病交集靶点以及黄芩苷与发热交集靶点之间的PPI网络(Fig 5)。利用Cytoscape 3.8.2对交集靶点PPI网络进行分析，综合考虑各靶点的BC、CC、Degree值对交集基因进行排序。结果显示，黄芩苷与ALL疾病的各交集靶点中，排名前10的靶点为TNF、CASP3、EGFR、PTGS2、FGF2、TYMS、IL-2、DNMT1、MAPK14、PIK3CA；黄芩苷与发热交集靶点中，排名前10的为TNF、EGFR、CASP3、PTGS2、IL-2、FGF2、TYMS、CASP8、MAPK14、CASP9。
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| Fig 3 Network of baicalin and gene targets |
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| Fig 4 Venn map of common targets of baicalin and diseases A：Common targets of baicalin and ALL; B：Common targets of baicalin and fever. |
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| Fig 5 PPI network of common targets of baicalin and diseases A: PPI network of common targets of baicalin and ALL; B: PPI network of common targets of baicalin and fever. |
富集分析中，GO代表Gene Ontology，主要包含生物过程(biological process，BP)、细胞组成(cellular com-ponent，CC)和分子功能(molecular function，MF)3大类，可在网络药理学中用以分析生物过程的相关关系[18]。对上述PPI网络的交集靶点进行GO富集分析，结果显示，黄芩苷对ALL与发热关键靶点的富集GO条目分别为1 194个和1 340个，在二者的重合富集GO条目中，BP主要含叶酸、蝶啶的化合物代谢、活性氧代谢过程；CC主要集中在细胞膜微域、膜筏等结构区域；MF则明显与半胱氨酸型内肽酶参与的细胞凋亡过程有关(Fig 6)。
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| Fig 6 GO enrichment analysis of baicalin on key targets of diseases (included BP, CC and MF) A: GO enrichment analysis of baicalin on key targets of ALL; B: GO enrichment analysis of baicalin on key targets of fever. |
为进一步揭示黄芩苷联合热刺激对ALL的作用机制，对上述PPI网络的交集靶点进行KEGG通路分析。图中气泡大小代表该通路中基因富集的程度，气泡不同颜色象征着基因富集的显著性差异。结果显示，黄芩苷与ALL疾病的交集靶点富集在38条KEGG通路中，黄芩苷与发热的交集靶点则富集在28条KEGG通路中，黄芩苷对ALL及发热的关键靶点的前10个富集通路中重合的通路包括细胞凋亡、TNF和IL-17信号通路、C型凝集素受体蛋白通路和氮代谢通路等(Fig 7)。
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| Fig 7 Analysis of KEGG signal pathway of baicalin on key targets of diseases A: Analysis of KEGG signal pathway of baicalin on key targets of ALL; B: Analysis of KEGG signal pathway of baicalin on key targets of fever. |
基于网络药理学分析及人类蛋白质图谱查询网站的Cell Line项查询，选取黄芩苷与ALL交集的4个可表达基因TNF-α、AKT1、TYMS、CASP3作为目的基因。结果显示(Fig 8)，在Jurkat细胞中，与正常对照组相比，单纯阳性药组可明显降低细胞中TYMS的表达量(P < 0.05)，对CASP3、TNF-α的影响不明显；阳性药与热刺激结合后可明显升高CASP3、TNF-α的表达量，对TYMS的影响作用减弱。低、中浓度黄芩苷组关键靶点TNF-α、CASP3的mRNA表达量略有上升；高浓度黄芩苷组的CASP3表达量明显高于正常对照组；单纯热刺激组的TNF-α的表达量明显上升，TYMS相对含量明显下降(P < 0.05)。不同浓度黄芩苷联合热刺激组对Jurkat细胞干预时，与正常对照组相比，TNF-α、CASP3的表达量均明显提高(P < 0.05)；中、高浓度黄芩苷联合热刺激能明显降低细胞中TYMS的表达量(P < 0.05)，但不同浓度组间差异无统计学意义。AKT1的相对表达量在不同给药剂量、不同温度刺激的组间均差异无统计学意义。
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| Fig 8 Effect of baicalin on expression level of ALL-related genes in Jurkat cells(x±s, n=3) A: Relative expression of TNF-α genes in different groups; B: Relative expression of CASP3 genes in different groups; C: Relative expression of TYMS genes in different groups; D: Relative expression of AKT1 genes in different groups. #P < 0.05 vs Normal group. |
结果显示(Fig 9)，在CCRF-CEM细胞中，与正常对照组相比，阳性药组TYMS的mRNA表达量明显下降(P < 0.05)，其他基因的表达量无明显变化；不同浓度黄芩苷对细胞中关键基因的表达量影响较小；单纯热刺激组仅有TNF-α的表达量上升(P < 0.05)。不同浓度黄芩苷联合热刺激干预CCRF-CEM细胞后，细胞中TNF-α、CASP3的表达量明显升高，TYMS的表达量明显降低，并表现出明显的量效关系(P < 0.05)。高浓度黄芩苷结合热刺激组中TNF-α、CASP3和TYMS的表达量变化最为明显。各组AKT1的表达水平未出现确切的量效关系，且组间差异无统计学意义。
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| Fig 9 Effect of baicalin on expression level of ALL-related genes in CCRF-CEM cells(x±s, n=3) A: Relative expression of TNF-α genes in different groups; B: Relative expression of CASP3 genes in different groups; C: Relative expression of TYMS genes in different groups; D: Relative expression of AKT1 genes in different groups. #P < 0.05 vs Normal group. |
急性淋巴细胞白血病是一种在生物学特征和治疗方法上均体现出高度异质性的恶性肿瘤。现代药理学研究发现，黄芩苷可通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞迁移等发挥抗肿瘤作用[19]。临床研究和实验证明，肿瘤细胞耐热性差[7]，中药协同热刺激抗肿瘤可产生良好效果[20]。故本研究旨在对黄芩苷联合发热刺激抗ALL的作用及机制进行探讨。
本研究中，体外实验结果证明，黄芩苷能够有效抑制Jurkat、CCRF-CEM、Hut-78这3种ALL细胞系的增殖，且黄芩苷与热刺激结合后对ALL细胞的抑制作用明显增强，对正常细胞的毒性下降，即表现出减毒增效的协同作用，为临床治疗ALL提供新的思路与参考。为进一步探讨黄芩苷联合热刺激抑制ALL细胞的机制，采用了网络药理学的方法，研究发现黄芩苷在热刺激条件下可能通过调控TNF-α、CASP3、TYMS等基因的表达起到抗ALL作用。这些基因与肿瘤细胞的生长、凋亡等有关。TNF-α能够通过促进炎症反应和调控凋亡途径抑制淋巴瘤的生长与发展[21]。CASP3基因是细胞凋亡过程中的重要标志，激活后可执行细胞由凋亡走向死亡的不可逆过程[22]。TNFR1通路作为TNF-α在人体内的两条相关信号通路之一，可招募CASP8，进而活化CASP3诱导细胞凋亡[23]。此外，研究表明，激活TYMS基因后可增强不受控的细胞增殖，具有潜在的致癌性和促进肿瘤发展作用[24]。通路富集分析中，KEGG通路筛选结果显示，黄芩苷结合热刺激后对ALL疾病的作用集中在TNF、IL-17、细胞凋亡通路等；GO通路富集结果显示，黄芩苷与ALL及热刺激的重合富集通路包括叶酸及蝶啶的化合物代谢、活性氧代谢过程、半胱氨酸型内肽酶参与的细胞凋亡过程等方面。以上结果提示，黄芩苷在结合热刺激后，可能通过影响ALL细胞凋亡过程发挥抗ALL作用。
根据前期网络药理学分析及通路富集分析结果，本研究通过体外实验探究了黄芩苷联合热刺激对ALL细胞中TNF-α、CASP3、TYMS基因的影响。结果表明，以SDHA基因作为参比基因，在41 ℃发热刺激条件下，黄芩苷能明显上调ALL细胞内TNF-α、CASP3表达量，下调TYMS表达量。这些关键靶点的变化表明黄芩苷联合热刺激在ALL细胞中的实际作用与网络药理学提示的抗肿瘤机制在一定程度上相符，即黄芩苷与热刺激共同作用能诱导ALL细胞凋亡，具体机制与半胱氨酸型内肽酶(caspase)家族调控的细胞周期阻滞、细胞结构解体过程以及TNF-α信号通路有关。
综上所述，本研究运用网络药理学方法并结合体外实验验证表明，黄芩苷联合发热刺激后能明显上调ALL细胞内TNF-α、CASP3表达量，下调TYMS表达量，表现出良好的减毒增效的协同作用。这将为后续进一步研究中药联合热刺激治疗白血病提供科学基础及参考，后期将对中药在热刺激条件下对ALL细胞造成损伤的深层次机理进行进一步探讨。
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