2. 南方医科大学附属中西医结合医院，广东 广州 510000;
3. 贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳 550004
2. TCM-Integrated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510000, China;
3. Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China
三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是一种具有高度侵袭性和转移性的乳腺癌亚型[1]，其特征是缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2的表达。传统放化疗对TNBC的治疗效果有限，患者预后较差[2]。中医药治疗TNBC疗效明确[3]，探索中医药治疗TNBC机制及靶点是该领域的重要研究方向。
鳖甲-莪术药对是国医大师刘尚义治疗乳腺癌使用频次最多的常用组合，以该药对为君药的方剂应用于临床40余载[4]，使患者获得较好的生存质量及较长的生存周期。课题组将该药对应用于TNBC，前期研究表明，鳖甲-莪术药对含药血清能抑制TNBC细胞增殖、侵袭和转移，效果优于鳖甲、莪术单味药[4]，其机制与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路相关，但鳖甲-莪术药对抗TNBC的有效成分、靶点及机制尚不明确。
根据张伯礼院士提出的“有效中药组分配伍理论”，借鉴现代药学的研究方法，对药对中有效组分配伍的研究是中药创新研制的新途径。借助网络药理学，可整合多种数据资源信息，将药物研究放在“基因-靶点-疾病-药物”关系网络之中[5]，系统地阐明有效组分配伍的药效物质基础及作用机制[6-7]。基于此，本研究通过网络药理学和分子对接技术分析鳖甲、莪术治疗TNBC的有效活性成分及其关键靶点，获得鳖甲-莪术药对中抗TNBC的有效组分配伍，并通过体外实验验证该配伍组分抗TNBC的作用和机制，以期为鳖甲-莪术药对治疗TNBC提供实验依据，也为开发抗肿瘤新药提供思路和方法。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验细胞人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231，购自上海中乔新舟生物科技有限公司。
1.1.2 实验药品甘氨酸(G8200，北京索莱宝公司)；姜黄素(C400271，上海阿拉丁公司)。
1.1.3 实验试剂DMEM高糖培养基(C119955 00BT，美国Gibco公司)；胎牛血清(04-001-ACS，以色列BI公司)；CCK-8试剂盒(CK04，上海东仁公司)；β-actin rabbit polyclonal antibody、raptor rabbit polyclonal antibody、rabbit anti-LC3B antibody、phospho-ULK1polyclonal antibody、phospho-mTORpolyclonal antibody(10494-1-AP、20874-1-AP、bs-22503R、80218-1-RR、67778-1-Ig，武汉三鹰公司)；anti-ULK1 antibody(ab92547，英国Abcam公司)；EGFR rabbit antibody(R24177，成都正能公司)；HRP goat anti-rabbit IgG(PMK-014-090，武汉普美克公司)；annexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(MA0220，大连美仑公司)；自噬染色试剂盒(C3018S，上海碧云天公司)。
1.1.4 主要实验设备SW-CJ-2FD超净工作台(苏州净化设备有限公司)；Model 310恒温CO2培养箱(美国Thermo公司)；CKX41倒置显微镜(日本Olympus公司)；高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；多功能酶标仪(美国BioTek公司)；ChemiDoc MP凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；MiniVE电泳仪(美国GE公司)。
1.1.5 数据库本草组鉴(HERB，http://drug.ac.cn/)、SwissADME(http://www.Swissadme.ch/)、SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)、OMIM(Online Men-delian Inheritance in Man，https://omim.org/)、Gene-Cards(http://www.genecards.org/)、TTD(TherapeuticTarget Database，http://db.idrblab.net/ttd/)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)、Drug-Bank(https://www.drugbank.ca/)、Uniprot(http://www.uniprot.org/)、String(https://string-db.org/)、DAVID 2021数据库(https://david.ncifcrf.gov/)和RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)。
1.2 方法 1.2.1 鳖甲、莪术活性成分和靶点收集在本草组鉴(HERB，http://drug.ac.cn/)数据库分别输入关键词鳖甲(BIEJIA)，莪术(EZHU)寻找2味中药主要活性成分，同时通过文献收集鳖甲和莪术的化学成分；基于SwissADME(http://www.Swissadme.ch/)对鳖甲、莪术化学成分的吸收度和类药性进行预测。筛选出胃肠吸收度≥3 high的成分、设定类药性结果≥2“yes”的化学成分为潜在活性成分。借助SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)进行活性成分的靶点预测。
1.2.2 TNBC相关靶点收集在OMIM(Online Men-delian Inheritance in Man，https://omim.org/)、Gene-Cards(http://www.genecards.org/)、TTD(TherapeuticTarget Database，http://db.idrblab.net/ttd/)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)和Drug-Bank(https://www.drugbank.ca/)数据库中以“triple-negative breast cancer”为关键词检索TNBC相关疾病靶点。将疾病靶点汇总后去除重复值。
1.2.3 “药物活性成分-靶点”的网络构建及可视化分析借助Draw Venn Diagram(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)对鳖甲、莪术药物靶点和TNBC疾病靶点取交集。在Uniprot(http://www.uniprot.org/)中把有效成分的作用靶点名称转换为标准Genesymbol，选择验证过的和人类基因，用Cytoscape软件作出药物活性成分-靶点基因网络图。
1.2.4 PPI网络的构建及拓扑分析为了筛选核心靶点，使用STRING数据库对鳖甲、莪术活性成分与TNBC的交集靶点进行蛋白质相互作用分析。将交集靶点导入String(https://string-db.org/)的multiple proteins中，其中物种设置为“Homo sapiens”，设定蛋白质相互作用参数的分数值(interaction score)＞0.4，移除网络中的单个节点，构建PPI(protein-protein interaction)网络图。利用Cytoscape 3.9.1软件中CytoNCA功能对PPI网络进行拓扑分析，根据Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC及Network的中位值得到调控疾病的核心靶点。
1.2.5 GO功能富集和KEGG通路分析将关键靶点上传至DAVID 2021数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，以人类为研究对象，使用该数据库中Functional Annotation Tool，进行GO(gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析。以P＜0.05为筛选标准，选出GO分析每个项目中符合条件的前10位，KEGG分析项目中符合条件的前20位，并绘制气泡图以及分类柱状图。
1.2.6 鳖甲、莪术治疗TNBC关键活性成分与核心靶点对接采用分子对接技术验证鳖甲、莪术药对中治疗TNBC的关键活性成分与核心靶点的结合能力。将pubchem中找到的药物成分导入Chem3D软件转化为mol2结构文件。在Uniprot和RCSB PDB数据库中(https://www.rcsb.org/)检索获取相应核心靶点的3D结构。在SYBYL-X 2.1.1软件中找到疾病靶点的活性口袋，并与药物活性成分分子进行批量对接，导出Total Score数值，数值大于7表明有较强烈的对接活性，在3-7之间有较好的对接活性，数值小于3表明有一定的对接活性，该值与靶点与活性成分分子结合稳定性呈正相关。
1.2.7 细胞培养与分组将TNBC细胞系MDA-MB-231用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM完全培养基置于5% CO2、37 ℃恒温细胞培养箱中培养，隔日换液，当细胞生长到80%时可进行消化传代，进行后续实验。依据CCK-8的实验结果，得出不同浓度甘氨酸、姜黄素对MDA-MB-231细胞的IC50，分别为262.42、76.44 mmol·L-1，以1/2的IC50作用于细胞。实验分组为：空白组(Control)、甘氨酸组(Glycine)、姜黄素组(Curcumin)、甘氨酸联合姜黄素组(Glycine+Curcumin)、依维莫司组(Everolimus, mTORC1抑制剂/自噬诱导剂作为阳性对照组)，开展后续实验研究[8]。
1.2.8 CCK-8法检测细胞活力以每孔5×104个细胞的密度接种于96孔板，细胞贴壁后进行药物处理，每组设3个复孔，继续培养24 h，然后加入10 μL CCK-8在37 ℃下孵育1.5 h，用酶标仪在450 nm处测量吸光度值检测各组的A值。
1.2.9 平板克隆实验细胞以每孔1×103个接种于6孔板中，待细胞贴壁后，实验组加入药物干预24 h后，换新培养基放入培养箱。10 d后观察细胞可见克隆形成后，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，晾干拍照，利用ImageJ软件进行分析，计数每孔形成的克隆数。
1.2.10 流式细胞凋亡检测取处于对数生长期内的细胞，计数后，每孔加入3×105个细胞接种于6孔细胞培养板中，将培养板平放于培养箱中培养，待细胞贴壁后实验组加入药物培养24 h。收集细胞，用100 μL的1×Binding buffer重悬细胞，分别加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀细胞，再加入3 μL PI染色，室温避光孵育15 min，最后加入400 μL的1×binding buffer并转移至流式管中，上流式细胞仪进行细胞凋亡率检测，FlowJo软件进行分析。
1.2.11 MDC法观察自噬现象取对数生长期的细胞，以2×104个/孔均匀接种于24孔板中，放置培养箱中孵育过夜，待细胞密度长至约50%时，加药培养24 h后弃去旧培养基，每孔加入200 μL MDC溶液，孵育40 min后弃去染液，Assay Buffer润洗3遍，荧光显微镜下观察自噬小体，利用ImageJ软件进行分析，计算荧光强度。
1.2.12 Western blot实验检测蛋白收集各组细胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min；4 ℃，12 000 r·min-1，离心15 min；按比例加入一定量4×Loading buffer，100 ℃，煮10 min；配制12% SDS-PAGE胶，电泳条件设置为80 V，35 min，120 V，50 min；湿转法转至PVDF膜上，设置为400 mA，30 min；5%脱脂奶粉，常温孵育2 h；一抗4 ℃孵育过夜；TBST洗膜，10 min/次，洗3次；二抗常温孵育50 min；TBST洗膜，10 min/次，洗3次；ECL发光液(A液∶ B液=1 ∶ 1)，进行化学发光，使用ImageJ软件分析条带的灰度值。
1.2.13 统计学分析利用SPSS 26.0统计软件分析，图表绘制采用GraphPad Prism 8.0处理。符合正态分布的计量数据以x ± s表示，组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 鳖甲和莪术活性成分筛选结果将鳖甲-莪术在HERB数据库进行搜索，找到符合类药性原则及具有高胃肠吸收的鳖甲和莪术活性成分共71个。经Swiss Target Prediction数据库筛选出相应作用靶点293个，见中国知网增强出版附加材料1。
2.2 TNBC相关靶点的筛选和韦恩图绘制通过GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank数据库，以“triple-negative breast cancer”为关键词搜寻出TNBC致病基因总计3 938个。基于韦恩图将TNBC相关靶标与鳖甲-莪术药对靶标取交集，获得中药-疾病靶标146个，见Fig 1。
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| Fig 1 Venn diagram of Biejia-Ezhu drug component targets and TNBC disease targets |
将化学成分及对应靶点蛋白名导入Cytoscape 3.9.1软件，构建中药成分-疾病靶标网络，见Fig 2。
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| Fig 2 Schematic diagram of Biejia-Ezhu drug pair components acting on TNBC targets BJ: Bie Jia, EZ: Ezhu. |
将146个共同靶点上传至String数据库，根据交集靶蛋白相互作用关系，生成蛋白相互作用PPI网络图，见Fig 3。
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| Fig 3 Protein-protein interaction (PPI) network of Biejia-Ezhu drugs in treatment of triple-negative breast cancer |
利用Cytoscape 3.9.1软件中的CytoNCA插件计算网络节点，选取鳖甲-莪术药对治疗TNBC的候选靶点，得到核心靶点6个，分别为ESR1、TNF、EGFR、STAT3、HIF1A、PTGS2，见Tab 1。
| Name | Betweenness | Closeness | Degree | Eigenvector | Information | LAC | Network |
| TNF | 138.56 | 0.91 | 39 | 0.24 | 11.37 | 16.56 | 36.53 |
| EGFR | 112.40 | 0.88 | 37 | 0.24 | 11.21 | 17.35 | 34.76 |
| STAT3 | 83.43 | 0.86 | 36 | 0.24 | 11.13 | 17.72 | 33.68 |
| HIF1A | 42.09 | 0.78 | 31 | 0.22 | 10.65 | 17.81 | 27.85 |
| ESR1 | 43.12 | 0.77 | 30 | 0.21 | 10.54 | 17 | 26.06 |
| PTGS2 | 42.09 | 0.75 | 29 | 0.20 | 10.43 | 16.76 | 24.75 |
通过DAVID网站，借助“Functional Annotation Tool”对146个交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。GO分析统计显示，鳖甲-莪术药对治疗TNBC的生物学过程(主要富集在对生物质量的调节，对有机物的反应、对含氧化合物的反应、单体代谢过程、调控细胞信息交流、信号通路调控、对内源性刺激的反应等526个项目)、细胞成分组成(主要富集在细胞质、细胞膜、溶酶体、线粒体、内质网膜等80个项目)及分子信号功能(主要富集在蛋白质结合、ATP结合、酶结合、锌离子结合等111个项目)有明显的调节效应。并绘制GO富集BP、CC、MF图。KEGG富集分析显示，得到113条信号通路，如乳腺癌、自噬、PI3K/AKT信号通路等，见Fig 4, 5。
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| Fig 4 GO pathway enrichment analysis for cellular components, biological processes, molecular function of candidate targets of active components of Biejia and Ezhu |
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| Fig 5 KEGG pathway enrichment analysis of candidate targets of active components of Biejia and Ezhu |
通过对核心靶点与分子对接结果热图的聚类分析发现，核心靶点ESR1(6chz)、TNF(5uui)、EGFR(6TFV)、STAT3(6njs)、HIF1A(5JWP)、PTGS2(5IKR)与鳖甲-莪术药对中活性成分对接结果中评分大于7的占总数的8%，少部分成分与靶点有强烈的结合活性，评分大于3的占总数的87.88%，表示大部分成分和靶点的结合活性较好，提示鳖甲-莪术药对抗TNBC的作用很可能是通过作用于这些核心靶点实现的。将鳖甲中甘氨酸和莪术中姜黄素与EGFR对接结果Total score分别为3.63、8.05，具有稳定的构象，本研究选择鳖甲中甘氨酸和莪术中姜黄素进行相应的验证，见Fig 6。
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| Fig 6 Heatmap of binding energy among active components and target proteins |
甘氨酸、姜黄素与mTORC1(6u62)受体蛋白的对接结果Total score分别为5.63、9.52；与ULK1(4wno)受体蛋白的对接结果Total score分别为3.27、6.45。结果说明其结合构象稳定，甘氨酸-姜黄素共同作用于靶点mTORC1、ULK1，发挥协同抗TNBC的作用，见Fig 7。
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| Fig 7 Molecular docking diagram |
CCK-8结果表明：与空白组比较，甘氨酸120、200、240、300、360 mmol·L-1浓度均可抑制MDA-MB-231细胞增殖，具有浓度依赖性，差异有统计学意义(P＜0.01)；姜黄素25、40、70、80、100 μmol·L-1浓度均可抑制MDA-MB-231细胞增殖，具有浓度依赖性，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，见Fig 8。计算甘氨酸、姜黄素干预MDA-MB-231细胞24 h的IC50分别是262.42、76.44 μmol·L-1。
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| Fig 8 Effect of different concentrations of glycine, and curcumin on cell proliferation activity (x ± s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
与空白组比较，甘氨酸组、姜黄素组、甘氨酸联合姜黄素组、依维莫司组均可降低MDA-MB-231细胞克隆形成，差异均有统计学意义(P＜0.05)。甘氨酸联合姜黄素组较姜黄素组、甘氨酸组和依维莫司组抑制MDA-MB-231细胞克隆形成能力较强，差异有统计学意义(P＜0.05)。以上结果说明，甘氨酸联合姜黄素组抑制MDA-MB-231细胞克隆最佳，见Fig 9。
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| Fig 9 Effect of each group on clone formation of MDA-MB-231 cells (x ± s, n=3) A: Control group; B: Glycine group; C: Curcumin group; D: Glycine combined with curcumin group; E: Everolimus group. *P < 0.05 vs Control group, #P < 0.05 vs Glycine combined with curcumin group. |
与空白组比较，甘氨酸组、姜黄素组、甘氨酸联合姜黄素组、依维莫司组MDA-MB-231细胞凋亡率均增加，差异均有统计学意义(P＜0.01)。甘氨酸联合姜黄素组较甘氨酸组、姜黄素组、依维莫司组凋亡率增高，差异有统计学意义(P＜0.01)。以上结果说明，甘氨酸联合姜黄素组诱导MDA-MB-231凋亡能力最强，见Fig 10。
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| Fig 10 Effect of each group on apoptosis in MDA-MB-231 cells (x ± s, n=3) A: Control group; B: Glycine group; C: Curcumin group; D: Glycine combined with curcumin group; E: Everolimus group. **P < 0.01 vs Control group, ##P < 0.01 vs Glycine combined with curcumin group. |
与空白组比较，甘氨酸组、姜黄素组、甘氨酸联合姜黄素组、依维莫司组自噬小体明显增多，差异有统计学意义(P＜0.05)。甘氨酸联合姜黄素组较甘氨酸组、姜黄素组、依维莫司组自噬小体增多，差异有统计学意义(P＜0.05)。以上结果说明，甘氨酸、姜黄素、甘氨酸联合姜黄素均可促进MDA-MB-231细胞发生自噬，其中以甘氨酸联合姜黄素组效果最佳，见Fig 11。
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| Fig 11 Imaging changes in MDC staining of MDA-MB-231 cells in each group (x ± s, n=3) A: Control group; B: Glycine group; C: Curcumin group; D: Glycine combined with curcumin group; E: Everolimus group. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group, #P < 0.05 vs Glycine combined with curcumin group, scale bar: 100μm. |
与空白组比较，甘氨酸组、姜黄素组、甘氨酸联合姜黄素组、依维莫司组LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。甘氨酸联合姜黄素组较甘氨酸LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。以上结果说明，甘氨酸组、姜黄素组、甘氨酸联合姜黄素组均可诱导MDA-MB-231发生自噬，以甘氨酸联合姜黄素组效果最佳，见Fig 12。
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| Fig 12 Effect of LC3-Ⅱ/ LC3-I protein expression in MDA-MB-231 cells of each group (x ± s, n=3) A: Control group; B: Glycine group; C: Curcumin group; D: Glycine combined with curcumin group; E: Everolimus group. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group, #P < 0.05 vs Glycine combined with curcumin group. |
与空白组比较，甘氨酸组、姜黄素组、甘氨酸联合姜黄素组、依维莫司组mTORC1、p-mTOR、p-ULK1、EGFR蛋白表达水平降低、ULK1蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。甘氨酸联合姜黄素组较甘氨酸组、姜黄素组、依维莫司组mTORC1、p-mTOR、p-ULK1蛋白表达水平下降、ULK1蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。以上结果说明，甘氨酸、姜黄素、甘氨酸联合姜黄素均可通过调控mTORC1/ULK1信号通路促进MDA-MB-231细胞自噬，且以甘氨酸联合姜黄素效果最佳，见Fig 13。
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| Fig 13 Effect of each group on protein expression of mTORC1/ULK 1 pathway in MDA-MB-231 cells (x ± s, n=3) A: Control group; B: Glycine group; C: Curcumin; D: Glycine combined with curcumin group; E: Everolimus group. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Glycine combined with curcumin group. |
研究结果表明，鳖甲-莪术抗肿瘤的主要成分包括甘氨酸、VD、姜黄素、β-榄香烯、莪术二酮等。甘氨酸在鳖甲饮片中含量高达17%，是鳖甲配方颗粒中含量最高的成分，也是鳖甲颗粒的质控指标成分。研究表明，高剂量(400 mmol·L-1)甘氨酸可以通过抑制血管内皮生长发挥抗肿瘤的作用[9]。另一方面，甘氨酸是一种良好的偶联物，与紫杉醇、表柔比星等多种传统化疗药物具有协同抑制肿瘤的作用[10]。莪术中姜黄素具有多靶点抗肿瘤作用，可通过调控细胞增殖、信号通路、转录因子、肿瘤血管形成等发挥抗TNBC的作用[11]。说明鳖甲-莪术药对协同抗TNBC的作用可能的有效组分是甘氨酸-姜黄素。
网络药理学分析结果显示，TNF、EGFR、STAT3、HIF1A、ESR1等是鳖甲-莪术抗TNBC的主要潜在靶点。将146个交集靶点通过DAVID数据库进行GO以及KEGG富集分析发现，治疗TNBC有关的通路主要涉及PI3K/AKT信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、mTOR、自噬信号通路等。结合文献并通过KEGG数据库发现[12-13]，与TNBC进展密切相关的是EGFR/PI3K/AKT/mTOR信号通路，其中mTORC1是调控自噬极具潜力的靶标[14]，mTORC1活化后通过ULK1抑制分解代谢程序，导致自噬抑制，促进肿瘤进展；通过下调mTORC1可以促进自噬，使肿瘤细胞生长受限，控制肿瘤进展[15]。Niklaus等[16]研究表明，mTORC1在TNBC肿瘤组织中异常活化，与TNBC恶性率及不良预后密切相关。Ouyang等[17-18]发现，通过抑制mTORC1，能上调自噬启动蛋白ULK1表达，进而促进自噬发生，控制TNBC的进展，ULK1在TNBC组织样本中显著下调。因此，通过mTORC1/ULK1信号通路促进细胞自噬可抑制TNBC的发展。
通过分子对接分析发现，甘氨酸、姜黄素均与mTORC1、ULK1靶点蛋白对接活性较强，本课题从该通路入手，体外实验验证甘氨酸-姜黄素抗TNBC的作用及机制。结果显示，甘氨酸、姜黄素和甘氨酸联合姜黄素均可抑制TNBC细胞增殖、促进自噬及凋亡，使TNBC细胞中自噬标志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上升，mTORC1(raptor)、p-mTOR、p-ULK1、EGFR表达水平下降，ULK1蛋白的表达水平上升，且甘氨酸联合姜黄素作用明显高于两单药组。表明甘氨酸、姜黄素均可调控mTORC1/ULK1信号通路促进TNBC细胞自噬，且协同应用效果最佳。
综上所述，本研究基于网络药理学，探究了鳖甲-莪术药对治疗TNBC的有效成分、核心靶点及关键机制，并通过体外实验验证了鳖甲-莪术药对有效组分配伍甘氨酸-姜黄素抗TNBC的作用和机制，为通过研究中药多活性成分配伍，开发治疗TNBC新药提供思路和参考依据。
(该文附加材料见中国知网增强出版或本刊官网http://www.zgylxtb.cn该文章“附录”栏下载。)
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